21生物化学习题与解析常用分子生物学技术的原理及其应用.docx

1、21生物化学习题与解析常用分子生物学技术的原理及其应用21-生物化学习题与解析-常用分子生物学技术的原理及其应用D3 实时 PCR 技术与普通 PCR 技术相比，它可以动态监测反应过程中产物的量。 4 Sanger 法在测定核酸序列时，反应管中加入的 dNTP 仅标记一种即可。 5 生物芯片可以是 DNA 芯片、 cDNA 芯片或蛋白质芯片。 6 酵母双杂交技术是分析 DNA 蛋白质相互作用的一项重要技术。 7 核转移技术，是指将动物体细胞核全部导入另一个体去除了胞核的卵细胞内，使之发育成个体。 8 基因矫正是用正常的基因通过体内基因同源重组，替换致病基因来达到治疗目的。 9 目前基因治疗多采

2、用基因增补的方式。 10 RNA 印迹技术中， RNA 分子在转移前需进行限制性内切酶切割。 11 PCR 反应中变性主要是使模板 DNA 完全变性为单链。 12 实时 PCR 技术中， TagDNA 聚合酶在链延伸过程中遇到荧光探针，可发挥 3 5 核酸外切酶活性。 13 酵母双杂交系统可用于证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 14 转基因技术即动物克隆技术，是无性繁殖。 15 内源基因结构突变发生在生殖细胞可引起恶性肿瘤。 16 基因转移和基因剔除技术在医学中最重要的用途是建立疾病动物模型。 17 定位克隆是指从对基因编码产物的功能的了解出发来克隆致病基因。 18

3、目前 DNA 序列分析是找出患者有关基因变异所在的最为直接和确切的基因诊断法。 三、填空题 1 分子杂交是利用 DNA 和 这一基本性质来进行 DNA 或 RNA 定性、定量分析的。 2 在印迹技术中，将 DNA 片段在琼脂糖凝胶中 使其成为 ，利用 使胶中的生物大分子转移到 膜上，使之成为固相化分子。 3 印迹技术的基本流程依次为 、 、 和 。 4 Southern blotting 主要用于 定性和定量分析，亦可用于 和 的分析。 5 Northern blotting 主要用于检测 的表达水平，敏感性较 PCR ，但其具有 和 的优点。 6 Western blotting 主要用于检

4、测样品中 的存在、细胞中 以及 的相互作用研究等。 7 PCR 的基本反应步骤包括 、 、 。 8 基因芯片适用于分析不同组织细胞或同一细胞不同状态下的 ，其原理是基于 。 9 在转基因技术中，被导入的目的基因称为 ，目的基因的受体动物称为 。 10 标签融合蛋白结合实验主要用于证明 是否存在直接的物理结合，分析结合的 及筛选细胞内与融合蛋白相结合的 。 11 染色质免疫沉淀法是目前可以研究 与 相互作用的主要方法。 12 目前克隆致病相关基因主要有 和 两大策略。 13 根据受体细胞的类型不同，基因治疗分为 的基因治疗和 的基因治疗两大类。 14 目前使用的基因载体有 和 两大类。 15 在

5、人类基因治疗实施中，导入基因的方式有 和 两大类。 四、名词解释 1 probe 2 blotting technologe 3 gene libary 4 核转移技术 5 gene chip 6 gene therapy 7 gene diagnosis 8 基因疫苗 9 gene inactivation 10 gene replacement 11 gene augmentation 12 PCR 13 ex vivo 五、问答题 1 简述印迹技术的分类及应用。 2 简述 PCR 反应体系的基本成分、 PCR 的基本反应步骤和主要用途。 3 简述 PCR 技术的基本原理。 4 简述逆转录

6、 PCR 、原位 PCR 和实时 PCR 技术的基本原理和主要区别。 5 简述 DNA 链末端合成终止法（ Sanger 法）测序的基本原理。 6 简述基因转移和基因剔除技术在医学发展中的作用。 7 简述酵母双杂交技术的基本原理及应用。 8 试述染色质免疫沉淀法基本原理及用途。 9 简述基因诊断的概念及特点。 10 何为基因治疗，目前基因治疗有哪些基本策略？ 11 试述基因治疗的基本程序。 12 欲生产一种药用多肽，科学家已经将此多肽的基因与某真核表达质粒重组在一起。请你设计一个实验，利用 PCR 方法鉴定此重组表达质粒是否含有这一多肽的基因。 13 请设计一个实验，利用酵母双杂交系统检测从某

7、一癌组织中提取、纯化的一种未知蛋白质 X 与两种已知蛋白质 a 、 b 之间是否有相互作用。 14 请为某一单基因遗传病（低表达或不表达）的患者设计一个基因治疗方案。 参考答案 一、选择题 （一） A 型题 1 B 2 C 3 D 4 E 5 B 6 D 7 B 8 A 9 D 10 A 11 D 12 C 13 B 14 E 15 D 16 C 17 C 18 A 19 D 20 A （二） B 型题 1 D 2 B 3 C 4 E 5 B 6 C 7 A 8 D 9 E 10 C 11 A 12 D 13 B 14 C 15 E 16 C 17 A 18 D （三） X 型题 1 ABCD

8、 2 ABCDE 3 ABCDE 4 ACE 5 ABD 6 ABCDE 7 ABC 8 ABDE 9 BCD 10 BD 11 ACD 12 BCDE 13 AB 14 ABCD 15 ACD 二、是非题 1 B 2 B 3 A 4 A 5 A 6 B 7 B 8 B 9 A 10 B 11 A 12 B 13 A 14 B 15 B 16 A 17 B 18 A 三、填空题 1 变性 复性 2 变性 单链 毛细作用 NC 3 电泳 转移 杂交 放射自显影或化学显色 4 DNA 重组质粒 噬菌体 5 mRNA 差 特异性强 假阳性率低 6 特异性蛋白质的存在 特异性蛋白质的半定量分析 蛋白质

9、分子 7 变性 退火 延伸 8 基因差异表达情况 双色荧光探针杂交 9 转基因 转基因动物 10 两种蛋白质分子 具体结构部位 未知分子 11 体内 DNA 蛋白质 12 功能克隆 定位克隆 13 体细胞 生殖细胞 14 病毒载体 非病毒载体 15 直接体内疗法 间接体内疗法 四、名词解释 1 探针，是指带有特殊可检测标记（放射性核素或其它化合物标记）的核酸片段，它具有特定的序列，能够与待测的核酸片断互补结合，因此可用于检测核酸样品中特定的基因。 2 印迹技术，是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。它包括 DNA 印迹技术、 RNA 印迹技术和蛋白质印迹

10、技术等。 3 基因文库，是指一个包含了某一生物体全部 DNA 序列的克隆群体。基因文库可以分为基因组 DNA 文库和 cDNA 文库。 4 核转移技术 ， 即所谓动物整体克隆技术，是指将动物体细胞核全部导入另一个体去除了胞核的激活的卵细胞内，使之发育成个体。这样的个体所携带的遗传性状仅来自一个父亲或母亲个体，因而为无性繁殖。从遗传角度上讲，是一个个体的完全拷贝，故称之为克隆。 5 基因芯片，又称 DNA 微阵列，包括 DNA 芯片 (DNA chip) 和 cDNA 芯片 (cDNA chip) ，是指将许多特定的 DNA 片段或 cDNA 片段作为探针，有规律地紧密排列固定于支持物上，然后与

11、待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。 6 基因诊断，是指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 7 基因治疗，从广义上讲，是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。 8 基因疫苗 ， 主要是指 DNA 疫苗，是第三代疫苗。其将编码外源性抗原的基因插入到真核表达质粒中，直接导入人体内，抗原基因在一定时间内持续表达，不断刺激机体免疫系统，达到治病或防病目的。 9 基因失活，是

12、指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。 10 基因置换，是指用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换致病基因，使细胞内的 DNA 完全恢复正常状态。 11 基因增补，是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。 12 聚合酶链反应，指以 DNA 分子为模板，以一对与模板序列相互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，完成新的 DNA 的合成，重复这一过程使目的 DNA 片段得到扩增。这一技术可以将微量目的 DNA 片段扩增一百万倍以上。 13

13、间接体内疗法，是指在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，已达到治疗的目的。 五、问答题 1 简述印迹技术的分类及应用。 答：印记技术是指将在凝胶中分离的生物大分子转移或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术。它主要包括 DNA 印迹技术 (Southern blot) 、 RNA 印迹技术 (Northern blot) 和蛋白质印迹技术 (Western blot) 等。 DNA 印迹技术主要用于基因组 DNA 的定性和定量分析，例如对基因组中特异基因的定位及检测等，此外亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 RNA 印迹技术主

14、要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA 的表达水平，也可以比较不同组织和细胞中的同一基因的表达情况。 蛋白质印迹技术，也叫免疫印迹，用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。 2. 简述 PCR 反应体系的基本成分、 PCR 的基本反应步骤和主要用途。 答：组成 PCR 反应体系的基本成分包括模板 DNA 、特异性引物、耐热性 DNA 聚合酶、 dNTP 以及含有 Mg 2+ 的缓冲液。 PCR 的基本反应步骤包括： (1) 变性：将反应体系加热至 95 ，使模板 DNA 完全变性为单链，同时因物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消

15、除。 (2) 退火：将温度下降至适宜温度使引物与模板结合。 (3) 延伸：将温度升至 72 ， DNA 聚合酶以 dNTP 为底物催化 DNA 的合成反应。 PCR 主要用途： (1) 目的基因的克隆； (2) 基因的体外突变； (3)DNA 和 RNA 的微量分析； (4)DNA 序列测定； (5) 基因突变分析。 3 简述 PCR 技术的基本原理及应用。 答： PCR 技术类似于 DNA 的体内复制。以 DNA 分子为模板，以一对与模板序列互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶作用下，利用 4 种脱氧核苷酸，完成新的 DNA 的合成，重复这一过程使目的 DNA 片段得到扩增。这一技术

16、可以将微量目的 DNA 片段扩增 100 万倍以上。基本步骤是首先待扩增 DNA 模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在 DNA 聚合酶作用下得以延伸。这种变性 - 复性 - 延伸的过程就是一个 PCR 循环， PCR 就是在合适条件下的这种循环的不断重复。主要用于目的基因的克隆、基因的体外突变、 DNA 和 RNA 的的微量分析、 DNA 序列测定和基因突变分析等。 4. 简述逆转录 PCR 、原位 PCR 和实时 PCR 技术的基本原理和主要区别。 答：逆转录 PCR 是将 RNA 的逆转录和 PCR 反应联合应用的

17、一种技术。即首先以 RNA 为模板，在逆转录酶的作用下合成 cDNA ，再以后者为模板通过 PCR 反应来扩增目的基因。 原位 PCR 是在固定液固定、石蜡包埋的组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的 PCR 反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测 DNA 或 RNA 是否在该组织或细胞中存在。 实时 PCR 的基本原理是引入了荧光标记分子，并使荧光信号强度与 PCR 产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，计算出 PCR 产物量。根据动态变化数据，可以精确计算出样品中最初的含量差异。 逆转录 PCR 与传统 PCR 相比，将 RNA 的逆转录和 PCR 反应联合起来，可

18、以对已知序列的 RNA 进行定性及半定量分析。常规 PCR 或 RT-PCR 技术的产物不能在组织细胞中定位原位，因而不能与特定的组织细胞特征表型相联系，原位 PCR 技术可以将目的基因的扩增与定位相结合。实时 PCR 技术与传统 PCR 反应相比，在常规正向和反向引物之间，增加了一特殊引物作为探针。该技术可以通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰。 5. 简述 DNA 链末端合成终止法（ Sanger 法）的基本原理。 答： DNA 链末端合成终止法基本原理是：将 2 ， 3 - 双脱氧核苷酸 (ddNTP) 代替部分 dNTP 作为底物掺入到新合成的 DNA 链中，

19、由于 ddNTP 缺乏 3 -OH ，一旦 ddNTP 掺入到 DNA 链中，就不能与下一核苷酸形成磷酸二酯键，因此合成反应终止。测定时，首先将模板分为四组，每一组分别加入引物和 DNA 聚合酶及由 32 P 或 35 S 标记的 dNTP ，启动 DNA 合成，一定时间后，每一组加入四种 ddNTP 中的一种，就可以获得在不同部位终止的、长短不同的 DNA 链，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，通过反射自显影就可以读出 DNA 的序列。 6. 简述基因转移和基因剔除技术在医学发展中的作用。 答：基因转移和基因剔除技术在医学中最重要的用途是建立疾病动物模型。以往的遗传疾病动物模型主要是自然发生

20、或用化学药物、放射诱导等方式获得。基因转移和基因剔除技术为直接建立动物模型提供了有效的手段。这些模型可用于探讨疾病的发生机制，更重要的是可作为新的治疗方法和新的药物的筛选系统。 建立动物模型： (1) 单基因决定疾病模型：应用基因剔除模拟基因失活，如动脉硬化症疾病模型。 (2) 多基因决定疾病模型 7 简述酵母双杂交技术的基本原理及应用。 答：酵母双杂交系统目前已成为分析细胞内未知蛋白相互作用的主要手段之一。该技术是基于酵母转录激活因子 GAL4 分子的 DNA 结合区 (BD) 和促进转录的活性区 (AD) 被分开后将丧失对下游基因的激活作用，但 BD 和 AD 分别融合了具有配对相互作用的

21、两种蛋白质分子后，就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用。 酵母双杂交系统可以用于 (1) 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测； (2) 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基； (3) 将拟研究的蛋白质的编码基因与 BD 基因融合成为 “ 诱饵 ” 表达质粒，可以筛选 AD 基因融合的 “ 猎物 ” 基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。 8 试述染色质免疫沉淀法基本原理及用途。 答：染色质免疫沉淀技术是目前可以研究体内 DNA 与蛋白质相互作用的主要方法。 该法可以研究蛋白质与 DNA 在染色质

22、状态下的相互作用，阐明真核生物基因表达机制。它的基本原理是在活细胞状态下用化学交联试剂固定蛋白质 -DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，再利用 PCR 技术特异性的富集目的蛋白结合的 DNA 片段，从而获得蛋白质与 DNA 相互作用的信息。 9 简述基因诊断的概念及特点。 答：基因诊断是指利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基因诊断与其他诊断方法相比，基因诊断的方法特点是： （ 1 ）针对性强，以基因作为检查材料和探察目标，属于 “ 病因诊断 ” 。 （ 2 ）特

23、异性强，用分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故有很高的特异性。 （ 3 ）灵敏度高，所用技术具有放大效应，故诊断灵敏度高 （ 4 ）适用性强，诊断范围广。 10 何为基因治疗，目前基因治疗有哪些基本策略？ 答：从广义上讲，是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法，均谓之基因治疗。 (1) 缺陷基因精确的原位修复 包括对致病基因的突变碱基进行矫正的基因矫正和用正常基因通过重组原位替换致病基因的基因置换。这两种方法是对缺陷基因精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变，是最为理想的治疗方法，但技术上目前尚未突破。 (2) 基因增补 是指将目的基因导入病变细胞

24、或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。目前基因治疗多采用此法。 (3) 基因失活 是指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。 (4) 基因疫苗 主要是指 DNA 疫苗，是第三代疫苗。其将编码外源性抗原的基因插入到真核表达质粒中，直接导入人体内，抗原基因在一定时间内持续表达，不断刺激机体免疫系统，达到治病或防病目的。 11 试述基因治疗的基本程序。 答：基本程序如下： (1) 治疗性基因选择 选择对疾病有治疗作用的特定目的基因。 (2) 基因载体的选择 有病毒载体和非病毒载体，常用

25、的是病毒载体。 (3) 靶细胞的选择 基因治疗根据受体细胞种类的不同分为体细胞和生殖细胞的基因治疗，目前进行的基因治疗均是体细胞基因治疗和间接体内疗法。 (4) 基因转移 基因导入人体的方式：间接体内疗法，即在体外将外源基因导入靶细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，达到治疗的目的；直接体内疗法，将外源基因直接导入体内有关的器官组织，使其进入相应细胞进行表达。 12 欲生产一种药用多肽，科学家已经将此多肽的基因与某真核表达质粒重组在一起。请你设计一个实验，利用 PCR 方法鉴定此重组表达质粒是否含有这一多肽的基因。 答：实验步骤如下： (1) 利

26、用国际基因文库等信息资源，获得这一多肽的基因序列 (2) 根据多肽的基因序列，设计 PCR 引物 (3) 提取转化菌中的重组表达质粒和空载质粒 (4)PCR 扩增 (5)PCR 扩增产物的鉴定 13 请设计一个实验，利用酵母双杂交系统检测从某一癌组织中提取、纯化的一种未知蛋白质 X 与两种已知蛋白质 a 、 b 之间是否有相互作用。 答：实验方案如下： (1) 测定 X 的氨基酸序列； a 与 b 氨基酸序列已知 (2) 根据氨基酸序列，推测 X 、 a 、 b 的 cDNA 序列 (3) 构建诱饵基因与猎物基因表达质粒各两种 (4) 分三组共转染酵母细胞 (5) 检测下游报告基因表达产物，若

27、下游报告基因表达则两蛋白质之间有相互作用；否则无相互作用 表达质粒及共转染分组如下： X 的 cDNA 与 BD 基因融合为诱饵表达质粒； a 的 cDNA 与 AD 基因融合为猎物表达质粒； X 的 cDNA 与 BD 基因融合为诱饵表达质粒； b 的 cDNA 与 AD 基因融合为猎物表达质粒。 14 请为某一单基因遗传病（低表达或不表达）的患者设计一个基因治疗方案。 答： (1) 基因治疗方法：基因增补是指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有的功能增强。目前基因治疗多采用此法。 ( 2) 基因导入方式：间接体内疗法，即在体外将外源基因导入体细胞内，再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内，使带有外源基因的细胞在体内表达相应产物，以达到基因治疗的目的。 (3) 基因治疗步骤：治疗性基因的选择 基因载体的选择 重组体的构建 靶细胞的选择 基因转移 外源基因表达的筛选 回输体内 检测疗效 a 治疗性基因的选择：选择该单基因遗传病的野生型基因作为治疗性基因。 b 基因载体的选择：选用重组腺病毒相关病毒作为载体 c 靶细胞的选择：选择该患者的淋巴细胞作为靶细胞