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1、生物技术概论复习基因工程 DNA重组技术：基因工程概念：（Genetic Engineering）采用分子生物学手段，在体外将DNA分子插入病毒、质粒或其它载体，构成重组的遗传物质，导入宿主细胞并且持续稳定的表达，从而获得新特性或新品种。基因工程的步骤：（1）获得目的基因；（2）将目的基因与载体连接形成重组DNA；（3）将重组DNA导入受体细胞；（4）筛选出能表达目的基因的受体细胞。细胞工程概念：利用细胞生物学和分子生物学的方法，通过工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的门综合技术科学。细胞工程研究的内容按其技术可分为8大类：（1）组织与

2、细胞培养技术；（2）细胞大量培养技术；（3）细胞器移植技术；（4）DNA重组技术；（5）外源基因导入技术；（6）细胞融合技术；（7）体外受精和胚胎移植技术；（8）染色体工程技术酶工程概念：（Enzyme engineering）利用酶的催化作用进行物质转化，是酶学理论、基因工程、蛋白质工程和发酵工程相结合而形成的一门新技术。酶工程研究内容包括：（1）自然界中新酶的开发和生产；（2）酶分子的修饰；（3）酶的分离纯化技术；（4）酶的固定化技术；（5）酶反应器（6）酶生物传感器发酵工程概念：利用生物细胞（或酶）的某种特性，通过现代化工程技术手段进行工业规模化生产的技术生物工程下游技术概念：发酵工程、

3、酶工程、蛋白质工程和细胞工程生产的生物原料，经过提取、分离、纯化、加工等步骤，最终形成产品的技术。基因工程的理论基础: 基因工程技术是建立在分子生物学和分子遗传学理论发展基础之上的技术：不同基因具有相同的物质基础；基因是可切割和转移的；多肽与基因之间存在对应关系，并且有着相同的遗传密码；基因的遗传信息是可以遗传的原核生物基因结构特点:DNA 1) 结构简练 2) 存在转录单元 3) 有重叠基因mRNA 1) 半衰期短 2) 以多顺反子形式存在 3) 存在SD序列真核生物基因结构特点:DNA: 1) 不连续性 2) 高度重复序列-卫星DNAmRNA: 1) 5帽子结构 2) 具ploy(A)尾

4、3) 单顺反子基因工程的主要内容: 基因工程的主要内容基因工程的操作过程：切、接、贴、检查修复;（1）在供体细胞中用限制性内切酶切割基因；（2）把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接 酶连接组成重组体；（3）把重组体进入宿主细胞；（4）筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体基因工程的意义:（1）改变受体的某些性状；（2）获得人类所需要的某些物质；（3）研究基因的功能（4）创造新的生物碱抽提法提取质粒DNA原理：1）闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；2）染色体线性DNA或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候

5、沉淀下去。基因工程的工具酶：（1）限制性核酸内切酶；（2）DNA连接酶；（3）DNA聚合酶；（4）碱性磷酸酯酶；（5）S1核酸酶；（6）逆转录酶粘性末端的意义 ：连接便利； 5末端标记； 补平成平齐末端同裂酶:识别位点的序列相同的限制性内切酶。 同尾酶:识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。DNA连接酶的基本性质:修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 连接条件:（1）必须是两条双链DNA； （2）DNA3端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）； （3）需要能量：动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：NAD+大肠杆菌DNA连接酶：只能催化双链DNA的互补黏性末端，以NAD+为能量T4噬菌体连

6、接酶：黏性、平末端均可连接，以ATP为能量常用的DNA聚合酶的特点：1. 共同特点: 把dNTPs连续地加到引物的3OH端。 2. 主要区别: 持续合成能力和外切酶活性不同。 DNA聚合酶I的主要用途：用切口平移方法标记DNA（可作杂交探针）使用其53外切核酸酶活性降解寡核苷酸作为合成cDNA第二链的引物用于DNA分子的3突出尾进行末端标记，用于DNA序列分析。Klenow酶的基本用途：（1）补平由限制性内切酶切割DNA产生的3凹端（2）用P32 dNTP补平3凹端（3）对带3突出端DNA进行末端标记（4）cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链（5）在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA（

7、6）应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序TaqDNA聚合酶：基本特性：（1） 53的DNA聚合酶活性 (2) 53的核酸外切酶活性 (3) 耐高温78-94度用途：（1） PCR扩增；（2）DNA序列测定基因工程载体：（1）质粒（plasmid）；（2）植物病毒载体；（3）噬菌体载体；（4）黏性质粒载体或柯斯质粒（cosmid）；（5）表达载体 载体概念:在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分子叫载体。基因工程对载体的要求：（1）具有对受体细胞的可转移性，并在宿主细胞 内能独立复制。 （2）有选择性标记，便于重组DNA分子的检测。（3）有一段多克隆位点。

8、（4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr） -半乳糖苷酶Xgal显色反应原理: -半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。pUC系列载体的优点 : 更小的分子量； 选择方便； 克隆便利； 测序方便cosmid vector的特点: 具有噬菌体的特性： 具有质粒载体的特性：方便的选择：高容量的克隆能力：表达载体的结构 1）普通载体元件： 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS 2）大肠杆菌操纵子

9、元件： 阻遏基因 I 、操纵基因O 、启动基因P 、核糖体结合位点序列（SD） 、转录终止信号区。 目的基因:又叫靶基因，是指根据基因工程的目的和设计所需要某些DNA分子的片段，它含有一种或几种遗传信息的全套密码1、目的基因的直接分离法A 限制性内切酶酶切法 前提：对目的基因所在的载体或者基因组的位置、酶切位点十分清楚，基因组较小优点: 粘性末端，易与载体连接；缺点：如果目的基因也有酶切位点，本身易被酶切B 物理化学法 ：密度梯度离心法、单链酶切法、分子杂交法 C 逆转录获取法 ：总RNAmRNAc DNA PCR 2. 基因文库筛选法A 鸟枪法 B 基因文库的构建 C cDNA法 1. 鸟枪

10、法克隆目的基因的基本战略: 随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。 （1）染色体DNA的切断 ；（2）与载体连接 ；（3）转化受体细胞 ；（4）筛选含有目的基因的目的重组子 2. 鸟枪法克隆目的基因的局限性:（1）工作量较大，需要了解目的基因的背景知识（2）不能获得的最小长度的目的基因（30不能除去真核生物目的基因的内含子结构基因文库:从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库 cDNA文库2.

11、 cDNA法克隆目的基因的局限性:（1）并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 （2）细菌或原核生物的mRNA半衰期很短（3）mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感分离纯化困难（4）仅限于克隆蛋白质编码基因 标准的PCR过程分为三步：1）.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA2）.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3）.延伸（70-75）：在Taq DNA聚合酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

12、2. PCR的反应体系（1）要有与被分离目的基因的DNA双链两端序列相互补的DNA引物 （2）具有热稳定性的酶，如TaqDNA聚合酶 （3）dNTP （4）作为模板的目的DNA序列 （5）反应缓冲液3. PCR的特点（1）特异性强: PCR使用专门合成的DNA引物； 延伸过程是在高温下进行。（2）敏感性高 需要的模板量极低。 (3）快速 （4）简便 （5）可以扩增mRNA 4. PCR技术的应用：（1）从基因组中扩增； （2）从载体上扩增； ；（3）组织样本原位扩增； （4）微量残留DNA扩增； 分析模板序列； （1）反转录PCR（RT-PCR) 利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以c

13、DNA为模板进行PCR扩增。 （2）基因的体外诱变 在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。 （3）基因组的比较研究 植物细胞外壁基因的直接转化法:1. 电击法 2.基因枪法 3.激光微束穿孔转化法 4.细菌圆球体融合法 5.多聚物介导法 6.花粉管通道法 重组体的鉴定：1、报告基因的检测法2. 转基因生物的PCR鉴定3、目的基因分子杂交检测方法 细胞工程细胞融合技术:概念:两个或多个细胞相互接触后,其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程过程：（1）制备原生质体 （2）诱导细胞融合 （3）筛选杂合细胞 植物组织培养步骤：（1）预备阶段：1）选择合适的外植

14、体 2）除去病原菌及杂菌 3）配制适宜的培养基：三大组分：a.含量丰富的基本成分：如蔗糖或葡萄糖高达每升30g，以及氮、磷、钾、镁等；b.微量无机物，如铁、锰、硼酸等；c.微量有机物，如吲哚乙酸、激动素、肌醇等。各培养基中，吲哚乙酸和激动素的变动幅度很大，这主要因培养目的而异。一般较高的生长素（吲哚乙酸）对细胞分裂素（激动素）比值有利于诱导外植体产生愈伤组织。反之，则促进胚芽和胚根的分化。（2）诱导去分化阶段：（3）继代增殖阶段：（4）生根发芽阶段：（5）移栽成活阶段：人工种子:概念：人为制造的种子，它是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。人工种子的构成：（1）胚状体

15、 （2）人工胚乳 （3）人工种皮人工种子的优点：（1）不受环境因素制约, 全年进行工厂化生产 （2）无性繁殖有利于保存该种系的优良性状（3）成本低，适合于机械化播种 （4）可添加营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利胚状体的健康生长胚状体同步生长的措施：（1）低温法：阻止微管蛋白合成及纺锤体形成，使细胞停留在细胞分裂中期；（2）抑制剂法：DNA合成抑制剂（如5-氨基尿嘧啶），细胞停留在G1期；（3）分离法：一定孔径过滤网，离心；（4）通气法：通入氮气或者乙烯1-2次，提高细胞分裂同步率；（5）渗透压法：胚状体发育过程，渗透压下降，培养基保持一定渗透压，使胚状体停留在一定的指定的阶段。植物脱

16、毒途径：（1）物理方法：温度（高温）（2）化学方法：孔雀绿等（难）（3）生物学方法：芽尖、根尖（4）综合脱毒法植物脱毒检测：（1） 外形观察法；（2）电镜观察法；（3）免疫血清法: 流程图见书本P70淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体：原理：见书本P74页图右方多莉羊的克隆途径、区别以及意义：克隆途径：区别：意义：A-理论价值：高度分化的体细胞具有全能性B-实践意义：由于体细胞数量丰富并且易于获得，因此体细胞克隆动物技术在加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物（如大熊猫）方面意义重大。 可以用患者本人细胞培育出新组织。干细胞的概念、分类和阶段：概念：动物（包括人）胚胎及器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始

17、细胞，能分裂、产生出表现型和基因型都和自己完全相同的子细胞，同时还能分化为各类祖细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。按分化潜能的大小分类：（1）全能性干细胞：即胚胎干细胞，能分化成各种细胞甚至完全的新个体；（2）多能性干细胞：具有分化成多种细胞及组织的潜能，但失去发育成新个体的潜能；（3）单能性干细胞：能分化成一种类型细胞或功能密切相关的两种类型细胞。开展干细胞研究经过的三个阶段：（1） 获得干细胞系 ：这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官、组织中分离并经鉴定，且能在体外长期保持干细胞特性（一般应稳定传25代以上）；（2） 建立干细胞诱导分化模型：可

18、利用基因工程手段引入外源目的基因（对原有致病基因进行置换改造），探索诱导干细胞向特定组织、器官分化的化学和（或）物理条件（3）将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。应用干细胞治疗疾病和传统方法比较的优点：（1）低毒性（或无毒性），一次治疗有效；（2）不需要完全了解疾病发病的确切机理； （3）用自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。 发酵技术的特点：（1）发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成。（2）反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单。（3）原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可

19、再生资源（如植物秸秆、木屑等），微生物本身能有选择地摄取所需物质。（4）容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应。（5）发酵过程中需要防止杂菌污染，大多情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。 根据微生物的种类划分：（1）好氧性发酵；（2）厌氧性发酵；（3）兼性厌氧按培养基状态划分：（1）固体发酵；（2）液体发酵 按发酵设备划分：（1）敞口发酵；（2）密闭发酵；（3）浅盘发酵；（4）深层发酵 液体深层发酵的优点：（1）液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境；（2）在液体中，菌体及营养物、产物（包括热量）易于扩散，使发酵可在

20、均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模；（3）液体输送方便，易于机械化操作；（4）厂房面积小，生产效率高，易进行自动化控制；（5）产品易于提取、精制等。培养基的种类：孢子培养基：（1）形成大量优质孢子，避免变异；（2）基质浓度往往偏低种子培养基：（1）易被吸收利用、成分丰富完整；（2）N源、维生素含量略高，总浓度略稀薄发酵培养基：（1）供菌体大量繁殖及合成代谢产物；（2）组成丰富，浓度及黏度适中发酵培养基的组成：（1）碳源： （2）氮源：（3）无机盐和微量元素： （4）生长因子： （5）水：（6）产物形成的诱导物、前体和促进剂：发酵的一般过程：图见课本P94页发酵的操作方式：根据操

21、作方式的不同，液体深层发酵主要有分批发酵、连续发酵和补料分批发酵三种类型。分批发酵：概念：营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。传统的生物产品发酵多用此过程。 优点：（1）操作简单；（2）操作引起染菌的概率低；（3）不会产生菌种老化和变异问题缺点：非生产时间较长、设备利用率低连续发酵：概念：以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持，微生物在稳定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定的菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长。 优点：（1）能维持基质浓度；（2）可以提高设备利用率和单

22、位时间的产量；（3）便于自动控制缺点：（1）菌种发生变异的可能性较大；（2）要求严格的无菌条件补料分批发酵：概念：又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。 优点：（1）能维持基质浓度；（2）可以提高设备利用率和单位时间的产量；（3）便于自动控制缺点：（1）菌种发生变异的可能性较大；（2）要求严格的无菌条件温度对发酵过程的影响：（1）影响各种酶反应的速率；（2）改变菌体代谢产物的合成方向；（3）影响微生物的代谢调控机制；（4）对发酵液的理化性质产生影响；如发酵液的黏度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某

23、些基质的分解和吸收速率等。 pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响：1 影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；2 影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；3 影响培养基中某些组分和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用； pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。另外，pH值还会影响某些霉菌的形态。PH的控制调节：（1）调节基础培养基的配方：a. 调节碳氮比（C/N）；b. 添加缓冲剂（2）补料控制：a.直接加酸加碱；b.补加碳源（降低pH）或氮源（升高pH）下游

24、加工过程：下游加工过程通常可分为发酵液预处理和固液分离、提取、精制以及成品加工4个阶段。发展微生物作为酶生产的来源的主要原因：（1）生长繁殖快，生活周期短，产量高，酶比活很高；（2）培养方法简单，原料来源丰富，经济效益高；（3）微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；（4）可以通过诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种。优良的产酶菌种应具备的优点：（1）繁殖快、产酶量高、有利于缩短生产周期；（2）能在便宜的底物上生长良好；（3）产酶性能稳定、菌株不易退化、不易受噬菌体侵袭；（4）产生的酶容易分离纯化酶基因克隆及表达的基本步骤：克隆酶基因的宿主-载体系统应具备的特性：（1）所希望的酶占细胞

25、总蛋白量的比例要高;（2）菌体容易大规模培养，生长无特殊要求；（3）载体与宿主相容，且能在宿主中稳定维持；（4）宿主的蛋白酶尽可能少；（5）宿主菌对人安全，不分泌毒素。提高酶产量的措施：（1）添加诱导物；（2）控制阻遏物浓度；（3）表面活性剂；（4）添加产酶促进剂；酶制剂的制备流程：（1）破碎细胞；（2）溶剂抽提；（3）离心分离；（4）浓缩；（5）干燥根据酶分子大小和形状的分离方法：（1）离心分离；（2）凝胶过滤；（3）透析与超滤根据酶分子电荷性质的分离方法：（1）离子交换层析；（2）层析聚焦；（3）电泳；（4）等电聚焦电泳 根据酶分子专一性结合的分离方法:（1）亲和层析；（2）染料配体亲和层

26、析；（3）共价层析酶分子修饰概念：指通过对酶蛋白主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，改造的目的在于改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状，扩大酶的应用以达到较高的经济效益。酶分子的修饰方法：（1）金属离子置换修饰；（2）大分子结合修饰(共价/非共价)；（3）侧链基团修饰；（4）肽链有限水解修饰；（5）氨基酸置换修饰；（6）酶分子的物理修饰 制备修饰酶的目的：（1）提高酶活力；（2）改进酶的稳定性；（3）允许酶在一个变化的环境中起作用；（4）改变最适PH或最适温度；（5）改变酶的特异性使它能催化不同的底物；（6）改变催化反应类型；（7）提高催化过程的反应效率。固定化酶概念

27、：酶是一种蛋白质，稳定性差，而且在催化结束后难以回收，为适应工业化生产的需要，人们模仿生物体内酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定。经固定化后的生物催化剂既具有酶的催化性质，又具有一般化学催化剂能回收和反复使用的优点，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化。定向固定化技术的优点：（1）每一个酶蛋白分子通过某一特定的位点以可重复的方式进行固定化；（2）蛋白质的定向固定化技术有利于进一步研究蛋白质结构；（3）这种固定化技术可以借助一个与酶蛋白的酶活性无关或影响很小的氨基酸来实现。酶的固定化方法：（1）载体结合法：包括物理吸附法、离子结合法、螯合法和共价结合法；（2）共价交联法；（3）包埋法：包括聚合物包埋法、疏水相互作用、微胶囊和脂质体包埋。