毛细管电泳法在手性药物分析中的基础和应用研究.docx

1、毛细管电泳法在手性药物分析中的基础和应用研究 第二军医大学 博士学位论文 毛细管电泳法在手性药物分析中的基础和应用研究 姓名：柴逸峰 申请学位级别：博士 专业：药物分析学 指导教师：吴玉田;殷学平 2002.5.1 摘 要 摘 要 f手性药物的生物活性与其立体构型密切相关。目前新药研究的一个发展趋 、 势是研制和生产光学纯的药物。手性药物的研究已成为国际新药研究的新方向 之一，手性药物分析在手性药物研究中作用越来越重要，已成为国际上分析科 学中的热点和难点。目前在手性药物分析中主要采用间接分析和直接分析。直 接分析简便、快速、准确和可靠，其中V。PLC法如今占主导地位，毛细管电泳 法呈上升趋势

2、。毛细管电泳是近20年来迅速发展起来的一种高效、快速、微量 的分离分析方法。 在毛细管电泳手性分析中，一般是将手性选择剂 又称手性添加剂 加入 到分离缓冲液中，提供一个手性环境，由于一对对映体与手性选择剂的作用强 弱有差异，导致各自不同的电泳淌度，从而达到手性分离。环糊精是应用最为 广泛的一种选择剂，目前的CE的手性拆分研究主要集中于不同类型的环糊精 、 与不同类型的对映体药物之间cE拆分的实验研究，缺少机理和系统理论研究，一卜 本文采用分子对接方法，确定环糊精和对映体包结过程，进而采用分子力 学计算结合能，通过计算机化的分子模型技术从微观角度观察环糊精与对映体 的包结作用机制，研究量丝塑型熟

3、堡，并用对映体之间结合能的差异，结合动 态结合的实际情况，预测手性拆分的可能性，并用cE实验验证。研究得到结 、 果1研究提出环糊精手性识别有别于著名的三点理论，为“多点结合，一点决 定”。环糊精识别通过内腔包含和外部结合，与对映体形成不同的结构和性质的 可逆性包结物，内腔的包含可以是多点结合，外部的结合可以是一点或多点， 若能达到手性分离，至少在外部结合点上有一点作用必须有差异，而此作用点 可以是手性碳上直接结合的基团，也可以是整个侧链基团。2提出可以用环糊 精手性拆分的对映体通常具有两个主要结构特征： 1 疏水骨架，芳香族化合物， 如苯、丹磺酰、B萘酰胺、巴比妥酸酯等等，其主要目的在于提高

4、分子与环糊 摘 要 精的结合能。 2 手性原子上连接有大的立体基团，保证有一定的范德华力立体 作用。这保证了手性分离的异构体之间存在一定的结合能差异，从而揭示手性 分离的本质。此外，还有两个辅助因素：即疏水骨架上存在氢键供受体时，或 侧链上存在可以与环糊精形成氢键的基团，可以辅助性起到手性判别的作用。 3研究表明环糊精包结对映体的结合能和结合能的差异值与实验拆分有一定的 相关性。4考察了CE手性分析的主要影响因素，实验表明影响大小依次为， 、 CDs种类、DH、CDs的浓度和BGE的离子强度。Pr一一 同时，从药物分析的角度和按其要求，开展了CE异构体药物分析应用研 究。建立了混合取代基B-环

5、糊精一毛细管电泳法分离测定麻黄碱和伪麻黄碱， 对映体L-舒必利中D一型杂质检查，CDMEKC法测定山茱萸中齐墩果酸和熊果 酸的含量，羟丙基一B一环糊精毛细管电泳法分离测定日夜百服宁片剂中的伪麻 黄碱，以及TM顺反异构体的分离分析方法。CE在异构体药物分析应用中分别 选择了对映体麻黄碱、伪麻黄碱、舒必利；同分异构体麻黄碱和伪麻黄碱，熊 果酸和齐墩果酸；顺反异构体TM，系统的进行了分析方法建立和优化的研究， 并注意发挥CE的优势，上述所建立的方法涉及光学纯药物的杂质检查，原料 药、中药、复方西药及化学中间体的含量测定法。伪目前cE在复杂对象的药 、 物分析中应用，提供了有益的示例和理论依据。拓宽了

6、CE在异构体药物分析 中的应用范围。应用研究中舒必利光学纯杂质检查的研究资料通过了药监局的 | 审评。r卜，一 此外，本文合成5种8CD衍生物作为CE手性选择剂，为该类试剂研制 和国产化，提供了有益的尝试。同时，依据本实验和本学科相关工作的积累， 提出和建立CE在药物分析中研究和开发的一般策略。 关键词 管电泳，环糊精，扮析，机理 I ，j ， 1 要 摘 Abstract chiral of is relatedtothestereo Bioactivity drugsclosely structuresNowadays the and of isthetrendofnew research

7、 productionusage drugs opticallypure drugs The onchiral has oneofnew ofnew research become directions study drugs drugs in ofchiral importance internationallyAnalysisdrugswi也increasing in nowahot internationalscience research，is pharmaceutical analysis topic of At chiral is achievedtwo analysis main

8、ly by approaches：direct present drugs and is indirect enantioseparationDirectenantioseparationsimple，rapid，accurate role and a leading reliableHigllperformanceliquidchromatography HPLC plays in direct the of enantioseparation,whileapplicationscapillary a are fast inlasttwo decades，is increasingsigni

9、ficantlyCE，developedrapidly wim and separation higll sensitivity technique efficiency In dissolvedinthe CE chiral enantioseparation，theselector oradditive is twoenantiomerscanbe bufferto ehiral the environmentSo running provide tothedifferencetheinteractionsbetweenchiralselectorsand of separatedowin

10、g thusthedifferenceof enantiomersand electrophoretic is CE themost usedehiral CDs are widely selectorsPresentlyenantioseparation and focused differentkindsof on researchbetween cyclodextrins experimental research ofmechanism enantiomers，while lacking systematically of determinedmeans Inthis courseof

11、 inclusionWas by host?guest report，the calculatedmolecular molecular andthus Was association energy by docking the inclusion molecular mechanicsWith computer-assistedmodelingtechnique，the Was andthe mechanismCDsand between enantiomers investigated microscopically about resultswereas chiral Wasdiscus

12、sedThe followsFirstly, theory recognition at the chiral CDs mechanismof involvedcombination multi?point recognitionby and andCDs one determination chiral CDs，enantiomers by pointInrecognition by and formed inclusion structures reversible by complexes、i也differentproperties inclusion and outsideofCDsT

13、heinclusionCan within happen cavitycomplexation at have the atone or must multi-pointThere multipoint，whilecomplexationpoint achievechiral difference at to ofinteractionone outside complexationpoint can sidechain attached to betheentire or directly separationThispoint groups chiral canbe CDs which b

14、y always carbonSecondly,compoundschirallyseparated as have suchbenzene two skeleton structural ring， major features： 1 hydrophobic stereo Canincrease moleculesand theassociationbetween CDs； 2 the large energy VanderWaals with center certain connectedthe asymmetric groups provide skeleton on factors：

15、the H?bond may receptorshydrophobic interactions；r3 auxiliary 3 摘 要 introduce Hbond as interactions淅t11CDsSO toincreasetheassociation energy； 4 whenthestereo attachedthe all for to centercant group asymmetric supplyenergy onthe chainwhichCanformH-bond、航t11CDsassisted side recognitionthegroup thechir

16、al chiral and CDsis essenceof recognitionThe recognitionseparationby theinclusiontime toside skeletonCan chains，moreover owing hydrophobic prolong and the thatthereexisteda shorteninclusion Wasdemonstrated distanceThirdly,it certain of andchiral correlationbetweenthedifferenceassociation energy sepa

17、ration main CE were factors the Lastly,the enantioseparationinvestigatedThe influencing resultsshowedthe reduced tothe of influence order：type according CDs，pH， concentrationof and CDsionic strength outat researchon ofisomer wascarried the CE Application drugs analysis by sametime the anddemandsof a

18、s by angles analysis，such pharmaceutical determination of and CE， epheddnepseudoephedrineby test ofD-isomer in ofoleanolicacidandmalolinfructus impurityLsulpirideassay comi of in byCD-MEKC，determination tablets，and BaiFuNing pseudoephedrine ofcis-and like and trans?TMEnantiomer separation like and a

19、ndoleanolic sulpiride，isomer acid， ephedrinepseudoephedrine，malol cistrailsisomer likeTMwereselectedforthe researchThe application optimization and of methodsweiestudied andthe developmentanalysis systematically of were CE into theabove included advantages brought playAll applications testof of and

20、raw traditional material，Chinese impurityopticallypure assay drugs Westernmedicinesandchemical intermediates，which drugs，compound provided andtheoretical basisfor in good examples complex pharmaceuticalanalysis samples CEand extendedthe ofCEin isomers research by applicationscope analysisThe work of

21、 enantiomerhas test the SDA evaluation sulpiride passed by In derivativeswere offereda addition，five IB-CD synthesized，whichgoodtry for and ofthiskind thisarticle development domestic-product-scaleofreagents，and establisheda to inR&D ofCE general strategy ofpharmaceuticalanalysisaccording accumulati

22、onsofthis relatedwork and ofthis experiment subject KEYWORDS ChiralityCapillaryElectrophoresisCyclodextrins Mechanism Analysis 4 第一章 前 言 第一章前言 一、手性色谱分析概述 立体化学中，互为镜像，且不能叠合的分子定义为手性分子 Chiral 偏转的光学活性旋光性。结构中含有手性中心的药物称为手性药物。 现代药理认为药物的吸收、分布、代谢以及产生生物活性，一般均系通过 与生物体内受体、酶及蛋白质等靶点作用而产生结果，而这类靶点一般都是手 征性的，具有一定的三维结构

23、。当一个手性药物引入生物体后，生物体内三维 结构不同的手性受体、酶及蛋白质，能够识别或竞争性地与相应不同构型的药 物对映异构体作用。如果手性受体的绝对构型与手性药物的绝对构型互补，并 结合生成复合物，可将整个蛋白质或邻近蛋白质激活，产生生物活性，互补程 度越大，生物活性就越高，否则，就没有生物活性或者只有低的生物活性。因 此，手性药物的生物活性与其立体构型密切相关，构型不同，生物活性亦不同。 手性药物的一对对映体实际上是二个不同的生物活性物质，其对映体间的 活性往往存在着差异。某些手性药物具有不同类型的生物活性，一种构型是有 效的药物，而另一种构型则产生严重的毒副反应，因而在临床上有不同的应用

24、。 如：左旋麻黄碱的药效比右旋体高十倍；间羟叔丁肾上腺素，左旋体比右旋体 作用强4倍，心得安左旋比右旋强100倍。反应停的右旋体有毒性。 据统计在常用的1992种药物中，手性药物在全部药物中数量分布情况见表 l 1。 第一章 前 言 表11 常用的1992种药物中手性药物在全部药物中数量分布情况 手性药物 个 合计 类别 非手性药 个 单一的对映体 外消旋体 537 966 10 18 556 天然及半合成 6 11 1436 全合成 73 51、 506 352、857 597、 1992 5 合计 610 306、16 259、 863 4331 注 内为占统计总数的百分数 从表中可见，天

25、然和半合成药物中96以上是手性药物，且以单一对映体 的结构作为药用。全合成药物中手性药物占40以上，而目前其中87的手性 药物以外消旋体形式作为药用，这些外消旋体进入人体后，由于生物活性的差 异，效果很难预料。因此，手性药物研发具有非常重要的意义。 由于手性药物一对对映体的生物活性往往有很大差异，目前国内外发展趋 势是生产和使用手性纯的化合物。美国FDA在1992年提出，新药研究单位必 须测定每个药物的立体异构体的组成，对每个异构体的药理毒理活性进行研究， 并要求在报批资料中必须申报。中国新药审批要求也提出了相应的规定。 Catalysts公司统计，1993年世界手性药物制剂市场为356 据美

26、国Technology 的28，预计到2000年，手性药物市场值将占世界药物市场总额的30。近 几年药品市场上单一对映体药物每年以20以上的速度增长，目前正在开发的 1200种新药中，三分之二是手性药物，预计到2005年，全球上市的化学合成 新药中，60为单一对映体药物。由此可见，手性化合物具有相当大的市场发 展潜力，有望形成一个独特的工业部门，进行这个领域的研究具有很大的意义。 手性药物的研究和开发涉及多个学科和各种环节，其核心是手性合成或手 性拆分 从外消旋体中分得光学纯的单一对映体药物 ，分别进行各自的药理、 毒理及临床效果研究考察，并建立手性中间体、产品的质量控制方法。上述研 究均需要

27、建立快速、准确、灵敏和专属的手性分析方法。而目前手性分析缺少 6 第一章 前 言 有效的分离分析方法，它制约了手性药物的研究和开发。 互为对映的两个异构体，除旋光性外，其它物理和化学性质完全相同，而 常用的化学、光谱和色谱分析法是基于待测物的物理化学性质进行分离分析，因 此，不能或难于对手性化合物实现分离分析。只有在手性环境中，由于非对映体 的形成，物理和化学性质呈现差异，才可能实现对映体的分离分析。 对映体的分离分析主要有间接分析和直接分析。 间接分析是将对映体与光学纯试剂定量、完全反应，通过共价键生成较稳 定的非对映体衍生物，再通过一般的分析方法测定。其原理是：衍生化试剂 R -So 与外

28、消旋溶质 R Sa和 R -Sa形成非对映的衍生物，具有不同的物理性质，利用 这种性质的差异进行非对映体分离分析。 R j 月 一&一 月 一勋 月 一勋+f1一So 、 S 一 S 一曲一 R 一?Sb 图11生成非对映体衍生物 间接分析的优点是衍生化形成非对映体的理化差异大，适合于色谱分析，提 高分离度，且衍生产物具有发色或荧光基因，便于检测和提高检测灵敏度。局限 性是1衍生化引起分析方法快速、准确、精密和简便方面的指标降低；2需要高 4衍生反应 纯度的手性试剂；3待测物必须具有可发生衍生反应的活性基团； 条件要求温和、简便，且反应要定量和完全。间接分析的一个值得关注的问题是 理论上手性衍生试剂应该是100光学纯，如果不纯，衍生反应将生成4个立体异 构体，其中有两对对映体，而这两对对映体在非手性HPLC系统中是不能分离的， 只能得到二个色谱峰，因此，可能无法达到准确测定的结果。 直接分析是在分析 主要是色谱法 过程中引入手性环境，对通过氢键， 偶极叠合，冗7【相互作用或者疏水作用形成的不稳定而可逆的非对映体包结物 进行分离分析。对映体直接分析可通过设计手性固定相和手性添加剂的方法实 现。 第一章 前 言 直接分离分析基于引入手性环境，如HPLC中的手性固定相法，手性流动相 法，使对映体的理化性质在色谱过程中产生差异，再