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1、发育生物学的主要内容发 育 生 物 学第一章 序 言一、引言发育生物学是一门研究生物体从精子和卵子的发生、受精、胚胎发育、生长到衰老、死亡的规律的科学。1、后成论(epigenesis)和先成论(preformation)Preformation:生物体的各个组成部分存在于胚胎中，随胚胎发育而长大。Epigenesis: 胚胎的各个部分是在发育中逐渐形成的。2、细胞学说改变了胚胎发育和遗传的概念19世纪有关的重要发现和理论：细胞、生殖细胞、细胞核、染色体、3、Mosaic and regulative developmentMosaic development: 合子核中的特殊因子在细胞分裂中

2、的不均等分裂导致不同细胞的产生，这些细胞有各自的发育命运。Regulative development: 胚胎在局部被排除或受损后仍能正常发育。4、诱导(induction)现象的发现1924年，Spemann和Hilde Mangold发现一种组织能够指导另一种组织的发育。5、遗传学和发育学的结合1909年Wilhelm Johannsen提出基因型和表现型的概念，使遗传学和胚胎发育学 首次发生关系；40年代进一步认识到基因在发育中的决定性作用。二、发育生物学研究中的主要动物模型(一)、 Invertebrate models1. Drosophila melanogaster (fruit

3、fly) -insect model2. Caenorhabditis elegans (nematode)- worm model(二)、 Vertebrate models1. Xenopus laevis (Africa frog) - Amphibian model2. Chick- bird model3. Mouse- mammalian model4. Zebrafish - fish model三、发育生物学中的基本概念及规律(一)、五个主要的developmental processes1. Cell division: 早期胚胎发育中的细胞分离不同于后期。2. Patter

4、n formation: 指胚胎形成有序的结构。三条轴线的形成：AP axis; D - V axis; L - R axis; 三个胚层的形成：endoderm(肠、肝、肺)， mesoderm (肌、骨、心、肾)， ectoderm (神经系统和表皮)。3. Morphogenesis:胚胎的立体形态发生显著改变的过程。4. Cell differentiation:同一来源的细胞发展为结构和功能不同的细胞。5. Growth：胚胎在基本的pattern形成之后在体积上显著增加，原因包括细胞数量的增加、细胞体积的增加、胞外基质的增加。(二) 、细胞行为是基因作用与发育进程之间的桥梁即基因影

5、响细胞行为、细胞行为影响发育。主要的细胞行为包括：1. Cell state: 指基因的活性状态。2. Cell-to-cell signaling: 一种细胞产生某种信号物质，而另一种细胞接受该信号而调整 其行为。3. Cell-shape changes/Cell movement: 细胞通过形态的改变及运动产生机械动力， 以形成特殊的构造。4. Cell proliferation: 细胞因 分裂而增加数量，但在躯体的不同部位细胞增生的速度不一，从而也可影响整体结构。5. Cell death: 在特定发育时期，特定部位的细胞的死亡是形成正确结构所必须的。(三) 、基因控制细胞行为是通过

6、控制细胞中的蛋白质的合成来实现的两 类 蛋 白：house-keeping proteins and tissue-specific (luxury) proteins蛋 白 合 成 控 制 点：tanscription, processing of primary transcripts,transportation of mature RNA, translation, posttranslational modification, etc.(四)、发育是渐进式的，细胞的命运决定于不同的发育时期三个胚层的形成 各胚层内细胞的分化描述细胞分化程度的几个概念：Fate of cells：指在正

7、常情况下细胞会分化、 发育为什么；Determination, 指细胞的内部状态已发生不可逆的改变；specification：指一组细胞在中性环境下立体培养，它们仍按其正常命运图谱发育。胚胎细胞的分化潜力随发育深度而异。胚胎细胞的分化潜力因不同物种而异。(五)、诱导作用可使细胞互为不同诱导作用的证据：蝾螈的organizer移植实验。诱导信号的传递方式：胞间隙中自由扩散、细胞表面分子的直接互作、胞间 膜通道的利用。诱导信号的传递距离是有限的。不同细胞对同一诱导信号的反应是不同的。(六)、Patterning常常涉及位置信息(positional information)的翻译一些信号分子和转

8、录因子(morphogen)沿一定的方向形成一个浓度梯度，处于 不同浓度下的细胞获得不同的发育命运。(七)、间距模式 (spacing pattern)可以通过侧向抑制作用产生当一组细胞具有具有相同发育方向时，其中的一个细胞的分化能抑制其相邻细胞的分化。e.g., feather, neurons.(八)、 胞 质 决 定 成 分 的 区 域 化 及 细 胞 的 不 对 称 分 布 也 使 细胞 具不 同 个 性四、控制发育的基因的克隆及其表达与功能的检测方法(一)、寻找控制发育的新基因的主要方法1、从自然突变体或人工产生的突变体中克隆控制发育的基因 产生突变体的方法：自然突变体；化学诱变剂(

9、如亚硝基乙脲乙亚硝 基脲)； 外源DNA插入：DNA注射、 病毒侵染、转座子利用等；X-射线或r射 线照射。突变体的种类：隐性突变；半隐性突变； 显性突变。从突变体分离基 因的方法：Positional cloning；Candidate cloning； Direct cloning。2、分离组织特异性或发育阶段特异性表达的基因的方法a. 分离特定组织或器官的方法：直接机械分离；根据细胞表面特定蛋白来识 别、分离；转基因标记法。b. 组织特异性基因表达产物的鉴定及其基因的克隆：从蛋白质到基因标记 不同来源的mRNA去与筛选特异cDNA文库；mRNA differential display；

10、Subtractive cloning。3、利用基因序列同源性的克隆法接利用异源cDNA探针筛选cDNA文库从保守区设计引物 同源探针 筛选 cDNA文库4、利用DNA-蛋白质或蛋白质蛋白质互作关系分离克隆新的基因(二)、基因表达的检测1、mRNA的检测:Northern 杂交；斑点杂交；RTPCR；In situ hybridization。2、蛋白质的检测：Western blot；In situ antibody staining3、启动子活性检测法(三)、基因对发育影响的功能性分析 1、Gene Knockout2、Overexpression: mRNA注射法；DNA注射法；病毒感染

11、法3、Rescue4、Antisense RNA/Antisense oligos5、Antibody blocking6、Dominant negative receptor mutations7、Dominant interferring alleles第二章 胚胎的早期发育一、卵裂(Cleavage)(一)、卵裂的特点：分裂间期短；细胞变小；转录不活跃；不等裂。(二)、卵裂的类型：经线裂(meridional cleavage)：卵裂面与AV axis平行；纬线裂(equatorial cleavage)： 卵裂面与AV axis垂直。1. Holoblastic cleavage:卵裂

12、沟穿过整个受精卵，产生两个均等大小的两个 blastomeres. 含卵黄比较少的卵一般采用此种方式, e.g., Sea Urchin, frogs, most mammals。(1) Radial holoblastic cleavage：卵裂是辐射对称的。Sea cumcumber：经线裂 经线裂纬线裂经线裂纬线裂，其后交替进行 直到产生中空的blastula, 中间的空腔为blastocoel。产生的细胞大小相同。Sea urchin：前3次卵裂(经经纬)为均裂，第4次卵裂时Vegetal pole的4个细 胞发生不均等卵裂。Frog：卵裂沟不能完全穿过卵黄。第1、2次卵裂为均等经裂，

13、第3次不均等纬裂，导致不同大小细胞的产生。植物极的大分裂球分裂快于动物极的小分裂球。(2) Spiral holoblastic cleavage：从第3次卵裂开始，卵裂面与AV axis呈约45o 角螺、蚌等软体动物、多毛类环形动物等采用此种方式。形成的blastula不具有blastocoel。(3) Rotational holoblastic cleavage：哺乳动物受精卵采用此种方式。第1次经裂产生的两个卵裂球，分别采用不同方向的卵裂；卵裂球的分裂具不同步性；早期卵裂在输卵管中进行。线虫的卵裂也为旋转全卵裂。2. Meroblastic Cleavage (偏裂)卵裂沟只停留在动物

14、极或卵子表面，常发生于端黄卵、多黄卵、中黄卵。(1). Discoidal cleavage：为端黄卵和极端端黄卵所采用的方式。卵裂局限于动 物极。鸡卵的卵裂：受精卵在输卵管中开始卵裂，产出的卵已含约60000个细胞， 中间为明区，边缘区为暗区，明区下为胚盘下腔。斑马鱼：前5次卵裂为经裂，产生单细胞层，随后有纬裂发生；第12次分裂之前，不同细胞的分裂是同步的。(2). Superficial cleavage：以昆虫为代表的中黄卵采用此种方式。其合子核位于卵的中央，周围为卵黄。中央的核发生8次卵裂后产生的256个核开始移向卵的外周，至第10次卵裂后核已全部位于卵周质中，形成合胞体。第14次分裂

15、时，核之间的卵膜内陷使之细胞化。(三)、囊胚的类型大多数囊胚为球状空心细胞团，细胞分裂速度已大大下降。1.腔囊胚(1).海鞘囊胚：其囊胚含256个细胞，中间的囊胚腔由单层细胞包围。(2).海胆囊胚：含128个细胞，单层围裹囊胚腔，细胞表面长出纤毛帮助囊胚在受精膜内转动，动物极的细胞分泌孵化酶降解受精膜。其囊胚腔的形成机制：渗透作用；透明层作用。(3).蛙类囊胚：128细胞囊胚的囊胚腔位于动物极。2.表面囊胚：昆虫经14次卵裂产生16400细胞实心囊胚。3.盘状囊胚：(1). 斑马鱼：囊胚期始于128细胞期，再经2次分裂进入midblastula transition 期，这时细胞分裂变慢。胚胎

16、细胞分三类：与卵黄接触的卵黄多核层(yolk syncytial layer, YSL) 细 胞、位于胚盘最外层的表胚层(enveloping layer, EVL)细胞和上述二者之 间的深层细胞(deep cells)。仅深层细胞发育为胚胎本体组织。(2).鸡：胚盘座落于卵黄之上，由上胚层和下胚层组成，前者将形成胚胎本体，后者形成胚外结构如卵黄囊柄。4.哺乳动物囊胚的形成(1) 卵裂球的compaction: 发生在第3次卵裂后不久，它伴随细胞粘连分子E-Cadherin由均匀分布变为集中分布在卵裂球间的接触部位，其抗体可引起decompaction。Protein Kinase C可促进c

17、ompaction, 它可能是介导了E-Cadherin的transloction。(2) 细胞命运的早期分化：16细胞的morula, 其外层细胞产生的绝大部分子细胞 发育为32细胞期时的trophoblast,后者将生成chorion；其内层细胞产生的所有子细胞及 外层细胞产生的小部分子细胞将构成32细胞期时的inner cell mass，它们将发育为胚胎 本体及与之相连的卵黄囊、尿囊和羊膜.。两种命运的细胞分泌不同的蛋白。8细胞期时各细胞有相同的发育潜力，在16细胞期时的分化是随机的。(3) 胚泡着床：胚泡囊胚腔的增大是由于滋胚层细胞的Na+泵的作用及随后的渗 透作用；透明带防止胚泡与

18、输卵管壁的粘连；胚泡到达子宫后产生类胰蛋白酶Strypsin,使透明带局部穿孔，释放胚泡与子宫壁接触。(4) 同卵双生：滋胚层形成前的分割；滋胚层形成后而羊膜形成前的分割；羊 膜形成后的分割。(5) 嵌合胚与胚胎干细胞：胚胎干细胞是保持了分化为胚胎本体的潜能的胚胎细胞，来源于内细胞团。(6)人工受精和胚胎切割： 二、原肠作用 Gastrulation原肠作用是指囊胚细胞有规则地移动，使未来的内胚层和中胚层细胞迁入胚胎内部，而未来的外胚层细胞铺展在胚胎的表面，从而形成原肠胚。(一)、原肠期主要的细胞移动类型：外包(epiboly)：表皮层作为一个整体扩展，使胚胎的内层被覆盖；内陷(invagin

19、ation)：指胚胎局部区域的内陷；内卷(involution)：指正在扩展的外层向内卷折；内移(ingression)：指表层的单个细胞迁入胚胎的内部；分层(delamination)：指一个细胞层分为两层；汇聚伸展(convergent extension)：指细胞相互插入，使所在组织变窄、变薄，并推动组织向前移动。(二)、几种模型动物的原肠作用1. Sea Urchin囊胚的fate map：植物极正中间为预定的中胚层，其相邻两层为预定的内胚 层 ，其余细胞为预定的外胚层。原肠作用开始于预定的中胚层表皮细胞转化为间质细胞，这些间质细胞进入囊胚腔；预定的内胚层细胞内陷和扩展，形成胚胎原肠。

20、内胚层内陷的机制：细胞外侧变形；伪足(filopodia)的伸展和收缩运动；细胞间汇聚伸展。海胆小分裂球启动原肠作用，可诱导第二胚轴的形成，包括使预置外胚层命运细胞分化为中胚层和内胚层命运的细胞。2. Drosophila中胚层的产生：囊胚腹部810个细胞宽的长条区内陷，最终产生的中胚层铺 展在腹部的外胚层内；外胚层的产生：当预定的中胚层内陷成管状时，与其相接的腹部外胚层的部分细胞内移，在中胚层和外胚层之间形成一个成神经细胞层；肠道的产生：囊胚两端的预定内胚层内陷形成中肠；内陷时附带进入的部分外胚层细胞形成前肠和后肠。在果蝇的原肠作用中，细胞不发生分裂。3. XenopusXenopus的囊胚

21、的命运图：囊胚腔上方的细胞为预定的外胚层；预定的内胚层 位于赤道和植物极；预定的中胚层为赤道内胚层的内侧。原肠作用开始于在囊胚的植物极内胚层背部的几个细胞变为瓶状细胞，随后内突形成胚孔(blastopore)。预定的中胚层细胞由胚孔处内卷，赤道边缘区的中胚层细胞通过汇聚扩展向背侧中央沿AP轴铺展。预定的内胚层与其背侧的中胚层一起内卷，在胚胎内部形成原肠腔。预定的外胚层采取下包的方式向植物极扩展并最终覆盖整个胚胎。4. Danio rerio (zebrafish)外包：内层细胞与表面细胞互插使胚盘变薄；胚盘细胞向植物极的卵黄下包，其驱动力可能来自于YSL的微管运动。胚层的形成：50外包(epi

22、boly)期时，胚盘细胞在与卵黄交界处增厚形成germ ring，它由表皮、上胚层(epiblast)和下胚层(hypoblast)组成；其后在未来的背部处的germ ring增厚形成embryonic shield，它相当于Xenopus的organizer。下胚层细胞运动、迁移将形成中胚层和内胚层，上胚层细胞将产生neural keel和皮肤。5. Chicken上胚层和下胚层的形成：囊胚表面细胞为上胚层，其部分细胞掉入胚盘下腔(subgerminal cavity)形成初级下胚层，胚盘后部边缘区的上胚层内卷与初级下胚层混合形成次级下胚层。上胚层将用于产生三个胚层，而下胚层用于形成胚外膜(

23、如卵黄囊)。原条(primitive streak)的形成：由后部边缘区的上胚层加厚而成，原条头部末端的加厚层叫Hensens Node，它是鸡胚的诱导中心。内胚层：最早穿过原条进入囊胚腔的细胞将向头部方向移动，成为前肠内胚层；通过原条侧面进入囊胚腔的一部分上胚层细胞将使其下方的下胚层细胞向两侧移开，它们将形成所有的内胚层器官和大多数胚外膜。中胚层：较晚通过Hensens Node进入囊胚腔的细胞位于内胚层和上胚层之间，并向头部方向运动，形成头部中胚层和脊索中胚层；通过原条侧面进入囊胚腔的另一部分上胚层细胞将作为一个整体在上胚层和下胚层之间扩展，形成其余的中胚层和胚外膜。外胚层：上胚层中的外胚

24、层前体细胞继续增殖，并通过下包覆盖卵黄。6. Mammals上胚层和下胚层的形成：内细胞团分为两层，与blastocoel相接触的一层为下胚层，用于形成yolk sac；与滋胚层接触的一层为上胚层，其一部分细胞将成为羊膜腔的衬里，另一部分发育为胚胎本体。三胚层的形成：基本上与鸡的类似。第三章 神经系统的发育一、神经管(neural tube)的形成神经管是中枢神经系统的原基，其形成有两种方式。1. Primary neurulation由外胚层细胞增殖、内陷、并最终离开外胚层表面而形成中空的神经管，大多数脊椎动物头部神经管采此种方式。它可分为三个过程：(1)Neural plate (神经板)

25、的形成：背部mesoderm诱导中线外胚层细胞变长，而其侧翼的预定外胚层细胞变扁平，使预定的神经区域凸出于周边外胚层而成为神经板；预定的表皮细胞和神经细胞的运动导致二者交界处形成 neural fold(神经褶)。(2)Neural floor plate(神经底板)的形成：由神经板中线区的细胞组成，而神经褶 成为神经管的背部。(3)神经板的弯曲：神经板中线细胞被notochord锚定，背侧两边各一处也被相邻的外胚层锚定，被锚定的细胞变短、顶端收缩使神经板出现三个沟，然后神经板以这三个沟为支点而弯曲。同时，外胚层向中线移动的推力也促使神经板弯曲。(4)神经管的闭合：指中线两侧的神经褶在背部中线

26、处合并。神经管最终要与其背部上方的外胚层分开，这一过程可能受钙粘蛋白介导。鸟类神经管闭合早晚与AP轴走向一致；哺乳动物神经管的闭合同时发生在多处。在人类胚胎上，神经管闭合失败导致胎儿先天缺陷；SHH、Pax3等是闭合所必需的，叶酸可降低神经管缺陷风险。2. Secondary neurulation神经管由细胞组成的实心索中空而成。鱼类完全以此类方式形成神经管，而鸟类、哺乳动物、两栖动物胚胎仅尾部神经管的形成采用此方式。二、神经诱导作用 (Neural induction)1. Organizer mesoderm诱导神经管的形成Organizer移植实验证明，胚孔背唇部位的预定脊索中胚层不仅

27、能够使受体的腹部组织形成神经管和背部中胚层组织，还能将受体和供体组织组成一个完整的次级胚胎。鸟类Hensen抯 Node的移植实验也有类似结果。2.神经诱导作用的分子机制囊胚的外胚层和中胚层细胞的预置命运是neural fate，但它们因表达BMP4而朝 腹部中胚层方向发育；Organizer和notochord中表达的信号蛋白如Chordin和Noggin可以拮抗BMP4，从而使它们附近的细胞可向预置命运发育。三、神经管的分化器官水平上分出脑与脊髓，组织水平上脑和脊髓产生不同的功能区，细胞水平上神经表皮细胞分化为不同的神经元和胶质细胞。1. 脑的分区：神经管前部在三个区域膨胀，形成前脑、中脑

28、、后脑。2. 后脑的进一步分区：分为多个rhombomeres(菱脑原节)，节间细胞不能自由交换，不同的节表达的Hox家族基因不同。四、神经元的分化1.神经元命运的确定：中枢神经系统中细胞向神经元分化是通过lateral inhibition机制实现的，主要受Delta/Notch信号传导的影响。2.脊髓沿DV轴线的分化：腹部产生motor neurons，腹部命运受notochord和floor plate cells分泌的Sonic hedgehog控制；背部产生commissural neurons，其命运受背部外胚层分泌的TGF-家族蛋白如BMP-4、BMP-7的控制3

29、.中枢神经系统的分层：在神经管壁中，最内侧的细胞维持分裂能力，为室内增殖区(ventricular proliferative zone)或室管膜层(ependyma)，该区细胞在不同时间点分化出的神经元向外迁移后所停留的位置不同。室管膜层的细胞有两种分裂方式：vertical或horizontal。前者的分裂平面与表皮细胞长轴平行，产生两个都有分裂能力的子细胞；后者分裂平面的方向与其相反，产生的两个子细胞有不同的命运，这可能与Notch和numb蛋白的不均等分布有关。五、神经元的生长和凋亡1. 神经元的结构：神经元一般包括soma, dendrite, axon。Dendrites接收来自于

30、其它神经元的信号，axon传递神经信号。髓鞘(myelin sheath)是由神经胶质细胞围绕axon形成的多层膜系统，以防止电脉冲在传输过程中损耗。外周神经元的髓鞘由Schwann cell形成，而中枢神经元oligodendrocytes形成。2. Guidance for axon growth: 神经轴突的生长首先决定于其自身表达的基因产物, 也决定于其所处的环境因素(environmental cues),某些因素具有吸引作用，而某些具有排斥作用。这些环境因素包括其伸展途径中的组织结构、胞外基质成分、相邻细胞的表面特性。3. Synapse formation: 当神经元的生长锥抵达

31、靶位(肌细胞、其它神经元、腺体)时，将在二者间形成特化的连接，即神经突触。如运动神经元与肌细胞间将形成neuro-muscular junction.4. Neural survival: 在中枢和周边神经系统的发育中，50以上的神经元将凋亡。 一个神经元对肌细胞的激活将引起其它与该肌细胞接触的神经元的凋亡。不同类型的神经元的存活需要不同的营养神经因子，同类神经元在不同的发育阶段也需要不同的因子维持存活。六、神经嵴细胞(neural crest cells)它们是在神经管闭合时，由闭合处的神经管细胞及相接触的外表层细胞间质化而成。它们具有迁移性，将分化为多种不同类型的细胞，这取决于其起源和迁移目的地。1.躯干神经嵴(trunk neural crest)：其细胞有两条迁移路线。(1) dorsolateral pathway:由背部向侧翼在表皮层和体节之间迁移，将分化为色素细胞。(2)ventral pathway：细胞从体节的后半部进入体节，在体节中形成背根神经节(dorsal root ganlia)，有的穿过体节分化为交感神经细胞和肾上腺髓质细胞。迁移与Slug、Cadherin等蛋白有关。2.头部神经嵴(cephalic neural crest)：头部神经嵴细胞向背侧方向移动，将分化产生面