受体的放射配体结合分析法.docx

1、受体的放射配体结合分析法第八章 受体的放射配体结合分析与应用第一节 概述受体（receptor）是细胞膜上或细胞内的一些能与生物活性物质相互作用并引起特异性生物效应的蛋白质。受体与配体结合后，通过受体特定的信号传递系统，引起细胞的特定反应，是高等动物适应环境、协调机体各种细胞功能的关键性分子。用放射性核素标记的配体（radioligand）与相应的受体进行特异结合反应，从而对受体进行定性和定量，此即为受体的放射配体结合分析法（radioligand binding assay of receptors, RBA）。定量的RBA是在已知配体与受体反应的基础上，通过结合反应得知一定量的组织或细胞能

2、与该放射性配体结合的受体数，称结合位点数（number of binding sites）。亲和力则以平衡解离常数表示。定性RBA则通过反应量效关系、某些参数的变化等判断受体的类型、单位点或多位点系统、受体与配体相互作用的特点等。RBA出现前，虽然提出了受体的一些基本概念，如配体占领学说、激动剂和拮抗剂、配体结合反应的质量作用定律等，但对受体的研究主要靠观察受体激动剂或拮抗剂的生理效应或药理效应。20世纪60年代，由于放射性探测的灵敏度高、核素标记物不改变配体的构型，可用来直接观察配体在亚细胞组分中的分布，并进行精确定量。RBA使受体的研究从间接观察进入了直接观察，从宏观进入微观，许多不易或无

3、法用生理（或药理）效应进行观察的受体得以精确定量，并进而对受体分子进行纯化，分析结构。受体的研究从20世纪70年代已经扩展到了神经递质、激素、细胞因子的作用机制、细胞水平的调控机制、疾病的发病机制及疾病的诊断等方面，渗透到了许多学科领域，受体的研究进入了分子生物学水平。自20世纪80年代以来，随着新技术、新方法的应用，受体的研究取得了长足的进展。例如，利用基因克隆技术测定受体分子的一级结构，上百种受体的氨基酸序列得以阐明，测出某种受体的不同亚型在氨基酸序列上的差别，为受体亚型的确定奠定了基础；用点突变技术确定受体结合位点在分子中的位置；利用单克隆抗体、荧光和酶等非放射性标记物来定位受体，丰富了

4、受体的研究方法。但这些分子生物学技术并不能直接观察受体的数量和分布，更无法了解受体与配体的亲和力。免疫学技术对研究受体也很重要，但是用抗体观察到的是受体分子的免疫学活性，而不是受体的生物活性。只有RBA能直接观察受体的数量和亲和力，因此这一技术目前仍在广泛地应用，且在不断地发展。一、受体的分类及亚型根据在细胞内的定位可将受体分为膜受体、核受体。近年来研究发现，原来认为位于细胞浆内的受体，在完整细胞内实际上是位于细胞核上的，当未和激素结合时，核受体与染色体的亲和力较低，易从上面脱落下来。用不破坏细胞的方法进行观察（如免疫荧光法），可发现这些受体几乎都在核上。再根据受体的分子结构及信息传递方式，又

5、可以将膜受体及核受体分别分为以下几类：（一）膜受体（membrane receptors）由胞膜外、胞膜内及跨膜区三部分组成，配体在细胞外侧同受体的胞外部分或跨膜部分上的特定结合位点结合后，受体的分子构型发生变化，通过膜内部分启动相应的信息传递机制，引起细胞功能变化。根据受体的分子结构和受体后信息传递方式，膜受体又分为4种（图8-1）：图8-1 受体示意图1G-蛋白（鸟苷酸结合调节蛋白）偶联型受体家族 该型受体均有7个跨膜区，受体膜内部分与G-蛋白偶联。许多神经递质、生物胺类、小分子肽、某些多肽的受体都属于此类。当激动剂作用于受体时，通过激活G-蛋白，再通过受体后的信号传递机制把信号传递到效应

6、器，引起细胞功能变化。2. 单一跨膜区有激酶活性型受体（酶联受体）家族 该型受体只有一个跨膜区，膜内结构域均有一个激酶（酪氨酸激酶或其他）活性区段。各类生长因子受体和胰岛素受体属此类。受体与激动剂结合引起受体分子构型变化，使激酶激活，从而将细胞外的信号传递到细胞内该酶的底物，引起功能变化。3. 单一跨膜区无激酶型受体（与可溶性激酶偶联的受体）家族 该型受体只有一个疏水的跨膜区段，膜外结构都类似纤维结合素（fibronectin），也称fibronectin样受体。受体无激酶活性区，但可激活细胞内的可溶性酪氨酸蛋白激酶。生长激素受体、很多细胞因子受体属此类。4. 离子通道型受体家族 这类受体蛋白

7、本身组成一个跨膜的离子通道，几个亚单位围成中央空隙，竖插在膜上，中央空隙就是离子通道。通道的开或关控制一些离子的跨膜流量，并通过改变细胞内离子浓度影响细胞功能。此类受体调控的离子主要是Na+、K+、Cl-、Ca2+。N-胆碱受体、GABA受体属此类。（二）核受体（nucleus receptors）本类受体在细胞核上，与细胞核内特定的DNA结合，通过这种结合影响遗传信息的转录。核受体一般是由4001,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质，不含糖基，无酶活性。氨基端是一个高度可变区，大约由25603个氨基酸残基组成，与转录的特异性有关，具有转录激活作用。中间是DNA结合区，约由6668个氨基

8、酸残基组成，富含半胱氨酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌指”与DNA结合；该区域部位保守性强，同种激素的受体在不同种属间有完全相同的DNA结合部位。羧基端为激素结合区，大约由220250个氨基酸残基组成，相同激素的受体在此区种属差异较小，而不同激素的受体即使是同一种属，差异性也较明显，因而决定了受体的特异性。与受体结合的染色体的DNA序列称为激素反应元件（hormone response element,HRE）, HRE一般位于受调控基因启动子上游，一个基因的上游通常有多个HRE。根据受体与HRE结合的特征，将核受体分为两类：1糖皮质激素受体类 这类受体包括糖皮质激素受体（GCR）、盐皮

9、质激素受体（MR）、孕激素受体（PR）及雄激素受体（AR）等。与它们结合的HRE称为糖皮质激素反应元件（glucocoticoid response element, GRE）2甲状腺激素受体类 这类受体包括甲状腺激素受体（TR）、雌激素受体（ER）、维生素D3受体（VDR）、维甲酸受体（RAR）及维甲酸X受体（RXR）等。与它们结合的HRE称为雌激素反应元件（estradiol response element, ERE）。（三）受体亚型受体都有特异的内源性和外源性配体，但研究发现，不少受体存在两种或两种以上亚型。受体亚型是指受体分子结构上既有部分相同，也存在一定差别，它们对同一配体具有不同

10、的亲和力，生物学上具有不同的效应。（1）用药理学方法可见到，同一种受体的几种激动剂（拮抗剂）对各亚型都有作用，但作用有相对的选择性。例如，对于 肾上腺素受体， 哌唑嗪对血管平滑肌收缩的拮抗作用强（受体为1），对胃肠道平滑肌舒张的拮抗作用较弱（受体为2），而育亨宾则相反。（2）用放射配体结合分析法可观察到，同一种受体的某些激动剂（拮抗剂）对各亚型都有特异性结合能力，但是亲和力不同。（3）用分子生物学技术可观察到，同一种受体的不同亚型的分子结构类似，但基因的编码和氨基酸序列有一定的差异。二、受体与配体相互作用的基本特点不同受体有不同的生理效应和不同的分布情况，然而它们都具有特定的结构和与配体相互作

11、用的特点。这些特点归纳起来有：1可饱和性（saturabilty）每种受体在一定量的组织或细胞上的量有一定的限度，若逐步加大配体的浓度，当达到一定的程度后，虽再加大配体，但所形成的受体配体复合物再也不增加，即受体已被配体饱和。饱和性也称有限结合能力。2特异性（specificity）受体对配体应具有特异性和立体特异性。配体可分为激动剂与拮抗剂，激动剂与受体结合后引起正性生理效应，天然存在于体内的配体大多为激动剂。有些配体属药物或毒物，它们可以是激动剂，也可以是拮抗剂。拮抗剂与受体结合后可阻碍激动剂发挥作用，帮助引起负性生物效应。同类的激动剂和拮抗剂对受体的竞争能力是与它们的生物学效应相平等的。

12、激动剂激发生物效应的强度，应该反映在激动剂对受体结合部分竞争的强度上，两者应该大致相等，专一拮抗剂应该阻断其他配体的结合。3适度的亲和力（affinity）受体对它的配体的亲和力，或配体占据受体的浓度范围，应该相当于体内配体的生理浓度，通常是10-9 mol/L。例如，以低浓度存在的信号分子的受体应该有高亲和力，以高浓度存在的信号分子的受体则亲和力相对低一些。4可逆性（reversibility）受体与配体的结合反应是可逆的。如果在放射配体与受体结合后将受体周围多余的放射性配体移去，则放射性配体与受体的复合物会渐渐解离，即这种结合是可逆反应。可逆性还表现在已经结合的配体可被另一种与受体亲和力更

13、高的配体取代。5. 识别能力（recognition）和生物效应的一致性受体与配体的特异性结合保证了受体对机体内成千上万生物活性物质的高度识别能力。这种能力与配体引起的生理（药理）效应相一致性。表现在：在组织分布上的一致性。在浓度上的一致性。受体主要存在于相应配体发挥生理或药理效应的器官，称之为靶器官。有的配体生理或药理效应广泛，而另一些配体的作用则有明显的器官专一性。配体和受体结合的有效浓度通常也应该和该配体发挥生理或药理作用的浓度一致。6. 需具有内源性配体一般受体都有内源性配体，如果通过外源性配体发现某种蛋白分子具有类似受体的结合特性，但未能找到内源性配体，则称之为孤儿受体（orphan

14、 receptor），还不能看做肯定是真正的受体。 第二节 单位点系统RBA的基本原理一、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律不少受体与配体结合的系统只存在一种结合位点，即简单单位点系统，其基本规律符合质量作用定律。（一）质量作用定律受体和配体结合反应最基本的性质是服从可逆的质量作用定律，对简单单位点系统可分析如下： R为游离受体，L为游离配体，RL为复合物的浓度；1为复合物的形成速率,2为游离速率；1和2是相应的速率常数。根据质量作用定律: 1=1RL， 2=2RL当反应最后达到平衡，1=2，亦即1RL= 2RL，则平衡解离常数： （8.1）KD是平衡解离常数,为平衡亲和常数KA的倒数，

15、单位为mol/L，KD越大表示亲和力越低。设受体和配体的初始浓度为RT和LT,R=RT-RL，L=LT-RL，则： （8.2）经整理后得： RL2 RLRT + LT + KD + RTLT= 0 （8.3）对特定配体和某一固定量的特定受体，RT和KD均是定值，于是RL仅随LT而变，二者呈双曲线函数关系。观察生物效应过去普遍采用Clark模型，该模型来源于： 假定LT远大于RL，于是： （8.4）（二）饱和曲线简单单位点系统RBA应能得到典型的饱和曲线。以RL为纵坐标，LT为横坐标，得到RL随LT变化的曲线。配体的浓度从零开始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大部分受体都与配体结合，即受体饱和了。此就是饱和曲线（saturation curve）。饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配体结合。饱和曲线的形状和KD有关。KD越小，即亲和力越高，曲线起始上升的越快，后续部分越早趋向水平（图8-2）。如KD相同而RT不同，则各曲线的形状相似但高度不同（图8-3）。图8-2 KD对饱和曲线的影响 图8-3 RT对饱和曲线影响 (三) Scatchard作图简单单位点系统在Scatchard作图中应呈一条直线。将： 移项并稍加整理可得：