细菌对抗菌药物耐药机制研究进展回顾.docx

1、细菌对抗菌药物耐药机制研究进展回顾2006年细菌对抗菌药物耐药机制研究进展回顾 【摘要】 细菌对抗菌药物的耐药性机制是生物医药研究的重要领域。2006年抗菌药物耐药机制研究在多方面有重要的发现，如对细菌药物主动外排泵的药物转运结构机制的深入了解及发现新的药物泵或新的泵调控表达机制，发现了喹诺酮类药物修饰酶、质粒介导的喹诺酮耐药性在世界范围内的出现，对金葡菌耐药机制的进一步认识与发现新型抗多重耐药革兰阳性球菌的platensimycin，鲍曼不动杆菌基因多重耐药岛的发现，新型 内酰胺酶的继续出现以及超广谱 内酰胺酶开始从食用动物或宠物分离的细菌中证实。本文还讨论了2006年中国细菌耐药机制研究的

2、一些重要结果。这些研究成果继续提示细菌对不同抗菌药物的多种耐药保护机制及细菌本身基因结构的多样性与可移动性使其能进化产生新的耐药机制以适应抗菌药物的作用。严谨合理地应用抗菌药物以最大限度地减少细菌耐药性发生及传播和延长抗菌药物的疗效周期是人类所面临的长期挑战。【关键词】 耐药机制 多重耐药性 外排泵 qnr质粒 喹诺酮修饰酶 内酰胺酶 Platensimycin Progress in studying mechanisms of antimicrobial resistance ABSTRACT Studies on mechanisms of antimicrobial resistanc

3、e in bacteria continue to be a key area in biomedical sciences. This has been demonstrated in the advances achieved in 2006, which are attributed, for example, to the following aspects: structural elucidation of the transport mechanisms of multidrug resistance transporters with identification of nov

4、el drug efflux pumps or of novel regulatory mechanisms of drug pumps, discovery of a quinolone modifying enzyme, the worldwide emergence of plasmid mediated quinolone resistance, further understanding of staphylococcal resistance and the discovery of platensimycin active against multidrug resistant

5、gram positive cocci, identification of a resistance genomic island in Acinetobacter baumannii, characterization of novel lactamases, and emergence of extended spectrum lactamases in animal derived bacteria. Key observations from the studies in 2006 in China are also described. The results presented

6、continue to demonstrate the evolutionary capability of bacteria in their adaptation to various antimicrobials via diverse and mobile genetic elements. Prudent use of antimicrobial drugs for minimizing the further emergence and dissemination of antimicrobial resistance and prolonging the life span of

7、 antimicrobial drugs is certainly a daunting long term challenge. KEY WORDS Resistance mechanisms; Multidrug resistance; Efflux pumps; qnr plasmids; Quinolone modifying enzyme; Lactamases; Platensimycin 细菌对抗菌药物的耐药性系全球性和区域性问题，给抗感染治疗带来了严峻挑战。在美国举行的“抗菌药物耐药性2006年年会”上，哈佛大学Moellering Jr.教授以“抗菌药物耐药性：下一个大流行(

8、Antimicrobial Resistance: The Next Pandemic)”为题的会议开场报告再次佐证了可能进一步加剧的抗菌药物耐药性的严重问题，同时也提示了耐药性研究的重要意义。以“Antimicrobial”和“Resistance”为关键词在PubMed文献库(，截至2006年11月30日)能检索到近1500篇2006年发表的相关文献。在中国，包括中国抗生素杂志在内的相关学术刊物也发表了不少细菌耐药性的研究论着。已有的研究明确显示获得性耐药细菌在全球范围呈增高趋势，且在局部地区一些耐药菌感染甚至面临无有效治疗药物可选择。临床分离的大量耐药菌株似乎又为耐药机制多样性的研究提供

9、了“必要的”实验材料，但这些材料的获得却可能是以相应感染性疾病的无效治疗为代价。 近年来抗菌药物耐药机制的研究揭示了新型耐药机制或者对已知的耐药机制又有了更深入的了解，这些进展无疑为认识耐药菌或耐药性基因传播的流行病学与抗菌药物的研发提供了重要信息。在2006年，抗菌药物耐药机制研究有多方面的重要报道，及时了解这些研究进展有助于思考相关的研究内容与方向。本文拟对2006年的主要耐药机制研究包括中国的相关研究进展作一回顾。 1 药物主动外排泵结构与作用机制 属于耐药 生节 分裂(resistance nodulation division，RND)家族的药物外排泵已知在大肠埃希菌(如AcrAB

10、TolC)与铜绿假单胞菌(如MexAB OprM)等革兰阴性菌的多重耐药性中起重要作用，这也是过去10余年来细菌多重耐药性机制研究的重点14。RND外排泵系统常由操纵子基因编码，由质膜(内膜)外排泵(即转运体，如AcrB)、膜融合蛋白(如AcrA)及外膜通道蛋白(如TolC)组成，以质子驱动力(H+)为能源外排药物。近年对AcrAB TolC外排系统的AcrB转运体在有无药物底物/配体存在下的蛋白结构的深入分析已开始对外排泵的药物转运功能机制有了具体了解57。 2006年几乎在同一时间两个独立研究小组分别在Nature和Science上发表了根据蛋白晶体结构所获知的类似的外排泵转运药物机制的研

11、究结果，提出了AcrB外排泵与药物底物进行有序结合，使AcrB蛋白的3个原聚体(protomers)分别经历药物“进入(access)”、“结合(binding)”及“泵出(extrusion)”的结构变化，形成了功能复杂的三步骤旋转外排机制或蠕动泵机制(图1I)810。这是药物外排机制研究的最新发展，对认识细菌RND及其它类型药物泵的主动外排机制有普遍意义。2006年另一突破性相关研究是金葡菌多重耐药ATP结合盒(ATP binding cassette，ABC)转运体Sav1866的蛋白结构11。ABC家族的药物转运体是细菌众多药物外排泵的一部分，在形成有临床意义的细菌耐药性方面似乎作用有

12、限1，但是Sav1866转运体与重要的人类多重耐药性蛋白MDR1(P 糖蛋白或ABCB1)有明显的蛋白序列的同源性， I：RND家族大肠埃希菌AcrAB TolC外排系统药物外排机制 (2006年810)，图中上部分显示外排泵AcrB的3个原聚体中处于药物结合(B)和药物泵出(E)状态的2个原聚体，未显示药物进入(A)状态的另1个原聚体， 药物可能是由质膜的周质侧进入泵的结合位点； 图中下部分从横面显示AcrB泵3个原聚体外排药物的3个状态，即药物进入(A)、结合(B)和泵出(E)， 其循环可能形成了以质子驱动力(H+)为能源的泵的旋转外排药物机制810； II：ABC家族金葡菌以ATP为能源

13、的Sav1866多重药物转运体外排药物机制(2006年；详见正文)10,11； III：作为比较，包括了RND家族多重药物泵系统机制的最初模型图(1994年13)。亲水与疏水两性药物分子(图中的黑白菱形)可能分别由质膜内外侧进入转运体(如AcrB)，并通过与辅助连接蛋白(如AcrA)和外膜通道蛋白(如TolC)形成的转运复合体将药物泵至胞外13，14。目前的研究提示药物可能主要由质膜的周质侧进入转运体。 图1 细菌多重药物主动外排泵结构与外排抗菌药物 机制示意图 (改自参考文献811，13，14)而MDR1在肿瘤细胞的多重耐药性中起关键作用。Sav1866由同源二聚体(homodimer)构成

14、，分别由核苷酸结合结构域和跨膜结构域构成，后者则含12个跨膜螺旋区10。晶体结构显示处于外向构象的ATP结合状态时的相互紧靠的两个核苷酸结合结构域，而跨膜结构域则形成可能是药物转运的中央通道腔，该中央腔背面受细胞质膜及其脂双层的屏盖，向外则暴露于胞质以外(图1II)11。类似于AcrB，Sav1866也是在细胞内面存在药物底物的结合位点，并呈现外向的构象变化使药物外排至胞外10，11。 值得一提的是，李显志等1214在研究铜绿假单胞菌多重天然耐药性时于1994年首次提出了RND药物外排泵系统机制模型(图1III)，而在此论文稿12，13的评审过程中曾受到高度质疑，某些审稿者对于细菌药物泵的极广

15、的针对多类化学结构各异的底物特异性或者说“非特异性”的实验结果难以置信15。如 内酰胺类抗生素的作用靶位(青霉素结合蛋白)位于细菌质膜的外侧，且某些 内酰胺抗生素甚至较难跨越质膜屏障，似乎不能用位于质膜的外排泵解释多重药物的耐药性13。但是历经10余年的深入系统研究1，已从外排泵蛋白结构及与抗菌药物相互作用上对药物外排机制有了较深入的认识，并已促使研发药物外排泵抑制剂16，17。 2006年对于已知的药物外排泵又有了新的研究，如对MexAB OprM的调控研究表明该泵的表达除分别独立地受阻遏子MexR(nalB基因型)直接抑制或NalC的间接抑制外1，最近又发现了第二个直接抑制mexAB op

16、rM表达的阻遏子NalD18，表明外排泵调控的复杂性。 迄今为止，已知的上百种细菌的基因文库序列均证实药物外排泵广泛存于各种细菌()。但是，单一的核苷酸序列或蛋白同源比较仅能初步提示药物泵的可能存在与否，而确认具体药物外排泵的表达与功能则要求以分子生物学与生物化学实验进行验证。2006年确证的药物外排泵包括：脆弱拟杆菌的BmeABC19、类鼻疽伯克菌的BpeEF OprC、产气肠杆菌的EefABC20、克雷伯菌的KmrA21、金葡菌的MdeA22、NorC23和SdrM24和单核细胞增生症李斯特菌的MdrL与Lde25等。细菌常同时存在多种药物外排泵系统，但其作用可能不仅是外排药物，而且可能具

17、有非耐药性的功能，这已经受到关注26。 2 喹诺酮类修饰酶与质粒介导的喹诺酮类药物耐药性 产生药物修饰酶如氨基糖苷修饰酶是细菌的重要耐药机制。2006年所报道的喹诺酮类修饰酶介导的对部份喹诺酮类药物的耐药性显然是耐药机制的重要发现之一27。Hooper的实验小组27发现变异的AAC(6) Ib cr氨基糖苷乙酰转移酶具有了更广的底物范围，能修饰灭活氨基糖苷类和喹诺酮类两类化学母体结构各异的药物，但该酶对氨基糖苷类的乙酰化作用仍强于喹诺酮类。这种变异酶是AAC(6) Ib仅发生Trp102Arg和Asp179Tyr两个氨基酸残基改变，介导了对诺氟沙星和环丙沙星的耐药性(MIC增加24倍)。在大肠

18、埃希菌表达时该酶未影响细菌对乙酰环丙沙星、恩氟沙星、培氟沙星、左氧氟沙星及gemiflo xacin(吉米沙星)的敏感性。对313株耐环丙沙星(MICg/ml)及降低了对头孢他啶敏感性的肠道杆菌(主要为大肠埃希菌)分析，发现一半的受检测菌株存在aac(6) Ib基因，其中有28%产生变异的AAC(6) Ib cr，并导致了对环丙沙星的低程度耐药28。喹诺酮类系全合成药物，其修饰酶的发现具有重要的临床意义，aac(6) Ib的变异基因已有30种以上27，设计新型喹诺酮药物应该考虑到潜在的酶修饰灭活机制。 相关的另一重要研究是近年来在世界范围内所证实的质粒介导的喹诺酮耐药性(plasmid med

19、iated quinolone resistance，PMQR)29，30。事实上，上述喹诺酮修饰酶就是在研究上海分离的喹诺酮耐药质粒时所发现27，31。携带qnr基因的喹诺酮耐药质粒于1998年在美国确证，现qnr质粒已在世界范围流行。qnr编码一种属于五肽重复家族(pentapetide repeat family)的蛋白Qnr，其作用机制是保护DNA回旋酶免受喹诺酮药物的作用32。与Qnr蛋白有同源序列的染色体编码的结核杆菌的喹诺酮耐药性蛋白MfpA显示了右手四边形 螺旋结构，类似于B型DNA33。Qnr与传统的染色体介导的耐药机制(即靶位改变和药物外排泵)发挥明显的协同作用29。 李显

20、志曾于2004年结合中国的喹诺酮耐药性讨论了qnr基因的重要意义34，后又于2005年再次强调qnr耐药质粒的严重性29。此后仅1年余间，又有20余篇相关论着的出版。2006年在美国举行的“抗微生物药物与化疗学科间会议(ICAAC)”第46届年会上，已有专题讨论qnr，并有多篇PMQR临床分离菌株报道。依据qnr基因序列与系统分类比较已将Qnr分为3个耐药决定族，即QnrA(QnrA1 5)、QnrB(QnrB1 5)和QnrS(QnrS1 5)30，35。qnr质粒已证实存在于多种革兰阴性菌，包括肺炎克雷伯菌(最先确认菌)、大肠埃希菌、沙门菌、阴沟肠杆菌、变形菌及柠檬酸杆菌等，并分布于美洲、

21、欧洲、亚洲、非洲及澳洲等地区所分离的病原菌中29，30，36。中国的上海、安徽、浙江、湖南、广东、香港和台湾等均有Qnr报道29，3742。令人关注的是，qnr质粒常同时携带整合子、转座子与多重耐药基因决定族，特别是与产超广谱 内酰胺酶(ESBL)的基因相联系，这有助于耐药基因在多类不同药物的选择压力下有效地在同一细菌或不同菌属间水平或垂直传播29，39。此外，已发现同时表达QnrB和QnrS的阴沟肠杆菌(Poirel等. 587)及革兰阳性肠球菌的染色体qnr类似基因介导的天然耐药性(Arsene等.2006. 46th 585)。 3 金葡菌耐药性 金葡菌在全球范围有很高的耐药性发生率，且

22、存在明显的多重耐药性，其相应的治疗选择越来越受限。近年来社区获得耐甲氧西林金葡菌(CA MRSA)更加重了MRSA的危害性43，44。2006年报道了一主要流行于美国、加拿大及欧洲的多重耐药MRSA菌株USA300的全基因序列45，46，揭示了USA300存在社区型菌株具有的Panton Valentine leucocidin(PVL)基因与肠毒素变异基因以及独特的由水平传播获得的可移动基因要素精胺酸分解代谢移动要素(Arginine catabolic mobile element，ACME)，表明普遍存在于表葡菌的ACME已经整合至MRSA。USA300获得的耐药与致病毒性基因无疑增强了

23、该菌的致病力和生存力45。MRSA的进化受到进一步研究47。金葡菌碳源分解代谢蛋白CcpA影响致病和耐药基因的表达，如CcpA突变株减低了MRSA的耐苯唑西林耐药水平48。MRSA的葡萄球菌染色体盒(SCCmec)已分为5型(IV)49，部份由重组酶基因ccrAB或ccrC决定，但巳发现缺乏ccrAB介导的SCCmec基因切除机制的亚型菌株，这有利于稳定染色体耐药基因50。氯霉素与农用的氟甲砜霉素耐药金葡菌携带的质粒介导的fexA或cfr基因也进一步在动物分离株证实51。一因子基因(sigB)或葡萄球菌辅助调控子基因(sarA)可影响葡萄球菌天然的多重耐药性如万古霉素耐药性52。葡萄球菌受环丙

24、沙星或水杨酸诱导后的基因表达也在最近报道53，54，水杨酸可下调药物泵阻遏子基因mgrA及上述sarA阻遏子基因sarR的表达54。 引人关注的是2006年报道的由普拉特链霉菌产生的一种名为platensimycin的新抗生素，它的作用靶位是脂肪酸合成中的 酮酰 酰载体蛋白缩合酶FabF/B，特异性强，对MRSA及耐万古霉素肠球菌有独特的抗菌作用，与其它主要抗菌药物无交叉耐药55。这一报道为目前有限的抗菌药物研制注入了活力，因为人类已面临抗菌药物耐药的危机56，但制药工业界却放弃或减少了对新抗菌药物的研发57。同时我们必须面对这样的抗菌药物研发历史，即大部分临床应用的抗菌药物是在1941196

25、8年间发现的，而过去近40年间仅发现了3种具有新型抗菌作用机制的药物，即口恶唑烷酮类的奈唑酮和脂肽类的达托霉素及上述的platensimycin，前两者分别于2000年和2003年在美国批准进入临床应用，用于耐药金葡菌(包括MRSA或多重耐药株)等革兰阳性球菌感染的治疗5759。 4 鲍曼不动杆菌多重耐药性 非发酵革兰阴性条件致病菌如铜绿假单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌及不动杆菌已成为医院感染的重要病原菌，它们对多类化学结构各异的抗菌药物所具有的高度天然与获得耐药性给其抗感染治疗带来了严重困难1。鲍曼不动杆菌耐药性的研究是近期的研究热点之一。该菌明显的多重耐药性可能与该菌广泛存在于自然界如土壤中有关

26、，后者存在的抗菌物质可使该菌在进化过程中具有了多种耐药机制60。作为典型的条件致病菌之一，尤其可致住院患者的严重感染如医院获得性肺炎，而医院环境中抗生素广泛应用及其它消毒防腐剂均可能有助于获得多重耐药性的形成1，60。 在PubMed文献库用“Acinetobacter”和“Resistance”关键词共检索到约1800篇文献(2006年11月29日检索)，而约有200篇为近1年内所发表，表明不动杆菌耐药性已备受关注，并为2006年的数篇综述所讨论6164。中国也有数十篇相关耐药分离株与耐药机制的研究文献。 2006年初报道了鲍曼不动杆菌多重耐药性的比较基因组学研究65，这一重要结果随即引起学

27、者的关注66，并为深入系统探讨该菌多重耐药性奠定了基础。所研究的多重耐药株AYE的基因文库有52个与耐药性相关的基因，其中7个基因也存在于敏感株SDF，但是该多重耐药株具有额外的86kb的基因区域，含有多达45个耐药基因，被称为“耐药岛”(resistance island)，这是迄今在细菌所发现的最大耐药基因区域，该区域包括了24个对不同类别抗菌药物和16个对重金属盐或季胺类消毒剂的耐药基因等(表1)。基因序列与系统分类研究比较提示多数耐药基因可能源于铜绿假单胞菌、沙门菌或大肠埃希菌。值得关注的是受AdeSR调控的AdeABC外排泵系统1仅存在于多重耐药株，并非位于“耐药岛”区域，提示该系统

28、可能 表1 鲍曼不动杆菌多重耐药株耐药岛的耐药基因* 抗菌药物 耐药基因 编码蛋白与耐药表型 内酰胺类blaOXA 10D类 内酰胺酶，除超广谱头孢菌素以外的 内酰胺抗生素耐药性blaVEB 1A类 内酰胺酶，对除碳青霉烯类以外的 内酰胺抗生素耐药性氨基糖苷类aac3乙酰转移酶，庆大霉素耐药性aac6乙酰转移酶，除庆大霉素以外的氨基糖苷耐药性aadA1核苷转移酶，链霉素与大观霉素耐药性aadDA1核苷转移酶，链霉素与大观霉素耐药性aadB核苷转移酶，庆大霉素、卡那霉素与妥布霉素耐药性aphA1磷酸转移酶，阿米卡星耐药性strA磷酸转移酶，链霉素耐药性strB磷酸转移酶，链霉素耐药性氯霉素cat

29、氯霉素乙酰转移酶，氯霉素耐药性cmlA主要易化因子家族类药物外排泵，氯霉素耐药性cmlA5主要易化因子家族类药物外排泵，氯霉素耐药性四环素tetA (2个复制数)主要易化因子家族类药物外排泵，四环素耐药性tetR (2个复制数)主要易化因子家族类Tet外排泵的阻遏子，四环素耐药性利福霉素arr 2ADP 核糖基化转移酶，利福平耐药性磺胺类sulI (5个复制数)突变的二氢叶酸合成酶，磺胺药物耐药性甲氧苄啶dhfrI突变的四氢叶酸还原酶，甲氧苄啶耐药性dhfrX突变的四氢叶酸还原酶，甲氧苄啶耐药性季胺盐类消毒剂qacE (4个复制数)小多重耐药家族类药物外排泵，季胺盐类等消毒剂耐药性 *：本表资

30、料源于参考文献1，65，66，另有14个与重金属(砷、汞、铅、钴、镉及锌)盐类耐受性相关基因未列入表中。 至少是获得多重耐药性形成机制之一。敏感株与多重耐药株同时存在adeIJK等约近40个可能与药物外排系统结构和调控等有关的基因，其中与RND系统相关的基因24个，这为外排机制的研究提供了重要的信息资料65，目前尚不了解相关基因编码转运体的底物特异性，需要具体的实验研究以了解基因的表达与功能。检测不同基因组的多种不动杆菌已提示AdeABC、AdeDE及新报道的AdeXYZ(即AdeIJK)外排泵系统的分布情况67。采用转座子技术在不动杆菌()筛选到与天然耐药性相关的RND外排泵基因68。 5

31、新型 内酰胺酶 产生 内酰胺酶是革兰阴性菌耐 内酰胺抗生素的主要机制，已报道了400种以上的由质粒或染色体编码的 内酰胺酶，包括传统的OXA、PSE、SHV及TEM型酶与新近发现的酶类型如CTX M、GES、IMP、KPC、LEN、OKP、PER、VEB及VIM等(http: /studies/和)。 内酰胺酶的命名可参阅文献69。耐药菌常可同时表达多种 内酰胺酶70，而且日益增多的酶类已从过去主要分布于医院病原菌开始扩散到社区获得感染的病原菌，给 内酰胺抗生素的应用带来了严重威胁，也导致住院费用与病死率明显提高63。 CTX M型酶是TEM与SHV类以外的最常见的ESBL，在近年来大量出现7

32、1，能明显水解头孢噻肟，如2006年发现的CTX M 4072，但其中某些酶水解头孢他啶的活性更强，如CTX M 5470。2006年报道了在中国香港分离的产CTX M的沙门菌73。OXA型的碳青霉烯酶类也明显增加，其中一些并广泛地分布于铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌74，75。2006年报道了伯克菌科的Pandoraea pnomenusa产生的OXA 6276与黏质沙雷菌SME 3碳青霉烯酶77。沙门菌也可产生ESBL，如TEM 138明显水解头孢噻肟和头孢他啶78。凌保东等研究了从四川分离的阴沟肠杆菌的SHV 70型新酶，与SHV 1比较，该酶因Lue35Gln和Val148Leu变异而形成ESBL，其活性也明显增加79。质粒介导的AmpC是另一备受关注的酶类，不少染色体介导酶的编码基因已经扩散至与整合子或转座