放线菌T111发酵液理化性质及发酵产物对核盘菌抑菌机制初探.docx

1、放线菌T111发酵液理化性质及发酵产物对核盘菌抑菌机制初探 毕 业 论 文题目：放线菌T111发酵液理化性质及发酵产物对核盘菌抑菌机制初探学 院 植 物 保 护专业班级 06植检1班 届 次 2010 学生姓名 学 号 指导教师 二O一年 六 月 十 日中文摘要 4英文摘要 41 前言 51.1 生防菌应用的种类 61.2 拮抗放线菌的主要作用机制 71.3 本研究的目的及意义 82 材料与方法 82.1 材料 82.2 拮抗放线菌发酵液抑菌活性测定方法 92.3 T111发酵液的理化性质 92.4 放线菌T111发酵产物对核盘菌的抑菌机制研究 103 结果与分析 113.1 T111发酵液的

2、理化性质 113.1.1发酵液抗菌谱 113.1.2 贮存稳定性 123.1.3 热稳定性 133.1.4 酸碱稳定性 133.1.5 紫外光稳定性 143.2 T111发酵产物对核盘菌的抑菌机制结果 153.2.1 T111发酵产物对核盘菌菌丝生长的影响结果 153.2.2 T111发酵产物对核盘菌菌丝形态的影响结果 153.2.3 T111发酵产物对核盘菌菌核形成及单重的影响结果 163.2.4 T111发酵产物对核盘菌菌核萌发的影响结果 173.2.5 T111发酵产物对核盘菌菌丝体细胞膜渗透势的影响结果 184 讨论 195 参考文献 206 致谢 21CatalogueChinese

3、 abstract 4English abstract 41 Introduction 51.1 The category of antagonism fungus 61.2 The antagonistic mechanisms of Streptomyces 71.3 Purpose and significance of the study 82 Material and methods 82.1 material 82.2 Antifungal abilities of fermentation conditions 92.3 Physical and chemical propert

4、ies of T111 strain 92.4 Antagonistic mechanisms to Sclerotinia sclerotiorum of T111 103 Results and analyse 113.1 Physical and chemical properties of T111 strain 113.1.1 Inhibition spectrum of fermentation extracts of T11 113.1.2 Effects of storage time on the activity of fermentation extracts 123.1

5、.3 Effects of temperatures on the activity of fermentation extracts 133.1.4 Effects of pH on the activity of fermentation extracts 133.1.5 Effects of UV irradiation time on the activity of fermentation extracts 143.2 The result of antagonistic mechanisms to Sclerotinia sclerotiorum 153.2.1 Inhibitio

6、n toxicities on mycelium growth of S. sclerotiorum 153.2.2 Effect of fermentation broth of T111 on sclerotium mycelium shape 153.2.3 Effect of antifungal substance of T111 on sclerotium formation time and single weight 163.2.4 Effect of antifungal substance of T111 on sclerotium bourgeon 173.2.5 Eff

7、ect of antifungal substance of T111 on membrane osmotic potential 184 Discussion 195 Reference 206 Thanks 21放线菌T111发酵液理化性质及发酵产物对核盘菌抑菌机制初探 摘要：为明确放线菌T111的理化性质，研究了其抗菌谱，及贮存时间、温度、酸碱条件、紫外光照射等对其发酵液稳定性的影响。结果表明，T111发酵液对黄瓜菌核、黄瓜蔓枯、棉花红腐病菌等有较高的抑制活性；贮存稳定性和热稳定性良好，4贮存60d抑菌活性为对照的88.3%，80处理60min抑菌活性为对照的90.9%；对pH值较敏感，

8、在pH 57时活性较高；对紫外线稳定，紫外光照射12h，其活性基本不受影响。初步研究了T111发酵产物对核盘菌的抑菌机制，采用菌丝生长速率法测定了其对黄瓜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum菌丝生长的毒力，及其对菌丝形态、菌核形成、菌核萌发和菌体细胞膜透性的影响。结果表明，T111发酵产物对核盘菌菌丝生长的EC50值为12.5g/mL，低于对照药剂乙霉威及嘧霉胺；经发酵产物处理后，菌丝形态出现黄化、畸形等现象，但尚未发现细胞质外渗；菌核形成的时间有所延长，数量有所减少，且重量略有降低；在发酵产物浓度为250g/mL时不能完全抑制菌核萌发；对菌体细胞膜渗透势的影响不大。关键词

9、：黄色链霉菌；黄瓜菌核病菌；发酵液；理化特性；抑菌机制Characterizations of T111 fermentation extract and antagonistic mechanism to Sclerotinia sclerotiorum Abstract: the physical and chemical properties of the fermentation extract were studied by using agar-well diffusion method. The results showed that the fermentation extra

10、cts had high inhibitory activities on Sclerotinia sclerotiorum, Ascochyta citrullina and Fusarium moniliforme var. intermedium. And it was well-stored and thermalstable, 88.3% of the initial activities remained after stored 60d at 4, 90.9% of the initial activities remained after heating at 80 for 6

11、0min. The fermentation extract was sensitive to the changes of pH, only in the pH range of 5-7 was stable; the antifungal activities were almost not destroyed when it was under UV irradiation for 12h. To ascertain the antagonistic mechanisms of the antifungal substance to S. sclerotiorum, the inhibi

12、tion activities on mycelium growth against S. sclerotiorum were determined by mycelium growth rate method in lab. And its effect on this pathogens biology characteristics, such as mycelium shape, sclerotium formation, sclerotium germination and membrane osmotic potential were also studied. The resul

13、ts showed that its EC50 value was 12.5g/mL, which was lower than Diethofencarb and Pyrimethanil. After treated with the antifungal substance, the mycelia became etiolation and malformation, but had not yet found in the cytoplasm extravasation. This antifungal substance could delay the formation of s

14、clerotium, the sclerotium numbers decreased contrasted that of the water control, and the weight reduced slightly. At the concentration of 250g/mL of this antifungal substance, it could not restrain the sclerotium germination completely. And it had no significant effect on the membrane osmotic poten

15、tial. Key words: Streptomyces flavus; Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary; Fermentation extract; Physical and chemical properties; Antagonistic mechanisms.1、前 言植物土传病害，其病原菌一般为多寄主微生物，通常侵染植物根部，引起植物根部乃至全株性病害。土传病害的发生和流行通常属于积年流行病害，年度间波动不大。在防治方面，化学防治和抗病育种目前只对部分病害有效，对大多数病害防效不甚理想1。黄瓜菌核病就是近几年来严重为害温室黄瓜产量的一种重

16、要土传病害，该菌以菌核的状态在自然条件下可以长期存活，防治非常困难。目前生产上主要依靠化学防治，但由于抗药性的发生，使得菌核病菌对多种杀菌剂存在着较高的抗性。目前正在寻找一种简单、有效、安全的植物病害防治方法，即生物防治。生物防治是指通过除人以外的一种或多种生物来降低病原微生物数量或减弱病原菌的致病能力，从而减少病原微生物所致病害的发生2。它是通过植物、病原物、生防菌、植物表面及其周围微生物群落和自然环境等因素的互作关系，来达到促生防病的作用3。拮抗微生物具有不易使病原菌产生抗性、对环境安全、生产工艺相对简单以及不少微生物同时具有促进作物生长等优点而受到人们的关注和重视4。利用拮抗微生物产生的

17、抗菌物质进行生物防治已成为研究的热点，已开发的有灭瘟素、放线菌酮、井冈霉素、多抗霉素、农抗120等。近年来，随着研究的深入和生防要求的提高，人们开始将更多的注意力转移到一些新型抗菌物质上，如新型抗生素、抗真菌蛋白等，因而需要不断地发掘和利用新的拮抗微生物资源。1.1 生防菌应用的种类生防菌的种类繁多，生产上广泛应用的有真菌、细菌、放线菌等。真菌主要有木霉菌、毛壳菌、酵母菌、淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌等；细菌主要有芽孢杆菌、假单胞杆菌等促进植物生长菌（PGPR）、放射性土壤农杆菌和巴氏杆菌等；放线菌主要有链霉菌及其变种。对生防真菌研究最广泛的是木霉菌（T. richoderma），常

18、见的木霉菌有哈茨木霉、绿色木霉、钩状木霉、长枝木霉、康氏木霉和绿粘帚霉等。它广泛存在于土壤及植物表面，经常可从植物病残体、种子、球茎表面分离到。如文成敬等5将油菜菌核作为诱饵埋入土壤中2个月后从菌核表面和内部分离到52株木霉，分别为黄绿木霉、钩状木霉、哈茨木霉、康化木霉、拟康化木霉。目前国际上用于防治土传病害的拮抗细菌常见的有以下属：产碱菌属6、无定形孢囊菌属、节杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、哈夫尼菌属、小单孢菌属、假单孢菌属、巴斯德氏芽菌属、根瘤菌属、沙雷氏菌属和黄单胞菌属7。已开发为生防农药的生防细菌主要有芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属和土壤杆菌属等。目前

19、国内外8应用芽孢杆菌防治植物病害非常广泛，据报道，芽孢杆菌对马铃薯环腐病菌9、梨灰霉病菌10、油菜菌核病菌11、水稻白叶枯病菌12、稻瘟病菌13和小麦赤霉病菌14等具有潜在的生防利用价值。张学君等15表明芽孢杆菌对棉花枯萎病菌、立枯病菌、黄萎病菌、炭疽病菌、棉铃疫霉病菌和棉叶斑病菌均有强烈的抑菌作用。魏春妹等16制得的生防制剂青枯散，不仅对青枯病菌的拮抗率为83.5%，而且能促进番茄、花生、黄瓜、烟草、油菜等作物生长。目前用于生防细菌的种类有：枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、多粘芽孢杆菌（B. polvmvxa）、蜡状芽孢杆菌（B. cereus）、巨大芽孢杆菌（B. megateri

20、um）和短小芽孢杆菌（B. pumilis）等17。放线菌由于菌落呈放射状而得名。从Cohn（1872）发现放线菌至今，已经报道了69个属，1687个种18。应用于生物防治的放线菌主要是链霉菌属（Streptomyces），其次有诺卡菌属（Nocardia）、游动放线菌（Actinoplanes）、小单孢菌属（Micromonospora）等19。据统计，已发现的抗生素，61.7%是放线菌产生的。而目前广泛应用的许多重要农用抗生素是从链霉菌属中分离得到的放线菌所产生的。如井冈霉素用于防治水稻纹枯病，在蔬菜上应用防治苗期立枯病和白绢病；春雷霉素用于防治黄瓜的炭疽病、细菌性角斑病、枯萎病，番茄叶霉

21、病；农抗120主要用于防治蔬菜、果树、花卉等作物的白粉病，对瓜果的炭疽病、番茄疫病也有一定防效；多抗霉素防治瓜类、番茄白粉病、灰霉病，丝核菌引起的叶菜和其他蔬菜的糜烂、猝倒病，以及黄瓜霜霉病和番茄晚疫病；农用链霉素主要用于防治黄瓜角斑病等细菌性病害。1.2 拮抗放线菌的主要作用机制放线菌一般通过两种途径对靶标致病菌发挥生防作用：它能够在寄主体外通过抗生作用、竞争作用、捕食和重寄生作用降低病原菌的致病性、侵染效率以及接种体密度，导致病原菌群体密度以及致病性下降，人们利用它的这一特性开发一些活体菌制剂。放线菌也可以在寄主植物组织内，诱发其产生抗性或对寄主产生抑菌物质（主要是抗生素），影响病原菌的繁

22、殖、生长，最后导致靶标致病菌死亡，在这方面对其产生的抗生素研究较多。1.2.1 抗生作用抗生的发生主要依赖于生防菌抗生素的产生，一般单株生防放线菌可以合成多种抗生素。抗生素的作用机理主要是：（1）抑制微生物细胞代谢的某些环节或代谢中的某些酶系统，微生物重要代谢环节被抑制，生长发育出现障碍，甚至死亡。（2）广谱抗生素的抗菌机制：某些抗生素能抑制微生物共同的代谢途径，如蛋白质和核酸的合成，则可抑制许多不同种类微生物的生长。（3）除了干扰代谢作用外，有时也可影响病原菌的形态结构。1.2.2 竞争作用生防放线菌对土壤或植物根际中碳源的竞争利用，可以阻止病原菌的生长，从而阻止了病原菌对植物的侵染。竞争方

23、式为（1）空间竞争：由于能够产生抗生素，放线菌能够抑制许多植物病原菌，但它们的应用价值还在于它们在植物根围的定殖能力以及是否对有益菌有抑制作用等；（2）营养竞争：铁离子（Fe3+）利用度是土壤环境对微生物生长的一个限制因子，链霉菌能够分泌嗜铁素（siderophore），鳌合铁离子，从而更多地利用铁离子，限制了病原微生物对铁离子的需求，从而达到抑制病原菌的目的。1.2.3 重寄生作用由水解酶介导的重寄生是生防菌的作用机制之一。放线菌可以分泌多种胞外水解酶，主要包括：几丁质酶、葡聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、脂肪酶和核酸酶等。植物病原高等真菌的细胞壁是以几丁质为骨架，以-1，3-葡

24、聚糖为主要填充物组成的。处于生长过程中的菌丝尖端几丁质多呈裸露状态，易被水解酶攻击而导致细胞破裂，生长受阻或者细胞死亡，阻止病害的发生发展。1.2.4 促进植物生长Benson于1993年报道植物根际的链霉菌具有固氮作用，可与植物形成共生关系，促进植物生长。近年来，我国也开展了弗兰克氏菌共生固氮放线菌的研究，该菌能够诱导大范围放线菌根瘤植物产生根瘤，并促进植物对Fe等元素的吸收。1.3 本研究的目的及意义本实验室以黄瓜菌核病菌为指示菌，筛选到一株对其有强拮抗活性的放线菌株T111。本文在此基础上测定了其拮抗谱、贮存稳定性、酸碱稳定性、热稳定性、紫外光稳定性等理化性质，然后进一步研究了其发酵产物

25、对核盘菌的抑菌机制，为进一步分析抗菌物质结构和开发利用提供依据。2 材料与方法2.1 材料2.1.1 供试菌株拮抗放线菌：T111，分离于泰安市郊保护地黄瓜根际土壤中，本实验室保存。指示菌：黄瓜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、黄瓜蔓枯病菌（Ascochyta citrullina）、棉花红腐病菌（Fusarium moniliforme var. intermedium）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、棉花黑斑病菌（Xanthomonas campestris pv. malvacearum）、番茄叶霉病菌（Cladosporium fl

26、ulvum）、棉花炭疽病菌（Colletotrichum gossypii Southw）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜猝倒病菌（Pythium spp.）、苹果腐烂病菌（Cytospora mandshurica）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani Khn），均为本实验室分离鉴定保存。2.1.2 供试培养基高氏一号液体培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，去离子水1000mL；用于放线菌T111发酵液的培养。PDA培养基：马铃薯（去

27、皮）20g，葡萄糖20g，琼脂17g，去离子水1000mL；用于指示菌黄瓜菌核病菌的培养及拮抗活性的测定。2.1.3 主要仪器与试剂2.1.3.1 仪器CR22高速冷冻离心机（日本日立公司）；生化培养箱（上海跃进医疗器械厂）；GA110万分之一电子天平（德国制造）；LDZX-40BI自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；紫外灯（长沙市鑫辉特种光源电器厂）；光学显微镜（OLYMPUS公司）；XL80漩涡振荡器（上海第一医学院仪器厂）；SWCJLD超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；WD700 微波炉（顺德格兰仕电器厂）；THZ82空气浴摇床（江苏太仓）；DDSJ-308A型电

28、导率仪（上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂）。2.1.3.2 化学及生化试剂琼脂粉（上海山浦化工有限公司）；葡萄糖（分析纯，上海伯奥生物试剂有限公司）；酵母浸膏（天津市英博生化试剂有限公司）；氯化钠（天津市凯通化学试剂有限公司）；胰蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；硫酸链霉素（山东瑞阳制药有限公司）；95.5乙霉威原药（江苏苏化集团新沂农药厂）；95腐霉利原药(日本住友化学工业株式会社)。2.2 拮抗放线菌发酵液抑菌活性测定方法2.2.1 平板对峙法在PDA平板上以原点为中心划垂直的十字，沿一条线接生防菌，另一条线两端与中心等距离（20mm）处接供试病原菌菌饼。25培养48h后观察抑菌

29、带大小判断抑菌活性大小（方中达，2005）。2.2.2 生长速率法 将培养好的发酵液于4 10000r/min离心15min除去菌体，取2ml上清与18mL PDA培养基（内含50mg/L硫酸链霉素）混匀后倒平板，平板冷却后在中央接种黄瓜菌核病菌菌饼，以不加上清的PDA平板做对照，25培养箱中培养48h，测量菌落直径，计算抑菌率，根据抑菌率大小判断抑菌活性强弱。2.2.3 琼脂孔扩散对峙法 将黄瓜菌核病菌菌饼（8 mm）接种于PDA平板中央，在菌饼周围2 cm处均匀打3个孔（8 mm），将待测物注入孔内，每孔约60 L，25下培养48 h，测量抑菌圈半径，以抑菌圈半径大小评价抑菌效果大小。2.

30、3 T111发酵液的理化性质2.3.1 抗菌谱 用平板打孔法分别测定发酵上清液对黄瓜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、黄瓜蔓枯病菌（Ascochyta citrullina）、棉花红腐病菌（Fusarium moniliforme var. intermedium）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、棉花黑斑病菌（Xanthomonas campestris pv. malvacearum）、番茄叶霉病菌（Cladosporium flulvum）、棉花炭疽病菌（Colletotrichum gossypii Southw）、番茄灰霉病菌（Bo

31、trytis cinerea）、黄瓜猝倒病菌（Pythium spp.）、苹果腐烂病菌（Cytospora mandshurica）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani Khn）的抑菌作用，以不含抗菌发酵液的液体培养液作对照。2.3.2 抗菌效果的稳定性 取发酵上清液50mL，平均分为两份，分别装入无菌的密封三角瓶中，分别在4冰箱和室温条件下保存，在保存3、7、15、30、60d时测定抑菌活性。2.3.3 热稳定性 将发酵液于50、60、70、80、90和100下分别处理60min，以黄瓜菌核病菌作为指示菌，未经热处理的发酵液作对照，平板打孔法测定活性。2.3.4 pH稳定性

32、将T111发酵液100mL分别用1mol/L HCl和1mol/L NaOH处理至pH值4、5、6、7、8、9、10，分别静置2h，然后将pH调回发酵液的自然pH值（经pH计测定原发酵液pH为6.5），未经酸碱处理的发酵液作对照，平板打孔法测定活性。2.3.5 紫外光稳定性 将发酵上清液置于无菌培养皿中，然后将盛满发酵液的培养皿放在据20W紫外灯10cm处紫外照射，在照射1、3、5、7、9、12h后，平板打孔法测活。以未经紫外光照射的粗提液为对照。每个处理重复3次。2.4 放线菌T111发酵产物对核盘菌的抑菌机制研究2.4.1 T111发酵产物的制备 得到上清液后，用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液经无水硫酸钠脱水后，27、150rmin-1旋转蒸发，得到黄色固体粗提物，后续试验用去离子水定量溶解。2.4.2 T111