基因家族生信分析.docx

1、基因家族生信分析基因家族生信分析一、 什么是基因家族概念：是来源于同一个祖先，有一个基因通过基因重复而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因，他们在结构和功能上具有明显的相似性，编码相似的蛋白质产物。划分：按功能划分：把一些功能类似的基因聚类，形成一个家族。按照序列相似程度划分:一般将同源的基因放在一起认为是一个家族。1.常见基因家族：WRKY基因家族：是植物前十大蛋白质基因家族之一，大量研究表明，WRKY基因家族的许多成员参与调控植物的生长发育，形态建成与抗病虫。NBS-LRR抗病基因家族：是植物中最大类抗病基因家族之一。MADS-BOX基因家族：是植物体内的重要转录因子，它们广泛地调控着植物

2、的生长、发育和生殖等过程。在植物中参与花器官的发育，开花时间的调节，在果实，根，茎，叶的发育中都起着重要的作用。热激蛋白70家族（HSP70）是一类在植物中高度保守的分子伴侣蛋白，在细胞中协助蛋白质正确折叠。二、 基因家族分析流程： 利用蛋白保守域结构提取号在Pfam数据库提取其隐马尔科夫模型矩阵文件（*.hmm） 在数据库（Ensemble 、JGI、NVBI）下载你所需要的物种的基因组数据（*.fa,*.gff） 在虚拟机中Bio-Linux中的hummsearch程序，用隐马尔科夫模型矩阵文件在蛋白序列文件中搜索含有该保守结构域的蛋白 将蛋白序列导入MEGA软件构建进化树（可以阐明成员之

3、间系统进化关系，从进化关系上揭示其多样性） 利用MEME搜索蛋白质的保守结构域利用MEME搜索基因家族成员的motif可以揭示基因家族在物种内的多样化及其功能，如果他们都含有相同的motif表明其功能具有相似性，如果部分家族成员含有其他不同的motif,很可能这些成员有其他特异功能，或者可以归分为一个亚族 绘制基因染色体位置图从*.gff文件中抽取我们搜索到的基因位置信息，_v2.0/ 在线绘制基因染色体位置图通过染色体位置分布，可以了解基因主要分布字哪条染色体上，及是否能形成基因簇（被认为是通过重组与错配促进基因交流） 基因结构分析从gff文件中抽取基因的结构信息，绘制转录本结构图。 计算串

4、联重复基因的Ka,Ks1. 首先将筛选到的基因的cds序列进行多序列对比，筛选identity 75%，tength大于对比的两条序列中较长的那条的长度的75%，将筛选到的基因分别用clustalw进行比对，比对结果导入KsKs_Calculster计算Ka，Ks、Ka/ks比，计算核苷酸的非同义替代（ka）与核苷酸的同义替代（ks）的平均速率。2. Ka/ks比值1,表明这些基因可能已经收到积极选择，有利于适应性遗传，这些受正向选择的基因将作为以后的研究重点。 软件的安装从图片中获得进入NCBI-blast官网复制blast-linux版本的链接在Linux终端1. blast的安装#wge

5、t blast链接#tar xvfz 文件名 解压缩文件# mv 解压缩文件 /root/local/app# mv 解压缩文件 blast# vi .bashrc#在最后一行添加export $PATH=/root/local/app/blast/bin:$PATH 并保存退出#source .bashrc 运行 #blastp -version 查看是否安装成功。2hummer的安装#yum install -y wget /安装wget#wget hmmer源码链接 #tar -zxvf hmmer-3.2.1# vi .bashrc#(在最末端添加的语句) PATH=$PATH:/bi

6、osoft/ hmmer-#yum install -y gcc #./configure#make #make check#make install#which hmmsearch 查看是否安装成功。3.perl的安装#wget 源代码链接# tar xvfz perl- 解压缩#cd perl-5.28.1#./configure#make#make install 安装完成。3.bioperl 的安装#wget -O - | bash#perlbrew install-cpanm#/root/perl5/perlbrew/bin/cpanm Bio:Perl三、 具体操作：1.保守域结构

7、分析下载蛋白保守结构域文件、cds、cDNA、gff注释文件和隐马尔科夫矩阵模型。以拟南芥为例：下载完成后，需要将文件传到Linux系统上进行分析： 打开虚拟机输入ip a将虚拟机IP连接到Xshell上，在Xshell上进行操作，将文件通过xftp（同样需要连接IP）传到Linux系统上，然后进行解压。 (一个命令解压多个文件:gunzip*.gz)接下来用hummsearch寻找含有该蛋白保守结构域的蛋白及核酸序列安装hummsearchyum install -y wget /安装wget#wget hmmer源码链接 #tar -zxvf hmmer-3.2.1# vi .bashrc

8、#(在最末端添加的语句) PATH=$PATH:/biosoft/ hmmer-#yum install -y gcc #./configure#make #make check#make install#which hmmsearch 查看是否安装成功。解压文件移动到APP目录下面在app目录下面新建文件夹 mkdir hmmer将hmmer- mmove -v c:/hmmer-3.2.1 c:/hmmer删除安装包打开文字编辑器vi /.bashrc 在文字编辑器里最后一行添加以上内容安装好wget如果make check出现错误XX用以下方法解决出现complete安装完成#sourc

9、e /.bashrc #which hmmsearch至此hmmer安装完成。虚拟机操作：1.导入下载好的文件；2.hmmsearch -cut_tc domtblout NB-ARC.txt NB-ARC.hmm Arabidopsis_thaliana.TAIR10 可以用editplus打开.txt文件3. perl domain_xulie.pl 结果文件.txt 蛋白序列文件 domain.fa 1e-204.clustalw进行多序列比对，得到aln文件和dnd文件。5.hmmbuild 拟南芥特异的hmm模型文件 domain.aln6.hmmsearch cut_tc domt

10、blout result.txt newhmm文件 蛋白质序列文件7.在Excel中，根据特定的evalue进行筛选，并对第一列进行去重复，得到第一列去重复的id，保存为id.txt8. 用perl脚本根据id提取序列Per get_fa_by_id.pl id.txt 蛋白序列wenjain 结果输出文件可以根据的得到的序列文件进行后续的构建进化树、motif分析等。2.搜索基因家族成员的MOTIF2.1 需要准备的文件 1. 拟南芥NBS基因蛋白质序列 2. 蛋白保守结构域的隐马尔科夫模型矩阵文件2.2 MOTIF的搜索使用meme软件命令：meme nbs_pep.fa -protein

11、 -oc nbs_motif -nostatus -maxsize 600000 -mor anr -nmotifs 10 -minw 6 -maxw 50 搜索结果存放在nbs_motif文件夹中。文件夹中的eps文件可以用AI打开编辑，可以另存为png或jpg格式，也可打开网页版，也可用tbtools软件打开，下载motif在基因上的位置信息。3. 绘制基因在染色体上的位置图3.1 需要准备的文件1. 拟南芥NBS基因id2. 拟南芥的注释文件（gff3文件）3. 拟南芥基因组长度4.1在线绘图工具：MapGene2Chrom4.2 samtools faidx 拟南芥. 可得到拟南芥.

12、该文件包括 各个染色体，染色体长度。4.3 对基因的id文件在Excel中进行分列，去重复处理。4.4 使用处理过的id文件，对拟南芥的注释文件进行筛选使用perl脚本得到基因在染色体上的位置。命令： perl get_gene_gff.pl -in1 基因的id文件 -in2 拟南芥gff3文件 -out 新文件名称 4.5 新文件存放的是基因在染色体上的位置4.6在在线文件MapGene2chrom 中，将基因在染色体上的位置信息文件复制到，input1框中，在input2中粘入samtools得到的fai文件。4.绘制转录本的结构图4.1 需要准备的文件1. 拟南芥NBS基因转录本id（

13、通过家族成员鉴定得到的蛋白id文件）2.拟南芥基因的注释文件（gtf文件）3.在线绘图工具：Gene Structure Display Server 2.0http：/4.2 具体方法1. 准备gtf文件：输入命令：gffread gff3注释文件 -T -o 输出文件（gtf文件）2.editplus 打开gtf文件，去除”transcript:”3. 使用perl脚本提取拟南芥转录本结构信息：命令： perl get_gtf.pl -in1 拟南芥转录本id文件 -in2 gtf文件 -out 输出文件（nbs_gtf.txt）4.通过在线绘图工具，进行绘图。5.筛选出串联重复基因5.1

14、准备文件1.拟南芥NBS基因CDS序列串联重复基因筛选标准【（a）length of alignable sequence covers75% of longer gene,and(b) similarity of aligned regions 75%】参考文献：Extent of gene duplication in the genomes of Drosophila, nematode, and yeast.2.由于筛选时产生的文件较多，因此创建新的目录：mkdir 新目录3.用editplus 打开家族成员的id文件，对转录本id进行处理，使一个基因只拿一个转录本。4.把id复制到E

15、xcel，首先排序处理，然后进行分列，然后以第一列删除重复值。最后将第一列和第二列进行合并。将处理好的id导入Linux。5.使用perl脚本提取cds序列：命令： perl get_fa_by_id.pl id文件 拟南芥cds序列文件 cds.fa6.使用blast软件筛选串联重复基因6.1建立目标序列的数据库：makeblastdb -in cds.fa -dbtype nucl -title cds.fa6.2 进行多序列比对：blastn -query cds.fa -db cds.fa -evalue 1e-20 -outfmt 9 -out result.txt6.3 用edit

16、plus打开6.4 得到cds序列的长度，使用samtools工具建立索引：命令 ：samtools faidx cds.fa6.5 用perl脚本对result.txt进行筛选，perl KAKS_SHAIXUAN.pl -in1 -in2 result.txt -out cleanresult.txt6.6 用editplus打开，将内容复制到Excel，在id后插入一列用公式：if （A1B1,A1&B1,B1&A1）。然后全选，以第C列删除重复值。并保存到新的文件中，并导入到Linux中7. 计算串联重复基因的KaKs。7.1准备文件1.串联重复基因的CDS序列文件7.2 将成对的串联

17、重复序列保存在一个文件中。、方法一：复制需要找到的序列的id，在editplus中按ctrl+F搜索，找到后复制粘贴到一个文件中。方法二：首先将成对的id保存在同一个文件，导入到Linux中，在Linux中，利用perl脚本提取序列：perl get_fa_by_id.pl 新的id文件 cds.fa文件 id1.fa7.3 计算KaKS1.计算之前需要使用CLUSTAW对序列进行比较。可获得id1.aln。2.使用KaKs_calculator工具将id1.aln文件转换成id1.axt文件命令：axtvenvertor id1.aln id1.axt3.计算KaKs，输入命令： KaKs_

18、calculstor -i id.axt -o id1_kaks.txt4.如果报错，则把两条序列长度保持一致。依此将所有的串联重复基因对，进行计算。四基因家族成员的鉴定（未知隐马尔科夫模型）1.鉴定测略在NCBI数据库中尽量多下载几个物种的需要鉴定的蛋白保守结构域序列，以及所要研究物种的所有蛋白序列在虚拟机中本地建库，并进行blast建库命令：makeblastdb -in 研究物种的蛋白序列文件 -dbtype prot -title 库名称进行序列比对 命令： blastp -query 下载的多个物种序列文件 -db 库名称 -evalue 1e-10 -outfmt 6 -out 结

19、构域.blast使用sed 命令去除表头和结尾得到新的 new结构域. blastAwk print$1 new结构域. Blast |less 可查看打印的结果 Awk print$1 new结构域. Blast id.txtcat id.txt|sort|uniq idd.txt去重复Perl get_fa_by_id.pl idd.txt去重复 蛋白序列wenjain 结果输出文件在Pfam或者NCBI的cdd中搜索检查是否有相关蛋白结构域。之后再进行motif分析一些命令及软件应用说明（参考一些视频资料）hmmsearch使用说明用途：利用蛋白保守结构域的隐马尔科夫模型搜索蛋白序列中具

20、有该保守结构域的蛋白用法：hmmsearch -cut_tc -domtblout result.txt *.hmm 说明：result.txt是输出的结果文件，*.hmm在pfam数据库下载的模型， hmmbuild使用说明用途：利用clustalw比对生成的aln文件构建蛋白保守结构域的隐马尔科夫模型用法：hmmbuild new.hmm domain.aln 说明：new.hmm 是结果文件也就是构建的蛋白保守结构域的隐马尔科夫模型，domain.aln是clustalw比对生成的aln文件domain_xulie.pl脚本使用说明用途：提取hmmsearch搜索结果中蛋白序列中保守结构

21、域的序列，用于构建新的物种特异的蛋白保守结构域的隐马尔科夫模型用法：perl domain_xulie.pl（脚本不在使用目录下要写全路径） hmmoutfile domain.fasta E-value说明：hmmoutfile 是hmmsearch搜索结果文件 domain.fasta是结果存放文件也就是蛋白序列中保守结构域的序列，E-value 是提取序列时设定的E值get_fa_by_id.pl使用说明用途：通过ID号获取其相应的基因或蛋白序列用法：perl perl get_fa_by_id.pl id.txt cds.fastat id_cds.fasta 说明：id.txt是包含

22、你的ID的文件，cds.fasta是你丛数据库中下载的包含所有cds序列的文件，id_cds.fasta是输出文件内容是ID对应的序列samtools faidx 用途：提取fasta文件信息用法：samtools faidx *.fa说明：输入文件是fasta文件，自动生成输出目录*.fa.fai,结果的fai文件第一列是你输入的fasta文件的ID第二列是其序列长度Gffread 使用说明用途：将基因组注释文件gff3转化成基因的注释文件gtf用法：gffread my.gff3 -T -o my.gtf说明：my.gff3是输入文件基因组注释文件，my.gtf是输出文件是基因的注释文件G

23、et_gene_gff.pl用途：想要绘制基因的染色体位置图必须要拿到基因在染色体上的具体信息，该脚本就是从总的gff文件抽去你需要的基因的信息如：所在染色体，起始终止位置等信息用法：Perl Get_gene_gff.pl -in1 gene_id.txt -in2 my.gff3 -out gene_location.txt说明：gene_id.txt 是第一个输入文件基因的ID文件，my.gff3是第二个输入文件是物种基因组所有蛋白序列 ，gene_location.txt 是结果输出文件Get_gtf.pl脚本使用说明用途：从基因注释文件gtf文件中提取转录本的结构信息用法：perl

24、get_gtf.pl -in1 id.txt -in2 gene.gtf -out structure.txt说明：id.txt 是第一个输入文件是id文件 ，gene.gtf是第二个输入文件是基因注释文件gtf文件 structure.txt是结果输出文件存放着转录本的结构信息KaKs_shaixuan.pl 使用说明用途：在多序列比对结果文件中筛选identity大于75%，比对上的序列长度大于对比的两条序列中最长序列的长度的75%用法：perl KaKs_shaixuan.pl -in1 cds.fai -in2 result.txt -out shaixuan.txt说明：cds.fa

25、i 是samtools faidx 对cds的序列文件fasta作用，生成的文件，result.txt 是拿cds进行多序列比对得到的结果，shaixuan.txt 是筛选后的结果存放的文本aln文件转化 axt文件命令：/home/manager/share/KaKs_Calculator2.0/KaKs_Calculator2.0/src/AXTConvertor tong.aln tong.axt 说明： 红色部分是KaKs_Calculator软件存放的位置（可变部分，放在那个路径就写全路径），蓝色部分是AXTConvertor工具在KaKs_Calculator的路径是不变的，ton

26、g.aln文件是输入文件是序列比对生成的文件， tong.axt是结果文件，用来计算KAKS。（注：KaKs_Calculator软件存放在参考资料部分，是压缩文件，解压即可使用，不需要安装）计算KAKS命令：/home/manager/share/KaKs_Calculator2.0/KaKs_Calculator2.0/bin/Linux/KaKs_Calculator -i tong.axt -o kaks1.txt说明：tong.axt 文件是输入文件，kaks1.txt是结果文件，存放同源基因的kakscircos.pl 脚本使用说明用途：生成绘制圈图的配置文件用法：perl circos.pl -chr Arabidopsis_ -circle link.txt -type link -circle text.txt -type text -od circose1说明： Arabidopsis_，link.txt 存放同源基因对的位置信息，text.txt 存放同源基因的位置信息，od 是结果输出的文件夹绘制circos图命令：/biosoft/circos/circos-0.69-6/bin/circos -conf circos.conf 说明：circos.conf是circos.pl 脚本结果目录下的conf文件，评语：