抗氧化活性测定方法.docx

1、抗氧化活性测定方法总黄酮测定方法仪器与设备：1. 恒温混匀仪BG-200 (杭州朗基科学仪器有限公司) 2. 移液枪 (p1000, p200)3. 分析天平（SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220 日本岛津）4. 15150 mm 玻璃试管5. 具塞玻璃试管, 10 mL6. 容量瓶, 1000, 100, 10 mL7. 紫外-可见分光光度计 （UV-1800 日本岛津）试剂：1. 硼氢化钠 (成都市科隆化工试剂厂, NaBH4, FW 37.83, 粉末, 分析纯, 97.0%) 避光干燥保存。 2. 三氯化铝 (天津博迪化工股份有

2、限公司，AlCl36H2O, FW 165,分析纯，晶体, 99.0%)3. 四氯苯醌 (FW245.88,Aladdin Industrial Corporation 中国上海，FW245.88 98%,分析纯)4. 乙醇(EtOH) (成都市科隆化工试剂厂，FW46.07，无水乙醇, 99.7%,分析纯)5. 四氢呋喃 (THF) (广东广华科技股份有限公司，FW 72.11，99.0%,分析纯)6. 冰乙酸 (成都市科隆化工试剂厂, FW60.05, 99.8%,分析纯)7. 盐酸 (成都市科隆化工试剂厂,36.0%-37% w/v, 12 M,分析纯)8. 槲皮素 (国药集团化学试剂有

3、限公司，FW302.24, 98%, 生化试剂 BR)9. 香兰素 (天津博迪化工股份有限公司, FW152.15, 99.0%,分析纯)试剂配制：1. 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 10.0 mM 槲皮素溶液，溶剂为四氢呋喃：乙醇（THF:EtOH）=1:1。配制10 mM 槲皮素标准溶液：准确称取 151.12 mg槲皮素，用上述溶剂定溶至50mL容量瓶。2. 50.0 mM NaBH4 乙醇溶液： 称取189.2 mg NaBH4, 无水乙醇溶解，定容100mL容量瓶。(不宜长期保存; 松开盖子以防炸裂)3. 74.6 mM AlCl3

4、6H2O乙醇溶液 (含有 1% H2O) 称取 1.80 g AlCl3 6H2O, 1 mL 水溶解，加入适量无水乙醇，后定容100mL容量瓶(储存防潮)。4. 20.0 mM 四氯苯醌四氢呋喃溶液称取 491.8 mg四氯苯醌, 四氢呋喃（THF）溶解定容100mL.5. 0.8 M 冰乙酸溶液 称取 4.84g冰乙酸, 蒸馏水定容100mL.6. 16% (w/v, 1052 mM) 香兰素甲醇溶液称取 16.0 g 香兰素, 甲醇定容100 mL.操作步骤：1. 用移液管准确移取0.3、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0mL配置好的10Mm槲皮素标液于10

5、mL容量瓶，用THF/EtOH (1:1, v/v) 溶液定容。用移液枪移取槲皮素各浓度梯度标液1mL或者花椒叶各相浸膏稀释样液（5mg/mL）1mL于玻璃试管中（样液必须现配先用），空白采用THF/EtOH (1:1, v/v) 溶液1mL。2. 含有1mL样液或者1 mL 槲皮素标液的试管中, 加 0.5 mL 50.0 mM NaBH4 溶液，0.5 mL 74.6 mM AlCl3 溶液,后在室温下于红外转子摇床内摇30 min. 再加0.5 mL 50.0 mM NaBH4 溶液，摇30min。3. 加2.0 mL 冰的 (4 C) 0.8 M 冰乙酸溶。避光，试管内溶液晃匀后，摇晃

6、15min。4. 加入1 mL 20.0 mM 四氯乙醌，后于红外转子摇床内，95 C反应60min。5. 反应完全后，自来水冷却。6. 甲醇转出，至少两次，定容具塞试管于4mL刻度线处。7. 加入1 mL 16% 香兰素甲醇溶液， 2 mL 12 M HCl 浓盐酸，混匀后室温 (20-25 C)下避光保存15 min。8. 于490nm下测定吸光度值，每个样液重复三次。9. 数据处理。总黄酮含量表示为: mmol槲皮素/g样品或者浸膏。数据为三组重复的mean SD 。数据处理：1. 标准曲线：黄酮测定标曲制作原始数据：槲皮素标准液浓度mMAbs1Abs200.1670.1690.30.2

7、570.2520.50.320.29210.3910.38820.5520.55540.880.89251.0041.12261.2681.26681.61.597101.9561.959黄酮测定标曲制作原始数据的系统性描述槲皮素浓度mMMeanStd. DeviationStd. Error95% 置信区间MinimumMaximumLower BoundUpper Bound00.168 0.0020 0.0012 0.163 0.173 0.1660.170.30.255 0.0035 0.0025 0.223 0.286 0.2520.2570.50.306 0.0198 0.0140

8、 0.128 0.484 0.2920.3210.390 0.0021 0.0015 0.370 0.409 0.3880.39120.554 0.0021 0.0015 0.534 0.573 0.5520.55540.886 0.0085 0.0060 0.810 0.962 0.880.89251.063 0.0834 0.0590 0.313 1.813 1.0041.12261.267 0.0014 0.0010 1.254 1.280 1.2661.26881.599 0.0021 0.0015 1.579 1.618 1.5971.6101.958 0.0021 0.0015 1

9、.938 1.977 1.9561.959回归方程及标准曲线：用表格内红色数据绘制，绘制时需减去空白溶液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。y = 0.1743x + 0.0387； R2 = 0.9996，X：浓度mM2. 计算公式：大红袍花椒叶不同极性溶液萃取浸膏黄酮含量测定原始数据：ABCDEF标液校正空白Abs10.750.2750.2170.8870.6340.4760.3770.166Abs20.6540.2220.2040.7290.560.530.3720.167Abs30.8070.2250.2460.7770.6680.4380.3750.168黄酮含

10、量（mmol槲皮素/g）=C2V2/C1V1C2= (Y- 0.0387 )/ 0.743 mMV2=显色液的总体积。7mL。C1=样品液的初始浓度。如花椒叶为5mg/mL。V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。7mL。例如：选取上面表格内A1 Abs值0.75减去空白对照吸光度平均值0.167，得0.583，带入黄酮测定回归方程y = 0.1743x + 0.0387得：C2=3.12mM, 计算的黄酮含量=4.37 mmol槲皮素/g。最后的数据均为三次重复的平均值标准偏差。酸性染料比色法测定花椒总生物碱的含量仪器与材料紫外一可见分光光度计(UV-1800 日本岛津)；白屈菜红碱标准品(上

11、海融禾医药科技发展有限公司，FW 348.37，白色结晶粉末， 99.26%)，溴甲酚绿（天津博迪化工股份有限公司，FW 698.02，分析纯）,磷酸二氢钠（天津博迪化工股份有限公司，NaH2PO42H2O, FW156.07，分析纯）磷酸氢二钠（天津博迪化工股份有限公司，Na2HPO412H2O, FW 358.14，分析纯）试剂配制：(1)pH值为76的缓冲溶液的配制：02molLNaH2PO4(130mL)和02moLLNa2HPO4(870mL)，酸度计校正为76。(2)溴甲酚绿溶液的配制称取005g溴甲酚绿加入磷酸缓冲液(pH值=76)，定容至100mL，制得溴甲酚绿缓冲液。(3)标

12、准溶液的配制称取5mg白屈菜红碱样品加入无水乙醇，定容至20mL，制得白屈菜红碱标准溶液(025mgmL)。操作步骤：标准曲线的绘制方法分别吸取1，2，3，4，5mL对照品溶液，置于20mL试管中，加水补至5mL。测定时，各吸取标液1mL（空白采用1mL无水乙醇），依次加入溴甲酚绿磷酸缓冲液1mL和5mL氯仿溶液，振摇1min后，倒入分液漏斗中静置60min，分取氯仿层，在425nm波长下测吸光度值，以生物碱含量（单位：mg/ML）为横坐标，吸光度值为纵坐标，做标准曲线。花椒生物碱含量测定：取花椒叶样液1mL，按照上述标曲方法，依次精密加入溴甲酚绿磷酸缓冲液1mL和5mL氯仿溶液，振摇1min

13、后，倒入分液漏斗中静置1h，分取氯仿层，在425nm波长下测吸光度值。将测得的吸光度值代人标准曲线。数据处理：标准曲线：生物碱测定标曲制作原始数据：白屈菜红碱浓度mg/mLAbs1Abs2Abs300.0650.0640.0640.040.0910.0920.090.080.0950.0940.0940.120.0980.0970.0980.160.10.0990.1040.20.1050.1050.105生物碱测定标曲制作原始数据的系统性描述白屈菜红碱浓度mg/mLMeanStd. DeviationStd. Error95% 置信区间MinimumMaximumLower BoundUpp

14、er Bound00.064 0.0006 0.0003 0.063 0.066 0.0640.0650.040.091 0.0006 0.0003 0.089 0.093 0.090.0920.080.094 0.0006 0.0003 0.093 0.096 0.0940.0950.120.098 0.0006 0.0003 0.093 0.099 0.0970.0980.160.101 0.0010 0.0006 0.096 0.106 0.0990.1050.20.105 0.0032 0.0019 0.103 0.109 0.1040.105回归方程及标准曲线：用表格内红色数据绘制，

15、绘制时需减去空白溶液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。y = 0.0858x + 0.0232；R = 0.9997计算公式:大红袍花椒叶6种洗脱相浸膏生物碱含量测定原始数据：ABCDEF空白1Abs0.230.2940.5020.5470.230.320.1172 Abs0.1960.3040.4950.5580.260.3170.1223 Abs0.1910.2960.4970.5090.2710.320.203生物碱含量（mmol白屈菜红碱/g）=C2V2/C1V1/348.37C2= (Y- 0.0232)/ 0.0858（mg/mL）V2=显色液的总体积（氯仿

16、层）。10mL。C1=样品液的初始浓度。如花椒叶为0.25mg/mL。V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。1mL。例如：选取上面表格内A1 Abs值0.23减去空白对照吸光度平均值0.147，得0.083，带入生物碱测定回归方程y = 0.0858x + 0.0232得：C2=0.697 mg/mL, 计算得生物碱含量=0.08 mmol白屈菜红碱/g。最后的数据均为三次重复的平均值标准偏差。花椒叶中总酚含量测定方法前言：大红袍花椒叶预处理，适当粉碎，称取5g花椒叶粉末， 80%冰丙酮100mL，4，提取30min， 真空抽滤，收集滤液，残渣再次用80%冰丙酮100mL，4，提取30min，

17、抽滤，合并滤液，薄膜蒸发仪旋蒸至粘稠状，80%乙醇溶解，定容100mL容量瓶，-20冰箱保存备用。材料: 试管 50 mL 容量瓶 50 mL 烧杯 125 mL 三角瓶 250 mL 圆底烧瓶 紫外一可见分光光度计(UV-1800 日本岛津) 移液管Pipette 蒸馏水 福林酚 (Sigma F-9252, 2M Acid) 没食子酸一水 (F.W 188.13, 科帮生物) 无水碳酸钠（天津博迪化工股份有限公司, FW 105.99）操作步骤: 1. 福林酚试剂 (FCR): Sigma, F-9252, Lot#:50K5416, 不需稀释。2. 7%碳酸钠溶液(Na2CO3, FW=

18、105.99)称取7g无水碳酸钠，溶解于约25mL蒸馏水中，然后转移到100mL容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度线。3. 将冰冻的样品放到37水浴锅中解冻。4. 准备没食子酸母液及标液母液：称取27.645mg没食子酸（一水），即25mg没食子酸，再用蒸馏水定容到25mL容量瓶中。母液：吸取5mL母液一定容到50mL容量瓶中。设置没食子酸的浓度梯度为0.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0ug/mL。没食子酸梯度标液配制标液浓度 (g/mL)没食子酸母液 (mL)蒸馏水加入量 (mL)0.00.002.0020.00.401.60

19、40.00.801.2060.01.200.80标液浓度 (g/mL)没食子酸母液 (mL)蒸馏水加入量 (mL)100.00.201.80150.00.301.70200.00.401.60250.00.501.7300.00.601.405. 分别吸取200ul的样液（必要时可稀释）或者没食子酸标液（空白采用蒸馏水）于试管中。做三个重复。6. 每个试管中加入800ul蒸馏水，摇匀。7. 再加入200ul福林酚试剂，摇匀，静置6min。8. 分别加入2000ul7%碳酸钠溶液，摇匀。9. 最后加入1600ul蒸馏水，混匀，室温，避光90min，并打开分光光度计预热中。10. 扫描最大吸收波长

20、，在该波长下测定其吸光度。本次实验多酚含量测定在772nm处测定吸光度值。得出标曲的线性方程，计算样品没食子酸当量（mmol/g）。11. 多酚测定标曲制作：数据处理：标准曲线：总多酚测定标曲制作原始数据：没食子酸浓度ug/mLAbs1Abs2Abs300.0970.0960.096200.2220.2220.22400.330.3290.343600.4240.4260.427800.520.5190.5191000.5830.6040.5952001.0731.0781.0742501.2871.2961.2823001.5061.5011.5总多酚测定标曲制作原始数据的系统性描述没食子酸

21、浓度ug/mLMeanStd. DeviationStd. Error95% 置信区间MinimumMaximumLower BoundUpper Bound00.096 0.0006 0.0003 0.095 0.098 0.0960.097200.125 0.0010 0.0006 0.123 0.127 0.1240.126400.238 0.0081 0.0047 0.218 0.258 0.2330.247600.329 0.0021 0.0012 0.324 0.335 0.3270.331800.423 0.0000 0.0000 0.423 0.423 0.4230.42310

22、00.498 0.0111 0.0064 0.470 0.525 0.4860.5082000.979 0.0031 0.0018 0.971 0.986 0.9760.9822501.192 0.0072 0.0042 1.174 1.210 1.1861.23001.406 0.0026 0.0015 1.399 1.413 1.4041.409回归方程及标准曲线：用表格内红色数据绘制，绘制时需减去空白溶液的吸光度值，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。y = 0.0046x + 0.05；R = 0.9994计算公式：大红袍花椒叶6种洗脱相浸膏总多酚含量测定原始数据：ABCDE

23、F标液校正空白Abs10.2490.1310.1470.2650.2370.130.580.071Abs20.2130.140.1310.3280.2370.130.5640.06Abs30.2250.1230.1470.320.2370.131-0.061多酚含量（mmol没食子酸/g）=C2V2/C1V1/170.12C2= (Y- 0.05 )/ 0.0046 mMV2=显色液的总体积。4.8mL。C1=样品液的初始浓度。如花椒叶为0.25mg/mL。V1=加到显色管初始浓度样品溶液体积。0.2mL。例如：选取上面表格内A1 Abs值0.249减去空白对照吸光度平均值0.064，得0.1

24、85，带入多酚测定回归方程y = 0.0046x + 0.05，得：C2=29.35 mg/mL, 计算的多酚含量=16.56 mmol没食子酸/g。最后的数据均为三次重复的平均值标准偏差。P.S.:样品黄酮测定样液浓度多酚测定样液浓度生物碱测定样液浓度样液稀释用溶剂A 乙醇相5mg/mL0.25mg/mL0.25mg/mL无水乙醇B 石油醚相5mg/mL0.5mg/mL0.25mg/mL无水乙醇C 氯仿相5mg/mL0.5mg/mL0.25mg/mL无水乙醇D 乙酸乙酯相5mg/mL0.25mg/mL5mg/mL无水乙醇E 丙酮相5mg/mL0.25mg/mL5mg/mL50%乙醇F 甲醇相

25、5mg/mL0.25mg/mL5mg/mL50%乙醇大红袍花椒叶六种洗脱相成分测定黄酮含量mmol槲皮素/g多酚含量mmol没食子酸/g生物碱含量mmol白屈菜红碱/gA4.270.62a14.112.25b0.050.03cB0.280.24c1.060.52c0.170.01bC0.160.14c1.700.57c0.440.00aD4.750.65a23.350.02a0.020.00cE3.330.44b15.090.00b0.010.00cF2.210.37b2.000.07c0.010.00ci数据均为三次重复的平均值标准偏差, 同一列中，相同字母表示两种洗脱相成分差异不显著。 A

26、BTS法原理：ABTS法最先由Miller等人开创，用于测定生物样品的抗氧化能力。该方法是以ABTS 2 , 2 -azi-no-bis ( 3-ethylbenzthiazoline-6-sulfpnic acid)，即2，2-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）。这种水溶性的自由基引发剂为显色剂。ABTS经活性氧氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+，向其中加入被测物质，如果该物质中存在抗氧化成分，则该物质会与ABTS+发生反应而使反应体系褪色，然后在ABTS+这种自由基的最大吸光波长下(一般选择734nm)检测吸光度的变化，与含Trolox(6-Hydroxy-2,5,7,8

27、-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid)，一种类似于VE的水溶性物质的对照标准体系比较，换算出被测物质总的抗氧化能力，结果多表示为每g测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox的微摩尔数，所以也把该方法称为TEAC ( Trolox equivalent antioxidant capacity)法，也有研究者提出用抗坏血酸作为对照标准，将该方法称为VCEAC或者AEAC法。ABTS+清除率(%)=(AcontrolAtest)*100/AcontrolAcontrol: 对照管吸光值 Atest：待测样品吸光值仪器设备： 50mL锥形瓶 50mL量筒 10mL容量瓶 50mL容量瓶 100mL容量瓶 1000mL容量瓶 分析天平（SHIMADZU PHILIPPINES MANUFACTURING INC. AUY 220） 移液枪（吉尔森，100-1000l） 封口膜 真空泵 抽滤瓶 布氏漏斗 定量滤纸 旋转蒸发仪 紫外-可见分光光度计（UV-1800 日本岛津）试剂： 蒸馏水 丙酮（C3H6O，成都市科龙化工试剂厂，分子量：58.08 g/mol，