苏云金芽孢杆菌研究与展望.docx

1、苏云金芽孢杆菌研究与展望苏云金芽孢杆菌的研究与应用赵鹏 徐瑞 华中农业大学生命科学技术学院摘 要苏云金芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，全文概括了苏云金芽孢杆菌的发现史、分类及特殊环保的杀虫机理，它是当今使用最多和最广泛的生物杀虫菌，被广泛应用于农业、林业等病虫害的防治，开创了微生物农药在防病、防虫方面的里程碑。本文总结在这些领域应用的进展、存在的问题及现阶段解决这些问题的方法，并对苏云金芽孢杆菌的应用前景进行了展望。关键词苏云金芽孢杆菌；杀虫机理；应用；Bacillus thuringiensis Research and Application AbstractSome bacillus is gr

2、am-positive bacterium, the full text summarizes some bacillus discovery history, classification and special environmental protection of the insecticidal mechanism, it is the most widely used and the most extensive biological insecticidal bacteria, which has been widely used in agriculture and forest

3、ry pests such as the prevention and control of the microbial pesticides, initiated in preventing, insect-resistant aspects milestone. This paper summarized the progress of application in these fields, the existing problems and the ways to solve these problems, and some bacillus application prospect.

4、KeywordBacillus thuringiensis Bt；Insecticidal mechanism；application；前 言随着人们的环保意识不断增强，生物农药正在引起越来越多的关注。近年来，生物防治研究进展速度明显加快，世界各国对此项研究也十分关注。新型微生物农药作为无公害农林生产资料，在未来的农作物病虫害防治方面将有巨大的市场需求。进一步加快微生物农药的研制、产业化和推广应用进程，降低农药在农副产品中的残留和对农田生态环境的污染，实现农作物重大病虫害的可持续控制，必将产生巨大的社会、经济和生态效益。从总体看，目前我国的微生物农药研究开发已经具有一定的生产规模。从品种分类来

5、看，各类品种的研究开发所达到的层次和规模差异较大。随着微生物农药研究的深入和应用技术的发展，微生物农药的种类和数量越来越多，市场份额将会不断扩大，在有害生物防治中的作用也越来越大。而在微生物农药中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是世界公认的生产规模最大、应用最广泛、最有前途的微生物农药，它在微生物防治害虫的实践中，占有极其重要的地位。它是世界目前运用最为成功的微生物杀虫剂。随着分子生物学理论及其技术的成熟和发展，苏云金芽孢杆菌的相关研究更加广泛而深入，苏云金芽孢杆菌的独特作用也得到了进一步的发挥。1苏云金芽孢杆菌（Bt）的发现及种类1.1苏云金芽孢杆菌（B

6、t）的发现 苏云金芽孢杆菌1901年日本学者石度繁从患猝倒病的家蚕幼虫中分离到第1个产生晶体的芽孢杆菌。10年后Berliner从德国苏云金地方一家面粉厂染病的地中海粉螟中分离到一个相似的菌株，并正式定名为苏云金芽孢杆菌（Bt）。4年后，一个叫克林诺的科学家发现，在这种细菌的细胞中可以形成方形或菱形的晶体，可惜这个发现并未被重视。直到40年后的1953年，一位叫汉纳的生物学家证明了这种晶体是有毒的蛋白质晶体，才揭示了粉螟死亡的原因。在19201930年间，Bt作为微生物杀虫剂主要用来防治玉米螟。1938年第1个商品制剂Sporeine在法国问世，从此拉开了生物杀虫剂的序幕。以后相继发现了对鞘翅

7、目、螨类、同翅目、膜翅目、直翅目昆虫、动植物寄生线虫、鞭毛虫、变形虫、吸虫、绦虫有毒杀作用的Bt菌株。进一步的研究发现，Bt是革兰氏阳性菌，另外，它可寄生在一些蛾类和蝶类的幼虫上，甚至是植物表面。 苏云金芽孢杆菌分泌出的由Cry基因编码的、有杀虫活性的-毒素（或被称为杀虫晶体蛋白）的蛋白结晶构成了内孢子。Cry蛋白对鳞翅目（如蛾与蝶）、双翅目（如苍蝇、蚊子）和鞘翅目（甲虫）有很大杀伤力。因此，可将苏云金芽孢杆菌发酵生产制成高效生物杀虫剂，或用Cry基因制成防虫害的转基因产品。1.2苏云金芽孢杆菌的分类 苏云金芽孢杆菌是一种自然界广泛分布的好气芽孢杆菌，革兰氏染色阳性，在伯杰氏细菌鉴定手册第九版

8、中被列为第二类第十八群的芽孢杆菌属中的一个种，主要特性在于形成芽孢的同时在菌体内形成具有蛋白质性质的一个或多个伴孢晶体，这是苏云金芽孢杆菌区别于其近缘种一蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus，Bc)最重要的特征。随着苏云金芽孢杆菌类似的新品系和新菌种逐渐被分离发现，各种种内分类方法被相继提出，并将该菌区分为不同的亚种、变种、血清型、生物型、致病型及晶体型。这些方法包括生化试验法、晶体抗原法、酯酶法、噬菌体法等，但迄今被普遍接受和采用的是由de Barjac和Bonnefoi提出的根据鞭毛抗原(H-抗原)的特异性而划分为不同的血清型，再区分为不同亚种的方法。随着生物技术的发展，人们尝试将

9、多种分子生物学手段用于苏云金芽孢杆菌的分类，如16srDNA、多位点酶电泳、随机引物PCR的DNA指纹图谱、限制性片段长度多态性等。2苏云金芽孢杆菌的主要活性成分与杀虫机理2.1苏云金芽孢杆菌的主要活性成分2.1.1伴孢晶体伴孢晶体又称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，是苏云金芽孢杆菌的主要成分。ICPs又称-内毒素(-endotoxin)，由于该基因产物绝大部分形成晶体(crystal) 所以又称cry基因，而且基因类型同杀虫活性关系密切，通过鉴定菌株的ICPs基因类型可以预测其杀虫活性，同时对于发现新基因、新杀虫谱具有重要意义，因此ICP

10、s基因类型的分类和鉴定越来越受到重视。2.1.2苏云金素苏云金素(thuringiensin)又称-外毒素，是在苏云金芽孢杆菌生长过程中被分泌到细胞外，且对蝇类毒力很高，又被称蝇因子。它的杀虫活性比ICPs还广，对人及哺乳动物都有一定的毒性，其毒性大小取决于体内吸收比例和体内酶将其脱磷成无毒产物的程度。由于去磷酸的苏云金素无毒，通过结构修饰制备对昆虫毒力更高。对人畜安全的苏云金素衍生物已引起了科研人员的重视。2.1.3芽孢芽孢(spore)是苏云金芽孢杆菌生长到一定阶段形成的一种结构，是营养细胞的休眠体。苏云金芽孢杆菌芽孢可以单独或通过晶体对昆虫起毒性作用，其致病作用至少有2个因素：一是芽孢衣

11、蛋白质具有类似ICPs毒素的作用，二是芽孢萌发成营养细胞具有穿透昆虫肠壁的能力。2.1.4肠毒素肠毒素(enterotoxin)是根据Bc能产生肠毒素而发现的，因为与Bc有紧密关系，因此苏云金芽孢杆菌肠毒素与Bc肠毒素也有高度的相似性。到目前为止，已发现有无溶血肠毒素(nonhaemolytic enterotoxin，NHE)、溶血肠毒素(haemolytic enterotoxin，HBL)和腊状芽孢杆菌毒素(Bacillus cereustoxin，bceT)3种肠毒素，除肠毒素HBL外，其余均无溶血活性。Gaviria et. al(2000)对24种血清型74株菌株的检测，发现NHE

12、的分布频率高达100。2.1.5营养期杀虫蛋白营养期杀虫蛋白(vegetative insectical proteins，Vips)是苏云金芽孢杆菌在营养期产生的一种非晶体的杀虫蛋白。Vips主要分为Vip1、Vip2、Vip3等3种。Vip1和Vip2构成二元毒素，对鞘翅目叶甲科的昆虫具有杀虫特异性；而Vip3对鳞翅目昆虫具有广谱的杀虫活性。Vips是以与ICPs相类似的方式产生致病作用，即主要是通过与敏感昆虫中肠上皮细胞受体结合，使中肠溃烂而使昆虫死亡，但二者作用机理不同：ICPs是与受体结合，导致昆虫膜穿孔引起昆虫死亡；Vips是与受体结合诱发细胞凋亡，这为筛选新的杀虫活性物质提供了新

13、的思路。Vips对一些ICPs不敏感的昆虫(如甜菜夜蛾、小地老虎、草地贪夜蛾、烟蚜夜蛾等)具有极强的杀虫活性。2.1.6双效菌素双效菌素双效菌素双效菌素(zwittermicin A，ZwA)是在苏云金芽孢杆菌发酵过程中产生的一种氨基多元醇类化合物，在中性和酸性条件较稳定，碱性条件下易水解。ZwA单独存在时杀虫活性很低，与苏云金芽孢杆菌其他活性物质混合使用具有很高的增效作用，对夜娥科昆虫效果尤为显著。Broderick等(2000)研究证实，纯ZwA对Gypsy moth几乎没有致死作用，而加有0.65IU的苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种菌剂时LD95为9.4ng，加至10ng时致死率已达100。

14、ZwA不仅能增强苏云金芽孢杆菌的杀虫效果，而且还能延缓害虫的抗性发生。此外，它还具有抑制疫酶和腐酶的生长作用。2.2苏云金芽孢杆菌的杀虫机理苏云金芽孢杆菌的杀虫机理主要是利用其芽孢和毒素。苏云金芽孢杆菌在菌体的一端形成芽孢，另一端形成近菱形的蛋白质晶体即伴孢晶体。这些晶体蛋白本身并无杀虫作用，他只是毒素的前体。而这种活细胞及伴孢晶体对环境无毒无害。因为在动物的胃肠道内，酸性环境下蛋白质晶体不能溶解，从而对人畜无害。所以它是一种高效安全的生物杀虫剂，可用来杀灭多种农作物害虫。昆虫取食苏云金芽孢杆菌后，杆菌在其胃肠道内产生蛋白质晶体内毒素（-内毒素）、热稳定毒素（-外毒素）、叶蜂毒素（-外毒素）及

15、Bt-外毒素。这些毒素能侵蚀昆虫肠道细胞，破坏肠道内膜，并进入血淋巴组织，使害虫因饥饿而出现败血症最后死亡。苏云金芽孢杆菌的防治对象是鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目等多种害虫，其药性的持效期可达710d左右。需要特别注意的是：苏云金芽孢杆菌（Bt）及其制剂对蚕具有很高的毒性，桑园必须禁用。另外，勿与碱性杀菌剂混合施用，晴天的傍晚或阴天施药效果最佳。 3苏云金芽孢杆菌在农林业上的主要应用3.1用苏云金芽孢杆菌防治棉铃虫1990年，中国农科院与江苏省农科院合作，成功地将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白基因导入大面积推广的棉花品种中，证明已获得转基因抗棉铃虫棉植株。许提森9通过初步比较LY3o和HD-1茵

16、株的形态特征、生理生化特性，并采用生物测定的方法，比较它们对棉铃虫初孵、二龄、三龄幼虫的毒效差异。发现LY30茵株对棉铃虫三龄以下的幼虫具有高毒力。Kong-Ming Wu10等对中国北方六个省的抗虫棉种植情况做了10年的跟踪调查发现，抗虫棉不仅能够控制棉铃虫及其对其它作物的侵害，而且能够总体上减少杀虫剂的使用量。3.2用苏云金芽孢杆菌防治水稻稻纵卷叶螟稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guen6e)是我国水稻上的主要害虫，近年特别是在广西和湖北一带等地受害较为严重，水稻受害后，一般减产12成，严重时减产达3成以上。董兰11选用阿维菌素 2乳油和苏云金杆菌 8000

17、 IUmg可湿性粉剂进行防治稻纵卷叶螟田间试验。药后13d调查结果表明，使用阿维菌素 2乳油 2030mL667m 和苏云金杆菌8000 IUmg可湿性粉剂 200g667m 防效均在90以上。阿维菌素 2乳油 3Om/667m的防效与生产上常用的有机磷类农药毒死蜱480g/mL油常用剂量的防效无显著差异。它是防治稻纵卷叶螟的理想替换农药，可和其他农药轮换使用，以延缓稻纵卷叶螟对单一农药的抗药性。因而是防治稻纵卷叶螟的理想替换农药。3.3用苏云金芽孢杆菌防治杨树食叶害虫近年来，随着杨树纯林面积的扩大，杨树病虫发生也呈上升趋势。目前，杨树食叶害虫主要有杨扇舟蛾、杨小舟蛾、杨黄卷叶螟等。以往防治杨

18、树食叶害虫通常使用一些常规的化学农药，为提高防治效果，保护生态环境，推行生物防治，俞先俭12等选用苏云金杆茵制剂森得宝可湿性粉剂进行防治杨树食叶害虫(杨扇舟蛾)试验，结果表明，森得宝对杨树舟蛾防效好，且对杨树嫩梢不产生药害，建议大面积推广应用，用药浓度以10003000倍液为宜4苏云金芽孢杆菌在动物疾病防治上的主要应用4.1用苏云金芽孢杆菌防治细菌引起的感染性疾病日本学者Yudian T F等(1992)发现一些苏云金芽孢杆菌产生的内毒素对微球菌、葡萄球菌、诺卡氏菌属、链霉菌的生长有一定的影响。目前，苏云金芽孢杆菌ssp.emomocidus HD9、苏云金芽孢杆菌 ssp.israelens

19、is B2395、苏云金芽孢杆菌 BMG1.7和苏云金芽孢杆菌 strain B439等4种杀菌株的杀菌、溶菌、抑菌作用得到了较深入的研究。这些菌株的抗菌作用是通过分泌到胞外的细菌素来实现，其抗菌活性在生长对数期中期开始，到生长静止期初期达到最大。Cherifi A等(2003)报道苏云金芽孢杆菌 ssp.entomocidus HD9对革兰阳性菌如单核细胞增多性李氏菌、致病性假单孢菌、铜绿菌和一些真菌类有杀死细菌和使生长期的细胞溶解的活性，其活性物质为12.4kD的蛋白质，pH 3.9活性稳定、经蛋白酶K处理活性消失。CherifA等(2001)证实苏云金芽孢杆菌 BMG1.7所产生的毒素不

20、仅对其他几种苏云金芽孢杆菌有拮抗作用而且对金黄色酿脓葡萄球菌和单核细胞增多性李氏菌属有抑制作用，其活性蛋白相对分子量为11.6kD，具有耐热的特性。Manasherob R等(2003)发现苏云金芽孢杆菌以色列亚种产生的Cyt1Aa细胞毒素可诱使希氏杆菌属大肠杆菌的类核物质在细胞中央凝结，而且凝结效果比氯霉素所引起的类核物质的凝结更明显。4.2用苏云金芽孢杆菌研制热稳定性禽流感口服疫苗刘梅等(2007)利用苏云金芽孢杆菌具有很强热稳定性及对畜禽无毒性的优点，通过建立苏云金芽孢杆菌细胞表面展示系统，即将AJ基因与S一层蛋白(Surface layer protein)融合后，AI病毒NP蛋白展示

21、到受体菌株表面，从而开发出活菌疫苗。该热稳定性AIV苏云金芽孢杆菌重组口服疫苗在对小鼠的实验中，表现较强免疫原性。4.3用苏云金芽孢杆菌防治动物血吸虫病周艳琴等(2005)已筛选出了对日本血吸虫童虫、成虫有杀灭作用的苏云金芽孢杆菌菌株，而目前治疗血吸虫病的主要药物吡喹酮对3d、7d、14d日本血吸虫童虫没有治疗效果，苏云金芽孢杆菌在防治日本血吸虫童虫方面显示出了巨大优势。周艳琴等(2007)通过苏云金芽孢杆菌引发的血吸虫超微结构改变，来阐述其对血吸虫的作用机理苏云金芽孢杆菌。研究发现苏云金芽孢杆菌引发血吸虫表皮的各种变化，包括基质空泡化，褶嵴肿胀粘连，基膜和环肌肿胀，杆状分泌小体和指环体减少，

22、感觉结构坏死，环肌溶解；而苏云金芽孢杆菌伴孢晶体毒素引起鳞翅目昆虫肠上皮细胞的变化主要是细胞肥大，微绒毛膨胀，内质网、细胞核、线粒体相继出现病变，这提示苏云金芽孢杆菌对血吸虫的作用机理，显然不同于其对昆虫幼虫的机理。5苏云金芽孢杆菌存在的问题苏云金杆菌制剂作为微生物农药，要取代化学农药，除了依靠人们生态意识的提高，更要从技术上达到高效价、低成本、规模化，从选育菌种、降低培养基成本、提高发酵控制水平、减少后处理过程中毒效损失等各环节优化5.1杀虫效果受环境影响；比如在15摄氏度以下不宜使用，阳光中的紫外线能使伴孢晶体杀虫蛋白失活。如果温度不理想，就可能降低毒素的产生，使植物易受侵蚀。更加严重的是

23、，试验证明毒素减少的晚季植物会形成启动子的DNA 甲基化。另外，毒素的持续使用会使普通害虫演化为抗性虫。5.2杀虫具有局限性；各种Bt菌株仅对其敏感的昆虫有效，杀虫具有局限性，一株菌种生产的杀虫剂一般不能防治多种虫害。5.3昆虫逐渐产生可遗传的抗性；毒素的持续使用会使普通害虫演化为抗性虫。试验发现，小菜蛾对苏菌毒素的喷雾形式就已产生抗性。 5.4必须要经过吞食杀死昆虫；必须要经过吞食过程进入昆虫体内才能杀死昆虫；从而很难杀死钻入植物体内和根部的害虫，并只能在昆虫发育的某一阶段才有好的效果。 5.5 苏云金毒素的运用可能的危险；苏菌毒素的运用还有一些可能的危险，如：如果转基因玉米与变异野草杂交，

24、苏菌基因的抗性就有可能因食物链来到食草动物群落中，蜂群衰竭失调（CCD），也可能跟苏菌转基因作物有关。 6解决的基本思路 6.1添加防紫外线破坏保护制剂；苏云金芽孢杆菌制剂直接与适量化学紫外线吸收剂混合，即可取得防护效果。苏云金杆菌制剂中加入木质素及蔗糖溶液，可以防止紫外线的伤害，提高产效期。6.2有抗植株与无抗植株间种；减少害虫抗药性的一个有效方法就是将有抗植株与无抗植株间种，目的是减少抗性基因频率，牺牲少量无抗植株保证产量。美国和欧洲的某些区域已经立法要求使用上述方法种植。这种方法的理论依据是假设抗性基因是隐性的。依目前来看，这种方法应该可以延迟害虫对苏菌的抗性；另一方面，假如产生了多种苏

25、菌毒素的农作物可以完全灭绝害虫，抗性基因的存在也就不可能了。不过，至今为止，害虫灭绝的情况还未出现。 6.3通过接合构建新菌株；苏云金芽孢杆菌菌株的特定质粒可以自行转移，这些质粒可以通过接合来构建新菌株。例如，科罗拉多马铃薯甲虫（鞘翅目）是北美最具破坏性的马铃薯害虫，欧洲玉米螟和土豆块茎蠕虫，对马铃薯也有很大的破坏作用。从自然界中分离的苏云金芽孢杆菌菌株，没有一个菌株对所有这些昆虫都具毒性。然而，通过质粒转移杂交，现在已经构建出对3种害虫都有效的新菌株，田间试验表明，该菌株作为广谱的马铃薯杀虫剂很有前途。7展望 微生物农药是21世纪农药工业的新产业，代表着植物保护的方向，其最大的优势在于能克服

26、化学农药对生态环境的污染，并减少农药在农副产品中的残留量。同时，在推广微生物农药应用过程中，农副产品的品质和价格将大幅度上升，有力地促进农村经济增长和农民增收，社会效益不可估量。为了更好地落实科学发展观，建立环保型、节约型农业，微生物农药将为农产品优质安全生产和降低有毒物质残留提供技术和物质保证。微生物农药研究与发展，将有效地实现农产品的优质安全生产，提升农产品的经济附加值，扩大我国农副产品外销市场，推进绿色产业的发展。所有这些均对发展农村经济、增加农民收入、促进农村繁荣具有重要的推进作用。 参考文献 1 喻子牛；苏云金芽孢杆菌M.北京：科学出版社，1990. 2 蔡鸿娇，侯有明，尤民生；应用

27、Bt控制鞘翅目害虫的研究现状J.武夷科学，2002（1）：259-265. 3 吴继星；苏云金芽孢杆菌的抗药性研究J.微生物学杂志，1992（1）：60-61. 4 谢道昕，范运六；苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因导入棉花获得转基因棉株J.中国科学（B辑），1991（4）：367-363. 5 袁志明，蔡全信，Andrup L，等；苏云金芽胞杆菌肠毒素基因的PCR检测J.微生物学报，2001，41（2）：14. 6 金莉莉，王秋雨；ERIC-PCR技术鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌J.中国公共卫生，2003，19（7）：879. 7 金莉莉，王秋雨，侯萧；ERIC-PCR技术在李斯特氏菌种、菌株鉴

28、定中的应用J.遗传，2003，25（2）：195-197.8 戎志梅；生物农药的现状、发展与展望D，化工科技市场，2002，（04）9 胡远杨；苏云金杆菌应用最广的生物农药N;中国化工报；2000年10 张丽萍，张云贵；微生物农药研究进展J；北京农业科学；2000年04期11 黄知源；生物农药及其在我国的发展简况J；北方蚕业；2001年03期12 朱玮,赵兵,王晓东,王玉春;生物农药苏云金芽孢杆菌的研究进展；过程工程学报; 2004年03期致 谢本文是在徐锐老师的精心指导和大力支持下完成的，此过程都凝聚着老师大量的心血和汗水。徐老师渊博的学识，创新的思维，严谨的治学作风，忘我的工作热情，严于律

29、己的风范，使我深受启迪并终生受益。三年来，恩师对我的悉心教诲和关怀将永远铭记于心，在此谨向老师表示最诚挚的谢意!衷心祝愿老师们永远健康快乐!感谢汤文浩主任在我写论文过程中给予的支持和帮助。他在我的学习和生活中给予了大量无私的支持和帮助，在此表示衷心的感谢，祝愿他美满幸福!最后，我要对关心、帮助我的父母家人表示衷心地感谢，正是他们的理解、关爱、鼓励和支持，才使我在困难面前坚持不懈，顺利地完成学业!衷心地祝愿他们身体健康，永远快乐!感谢我最亲爱的同学们来对我学习，生活，工作的关心和帮助。感谢支持我们自考生的所有老师们，是你们的辛勤而不求回报工作换来了我们的成长，再次请允许我献上最真挚的感谢和最真诚的祝福。感谢各位专家评审在百忙中抽出时间对本论文进行评审指导。最后，感谢华中农业大学自考学院对我的激励，愿母校一切蒸蒸日上，桃李满天下！谨以此文献给在我成长过程中所有给予我关心和帮助的人们。