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1、厦门大学医学院教 案 首 页题 目凝集反应、沉淀反应学时4理论课实验实习课教 学对 象2006级临床上课日期2008年6月19日14:30-17:30上课地点生化大楼204目 的 要 求1. 掌握凝集反应的原理、分类及临床应用2. 掌握沉淀反应的原理、分离及临床应用3. 掌握玻片凝集和试管凝集的操作方法；4. 了解玻片凝集和试管凝集的应用；5. 熟悉单向琼脂扩散的操作技术；6. 掌握测定结果的计算方法。重 点 难 点1. 抗体梯度稀释的方法；2. 判断抗体效价的方法。3. 无菌操作技术及静脉采血参 考 资 料1. 医学免疫学(人卫第四版) 陈慰峰主编；2. 医学微生物学(人卫第七版) 李凡主编

2、。习 题 作 业1. 加样时如何防止“跳管”？2. 加细胞抗原时为何从第七管开始依次向前加样？教学内容、过程、方法、手段及时间分配的设计一、 讲解实验室规则及实验分组、实验课考核标准 15分钟二、 讲解凝集反应、沉淀反应的原理、分类、临床应用 30分钟颗粒性抗原，如完整细菌和细胞等与相应抗体在适量电解质存在条件下，形成肉眼可见凝集物，称为凝集反应（agglutination）。凝集反应分为直接和间接两种。直接凝集反应是指颗粒性抗原与相应抗体直接结合而出现凝集。间接凝集反应是将可溶性抗原（或抗体）先吸附于与免疫无关的载体颗粒表面，然后与相应抗体（或抗原）反应而出现凝集。根据吸附抗原或抗体载体不同

3、，分别有不同的名称。如血凝试验、乳胶凝集试验、协同凝集试验等三、 讲解试管凝集反应的原理、操作方法并示教 30分钟试管凝集反应：(90min)原理：试管凝集反应是一种定量试验，常用已知颗粒性抗原来检测未知抗体及其含量。方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量已知抗原悬液，经过一定时间后，观察有无凝集并根据凝集程度，判定待检血清抗体的效价。方法：1.无菌取外周血1ml(无须抗凝)，快速加入7ml生理盐水中混合均匀，1200rpm/min离心10min,弃上清，以生理盐水反复洗涤2次，量取红细胞容积，加适量生理盐水配制成0.5%人红细胞悬液。2.取清洁小试管14支，

4、分两排依次排列于试管架上，并标明管号。各管均加生理盐水0.5ml。 3.分别用1ml吸管吸取1:10稀释抗“A”和抗“B”诊断血清0.5ml 加入第1管中，于管内连续吸吹三次，使血清与生理盐水充分混匀。4.然后吸取0.5ml注入第2管中，再于第2管连续吸吹三次后吸取0.5ml注入第3管，依次类推。稀释到第6管，在第6管吸出0.5ml弃取。自第1管至第6管血清稀释倍数依次为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640，第7管不加血清作为红细胞对照，稀释方法见图1-2-1。5.用2ml吸管吸取上述0.5%人外周血红细胞悬液，从第7管向前依次滴加各管，每管0.5ml。此时血清稀释

5、倍数增加了一倍。 6.将各管振荡混匀，置于室温，1h后观察结果。1 抗体梯度稀释的方法：(20min)2 判定抗体效价的方法：(20min)3 讲解具体的实验方法及分组 (20min)4 学生实验 (30min)二、玻片凝集反应 (40min)讲解ABO血型鉴定的方法，然后分组实验，每人检测自己的血型 (40min)原理：玻片凝集反应是将已知抗体与未知颗粒性抗原物质(如红细胞、细菌、立克次体、钩端螺旋体等)混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。此法属定性试验，方法简便快速，常用已知抗体检测未知抗原。方

6、法：1.消毒耳垂或指尖，针刺取血1-2滴放入装有0.5ml生理盐水试管中混匀，制成血细胞悬液。2.取载玻片1张，分成两格，一格标记为“A”，另一格标记为“B”。“A”侧加抗A血清（含A抗体），“B”侧加抗B血清（含B抗体），各一滴。3.在两侧各加一滴血细胞悬液，混匀，3-5 min后观察结果。三讲解间接凝集反应的原理可溶性抗原或抗体吸附于与免疫无关的微球载体上，形成致敏载体（免疫微球），再与相应抗体或抗原在电解质存在的条件下进行反应，产生凝集，称为间接凝集反应。四、双向琼脂扩散实验 (50min)1. 讲解琼脂板打孔得方法及该实验的操作原理及具体操作步骤 (30min)原理：可溶性抗原与相应抗

7、体在适量电解质存在的情况下，形成肉眼可见沉淀物，称为沉淀反应（precipitation）。参与反应的抗原为沉淀原，抗体为沉淀素。由于抗原多为胶体溶液，为求得抗原与抗体适当比例，操作时一般需稀释抗原。沉淀反应种类很多，有环状沉淀法、絮状沉淀法、琼脂凝胶扩散法和免疫电泳等，在此重点介绍琼脂凝胶扩散法。含水分的半固体琼脂凝胶如同网状支架，允许可溶性抗原与抗体在其间扩散，在适量电解质存在下，抗原与抗体两者相遇，于比例最适处形成肉眼可见沉淀线或沉淀环。沉淀物在琼脂凝胶中长时间保持固定位置，便于观察，并可染色保存。2. 学生加板 (20min) 1：20 1：10 五、单项琼脂扩散实验原理：单向琼脂扩散

8、试验是一种定量试验，将一定量的抗体混合于琼脂中，倾注于玻片上，待凝固后在琼脂层打孔，将抗原加入孔中，孔中抗原向四周扩散，并在抗原与抗体比例适当处形成抗原抗体复合物，出现白色沉淀环。沉淀环直径与抗原浓度有正相关关系。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中抗原的含量即可从标准曲线中求出。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量。学生加样：教 案 首 页题 目凝集反应、沉淀反应学时4理论课实验实习课教 学对 象2006级临床上课日期2008年6月20日8:00-11:30上课地点生化大楼204目 的 要 求1. 掌握玻片凝集和试管凝集的操作方法；2. 了解玻片凝

9、集和试管凝集的应用；3. 熟悉单向琼脂扩散的操作技术；4. 掌握测定结果的计算方法。 重 点 难 点1. 抗体梯度稀释的方法；2. 判断抗体效价的方法。参 考 资 料1. 医学免疫学(人卫第四版) 陈慰峰主编；2. 医学微生物学(人卫第七版) 李凡主编。习 题 作 业1. 为何单向琼脂扩散试验能测定血清中免疫球蛋白的含量？2. 如何正确使用移液器？教学内容、过程、方法、手段及时间分配的设计一、 观察双向琼脂扩散实验的实验结果 (40min)将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，使它们各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。1. 讲解

10、该实验的结果判定方式 (20min)；2. 学生自己观察实验结果 (20min)；二、示教单项琼脂扩散实验 (80min)讲解单项琼脂扩散实验的原理 (30min)；发给学生已做好的琼脂扩散载玻片，让学生自己观察、测量扩散情况及沉淀线分布情况，自己做沉淀曲线 (50min)。三学生写实验报告及本次实验的体会和建议教 案 首 页题 目淋巴细胞分离与计数、PPD试验、ELISA学时4理论课实验实习课教 学对 象2006级临床上课日期2008年6月26日14:30-17:30上课地点生化大楼204目 的 要 求1. 熟练掌握人外周血中淋巴细胞分离与计数的方法；2. 掌握ELISA的原理、操作方法、临

11、床科研应用；3. 熟悉皮肤试验的原理。重 点 难 点1. PPD皮内注射的方法；2. 人外周血中淋巴细胞分离与计数的方法；3. 加样器的使用方法。参 考 资 料1. 医学免疫学(人卫第四版) 陈慰峰主编；2. 医学微生物学(人卫第七版) 李凡主编。习 题 作 业1. 为什么加抗凝血时不能与淋巴细胞分离液相混？2. 分离淋巴细胞时，是否一定要用水平离心机？3. 细胞板计数时为何要加台盼兰溶液，不加可以吗？4. 常用ELISA间接法检测抗HBs，能用夹心法吗？5. ELISA实际盒瓶装试剂，为何需垂直滴加？垂直滴加1滴体积约有多少？教学内容、过程、方法、手段及时间分配的设计一、 淋巴细胞分离与计数

12、 (100min)原理本实验是利用不同细胞间其密度不同的性质，通过速度沉降法来分离外周血淋巴细胞。首先让学生练习头静脉取血的方法，两个人互相抽，如果血管不好的或身体不适的可以不抽。讲解淋巴细胞分离方法，特别是抗凝血与淋巴细胞分离液加入的顺序，切不可加反。表面抗原阳性的同学可以不抽血，先后用酒精和擦镜纸将盖玻片擦干净，放在细胞计数板上，将显微镜的光圈调小，光线调暗，在低倍镜(10)下找到25格孔，再换高倍镜(40)计数，将细胞悬液和台盼蓝在计数板边上混匀后加板。(50min)。讲解显微镜的使用方法及细胞计数板的使用方法，让学生多次练习以学会准确计数及结果的评估 (30min)。在进行分离淋巴细胞

13、活性检测时，讲解台盼兰的作用原理及使用方法，让大家在镜下能够准确区分活的和死亡的细胞，自己分析原因(20min)。二、 PPD试验首先讲解四型超敏反应的作用机理，然后结合临床应用讲解PPD实验的临床意义及操作方法，讲解皮内、皮下、静脉注射的区别及免疫学效应的差异，示教后由学生自己进行操作，实验结果72h后自行观察，补到实验记录中。用无菌皮试注射器吸取0.1mL 50IU/mL PPD溶液注射于前臂掌侧皮内，注射后48-72小时检查红肿硬结直径：5mm为阳性,有免疫力、细胞免疫功能正常 15mm 为强阳性,活动性结核 得过结核或例假者不做该实验，用手在两侧先将皮肤绷紧，之后水平进针教 案 首 页

14、题 目淋巴细胞分离与计数、PPD试验、ELISA学时4理论课实验实习课教 学对 象2006级临床上课日期2008年6月27日8:00-11:30上课地点生化大楼204目 的 要 求1. 熟练掌握人外周血中淋巴细胞分离与计数的方法；2. 掌握ELISA的操作方法；3. 熟悉皮肤试验的原理。重 点 难 点1. PPD皮内注射的方法；2. 人外周血中淋巴细胞分离与计数的方法；3. 加样器的使用方法。参 考 资 料1. 医学免疫学(人卫第四版) 陈慰峰主编；2. 医学微生物学(人卫第七版) 李凡主编。习 题 作 业1. 为什么加抗凝血时不能与淋巴细胞分离液相混？2. 分离淋巴细胞时，是否一定要用水平离

15、心机？3. 细胞板计数时为何要加台盼兰溶液，不加可以吗？4. 常用ELISA间接法检测抗HBs，能用夹心法吗？5. ELISA实际盒瓶装试剂，为何需垂直滴加？垂直滴加1滴体积约有多少？教学内容、过程、方法、手段及时间分配的设计一ELISA：原理：免疫酶标技术immunoenzyme technique是一种使用酶标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。它将抗原抗体反应的特异性与酶的高效专一的催化底物能力有效地结合起来，即可敏感地检测到体液中微量的特异性抗原或抗体，也可定性、定位或定量检测细胞抗原、受体或可溶性生物活性物质等。本技术具有敏感性高、特异性强、操作简便、易观察结果、便于大规模检测，且无放射

16、性污染等优点。最常用的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）是将固相吸附技术和免疫酶技术相结合。即将含有特异性抗原或抗体的溶液吸附于固相载体表面，利用酶标记抗体或抗原与之结合，形成酶标记免疫复合物，遇到酶底物，经催化显色，色泽深浅与标本中相应抗原或抗体量成正比，可以肉眼直接观察结果或经酶标检测仪测定。常用方法有双抗体夹心法、间接法 (图1-8-1)和竞争法三种。1讲解ELISA加板的方法，特别是讲解加样器的使用方法，取和还加样器的登记制度。2试剂稀释的方法及板孔甩干得方法，采用梯度稀释法，从低浓度向高浓度稀释，防止 “跳孔”。3.

17、讲解每组设三复孔的含义，设空白对照孔及阴性对照孔的含义，怎样实验结果才算有意义。4. 最后在实验结束的时候讲解酶标仪的使用方法及实验结果的判定方法，特别是结果判定的方法，结果写在实验记录中。重点讲述结果判定的方法： 5. 剩余时间根据结果自己书写实验记录。教 案 首 页题 目制备培养基、革兰染色、细菌动力学检查、ELISpot学时4理论课实验实习课教 学对 象2006级临床上课日期2008年7月3日14:30-17:30上课地点生化大楼204目 的 要 求1. 掌握ELISpot的实验原理；2. 了解ELISpot的实验操作流程；3. 掌握基础培养基的制备方法；4. 熟悉基础培养基的成分和用途

18、；5. 熟练掌握细菌涂片的制作和革兰染色法；6. 了解细菌动力学检察的方法。重 点 难 点1. 掌握ELISpot的实验原理；2. 掌握基础培养基的制备方法；3. 熟练掌握细菌涂片的制作和革兰染色法参 考 资 料1. 医学免疫学(人卫第四版) 陈慰峰主编2. 医学微生物学(人卫第七版) 李凡主编习 题 作 业1. 培养基经高压蒸汽灭菌后，为何要置37孵箱24h？2. 基础培养基有何用途？3. 为什么接种环使用前后必须烧灼灭菌？4. 将革兰染色初染和复染次序颠倒，将会有何后果？教学内容、过程、方法、手段及时间分配的设计ELISpot原理：ELISpot采用的是与ELISA夹心法极为相似的原理。将

19、细胞悬液和刺激剂加入到已经用针对分析物的捕获抗体包被的PVDF膜微孔板内，置37二氧化碳培养箱孵育一定的时间，受到刺激的细胞分泌蛋白于细胞周围并与捕获抗体结合；然后，洗涤细胞和未结合的蛋白，加入生物素标记的检测抗体，检测抗体与被分析物结合，形成 夹心三明治复合物；再次洗掉未结合的生物素标记抗体，加入碱性磷酸酶偶联的链酶亲和素，链酶亲和素与检测抗体上的生物素结合；最后，洗去未结合的酶，加入底物溶液与酶发生显色反应，在细胞因子出现的位置形成斑点，每一个斑点代表一个细胞。斑点的数量可在ELISpot分析系统上进行计数分析。讲解时实验原理结合ELISA的实验进行，但须特别注意以下内容：1. 严格遵守无

20、菌操作的原则；2. 加细胞或试剂时，枪头千万不可触碰孔底的PVDF膜，避免膜受损；3. 往板中加液体时，尽量避免出现气泡；4. 放入孵箱孵育时，切勿经常摇动；5. 在整个实验过程中，96孔板外面最好包裹锡箔纸，直到显色结束，防止出现边缘效应；6. 检测抗体和酶标抗体，最好现用现配；7. 为保证结果准确，最好做复孔；8. 实验结束后，板孔要阴干，不要在温度过高及干燥环境下干燥孔板；9. 操作显色液时，最好戴手套；10. 所需细胞最好经过纯化。 重点讲解ELISpot的优点，包括可以检测特定细胞亚群中特定细胞因子的表达水平，少至1001000个分子/Cell即能够被检测。比ELISA灵敏度高200

21、倍；单细胞水平，单个阳性效应细胞即能够被检出。比FACS灵敏1001000倍。 重点解释ELISpot的原理，用己知CK或其抗体包板，加入小鼠脾细胞，并经特异性/非特异性抗原(OVA/PHA)刺激使其分泌IFNg，则IFNg与anti-IFNg结合，再加入生物素标记的anti-IFNg及亲和素-酶联物，形成anti-IFNg-IFNg-生物素-亲和素-酶联复合物，加底物斑点显色。 特别讲授ELISpot读板器的使用方法及一些常见问题的解决方法。教 案 首 页题 目制备培养基、革兰染色、细菌动力学检查、ELISpot学时4理论课实验实习课教 学对 象2006级临床上课日期2008年7月4日8:0

22、0-11:30上课地点生化大楼204目 的 要 求1. 掌握ELISpot的实验原理；2. 了解ELISpot的实验操作流程；3. 掌握基础培养基的制备方法；4. 熟悉基础培养基的成分和用途；5. 熟练掌握细菌涂片的制作和革兰染色法；6. 了解细菌动力学检察的方法。重 点 难 点1. 掌握ELISpot的实验原理；2. 掌握基础培养基的制备方法；3. 熟练掌握细菌涂片的制作和革兰染色法。参 考 资 料1. 医学免疫学(人卫第四版) 陈慰峰主编；2. 医学微生物学(人卫第七版) 李凡主编。习 题 作 业1. 培养基经高压蒸汽灭菌后，为何要置37孵箱24h？2. 基础培养基有何用途？3. 为什么接

23、种环使用前后必须烧灼灭菌？4. 将革兰染色初染和复染次序颠倒，将会有何后果？教学内容、过程、方法、手段及时间分配的设计一、制备培养基：首先介绍培养基的分类方法，包括按营养组成和用途分类、按培养方式分类及按生长状态分类等：注意按照以下方式进行分组：液体培养基(4mL) 半固体培养基(4mL) 斜面培养基(4mL)平板培养基(15mL，厚度3cm左右)。每半张桌子为一大组，每大组12人，每人需要液体4+4+4+15=27mL ，共需324mL，预配出400mL。三、 革兰染色细菌染色法可分为单染、复染及各种特殊染色法。其中广泛使用染色法是由丹麦医生Christian Gram于1884年创建的革兰

24、(Gram)染色。利用这一方法可将细菌分为革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)两大类。这不仅有助于鉴别细菌、指导临床选择用药，并能了解细菌与致病的关系。原理：1.革兰阳性菌细胞壁结构比革兰阴性菌致密，肽聚糖层厚，脂类含量低，乙醇不易透入，故菌体内甲紫碘复合物不易被乙醇脱色。2.革兰阳性菌含有多量核糖核酸镁盐，可与甲紫和碘结合成大分子复合物，不易脱出，而革兰阴性菌中这种物质含量较少，故易被乙醇脱色。3.革兰阳性菌等电点(PI2-3)比革兰阴性菌(PI4-5)低，在同样pH值染色环境中，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的甲紫染料结合较为牢固，不易脱色。步骤：（1）初染：在已固定涂

25、片上滴加2-3滴甲紫(结晶紫)染液，染lmin后，洗瓶冲洗，载玻片下角轻靠染色缸内侧边缘或染色架以除去染液。 （2）媒染：滴加碘液2-3滴，染lmin，水洗，同法处理载玻片染液。 （3）脱色：滴加95乙醇数滴于玻片上，轻轻摇动玻片0.5-lmin，使均匀脱色，立即用水冲洗(若涂膜较厚，可适当延长脱色时间)。 （4）复染：滴加稀释石炭酸复红染液2-3滴，染色0.5min，水洗后吸水纸吸干。三、细菌动力学检查特别要注意接种环的使用方法：称量天平的使用方法：培养基溶解方法：油镜的使用方法：在标本待检部位加1滴镜油，量勿过多，更勿将油涂开。眼睛从镜筒侧面看着，慢慢将油镜头浸入油中，但勿接触玻片。然后一

26、面观察，一面转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升，待看见模糊物像时改用细准焦螺旋调至物像清楚。2. 观察完毕后转动粗准焦螺旋，提起镜筒，将油镜头转向外侧，用擦镜纸擦干。若油已干可蘸少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸拭去二甲苯。3. 标本片投入来苏尔中。四、油镜的使用原理 使用油镜时滴加折光率与玻片相近的镜油(香柏油或液状石蜡) 见图2-1-1，是为了使光线通过玻片和镜油时不发生或少发生折射，增加进入透镜光线(如图2-1-1中C-C)，使视野亮度加强，物像清晰。先用低倍镜找出标本范围，然后提高镜筒，在标本待检部位加1滴镜油，量勿过多，更勿将油涂开。眼睛从镜筒侧面看着，慢慢将油镜头浸于油中，但勿接触玻片

27、，然后眼睛转移至目镜处，一面观察，一面微转动粗调节器，使镜筒徐徐上升(此时只应上升，不能下降，以免压碎标本片和损坏油镜)，待看见模糊物像时，改用细调节器调至物像清楚。教 案 首 页题 目外因对细菌影响、细菌的分离培养学时4理论课实验实习课教 学对 象2006级临床上课日期2008年7月10日14:30-17:30上课地点生化大楼204目 的 要 求1. 掌握高压蒸汽灭菌器的使用方法及注意事项；2. 熟悉煮沸消毒和紫外线杀菌的效果；3. 熟悉常用消毒剂抑菌法；4. 了解细菌对抗生素敏感试验的方法；5. 掌握细菌分离和培养的基本技术；6. 熟悉细菌在基础培养基上的生长现象。重 点 难 点1. 掌握

28、细菌分离和培养的基本技术；2. 熟悉细菌在基础培养基上的生长现象。参 考 资 料1. 医学免疫学(人卫第四版) 陈慰峰主编；2. 医学微生物学(人卫第七版) 李凡主编。习 题 作 业1. 如何检校高压蒸汽灭菌器灭菌效果？2. 通过紫外线消毒试验，谈谈对紫外线的认识。3. 为什么半固体接种时，针尖不得插至管底？4. 培养基上接种细菌，为何还要无菌操作？5. 通常细菌为何培养18h即可？教学内容、过程、方法、手段及时间分配的设计一、外因对细菌影响 首先介绍高压蒸汽灭菌法的原理，即菌体蛋白遇热变性凝固。结合高压锅温度曲线进行讲解： 随后，讲解具体的实验步骤，特别是试验的分组情况： 分组后交待试验目的

29、及内容：先在板底标记实验者和实验名称！实验结束后用原袋把9块板重新装好，交到实验台侧面的塑料筐中，统一放孵箱培养！教 案 首 页题 目外因对细菌影响、细菌的分离培养学时4理论课实验实习课教 学对 象2006级临床上课日期2008年7月11日8:00-11:30上课地点生化大楼204目 的 要 求1. 掌握高压蒸汽灭菌器的使用方法及注意事项；2. 熟悉煮沸消毒和紫外线杀菌的效果；3. 熟悉常用消毒剂抑菌法；4. 了解细菌对抗生素敏感试验的方法；5. 掌握细菌分离和培养的基本技术；6. 熟悉细菌在基础培养基上的生长现象。重 点 难 点1. 掌握细菌分离和培养的基本技术；2. 熟悉细菌在基础培养基上的生长现象。参 考 资 料1. 医学免疫学(人卫第四版) 陈慰峰主编；2. 医学微生物学(人卫第七版) 李凡主编。习 题 作 业1. 如何检校高压蒸汽灭菌器灭菌效果？2. 通过紫外线消毒试验，谈谈对紫外线的认识。3. 为什么半固体接种时，针尖不得插至管底？4. 培养基上接种细菌，为何还要