布氏杆菌菌免疫磁珠检验标准方法.docx

1、布氏杆菌菌免疫磁珠检验标准方法DB32/TQ连云港市产品质量监督检验中心 发布2016-05-01 实施2016- 05 -01发布食品中布鲁氏杆菌抗原免疫磁珠富集增菌检验方法DB32/T -2016发江苏省地方标准B661前 言本标准适用于食品中布鲁氏杆菌的检验和鉴定。 本标准编制按GB/T 1标准化工作导则和GB/T 20001标准编写规则进行。本标准由连云港市产品质量监督检验中心提出。本标准由连云港市产品质量监督检验中心负责起草。 本标准主要起草人： 本标准于2016年5月首次发布。食品中布鲁氏杆菌免疫磁珠富集增菌检验方法11范围本标准规定了食品中布鲁氏杆菌的免疫磁珠富集检验。本标准适用

2、于牛羊肉和乳制品检测。本标准检出限为 20CFU/g12规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 20001.4-2001 标准编写规定 实验原理 利用免疫学原理，采用布鲁氏杆菌抗血清交联包被在磁珠表面制备成免疫磁珠，当免疫磁珠遇到菌体抗原产生结合，抗原抗体结合完成后再施加外来磁场，使得免疫磁珠贴与试管壁不被洗脱。然后将磁场消除，磁珠自然落入试管底部，采用非金属

3、接种环或采用加样器将结合菌体的免疫磁珠接种到选择性增菌液中增菌或划线与选择性平板分离培养。3设备与材料3.1 低温冷冻高速离心机。3.2 电动试管振荡器。3.3精密恒温水浴箱。3.4永磁架3.5天平（0.1g）3.6 拍打式均质器3.7 冰箱3.8 全支消毒自动加液器（带滤头）3.9非金属接种环 4试剂及培养基4.1 Dynabeads M-280 磁珠（日本DYNAL社产）或其他牌号的磁珠 4.2 牛布鲁氏杆菌抗血清4.3 羊布鲁氏杆菌抗血清4.4 羊抗兔Ig (G)4.5 布鲁氏杆菌选择性琼脂 见附录A4.6 布鲁氏杆菌增菌液 见附录A4.7 EDC solution 液：500mg ED

4、C in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min 4.8 NHS solution 液：250mg NHS in 1ml MES buffer. Use the solution in 2min注：EDC 与 NHS 必须现用现配。4.9 保存液：硼酸缓冲体系，0.005M硼酸，pH9.0，0.05w/w %Tween20，0.02w/v%NaN3，0.1w/v%BSA4.10 BST溶液：硼酸缓冲体系，0.005M硼酸，0.05 w/w%Tween204.11 MEST洗液：10mM MES，pH5.0，0.05 w/w% Tween 20实 验 流

5、 程吸取上清液50ml,3500r/min 15min,弃去上清液在离心管中加入1.0ml 0.45%氯化钠水，悬浮沉淀物，用无菌移液器将沉淀物转移到免疫磁珠管中，于10左右结合反应15min,上磁。 将免疫磁珠管倾斜，轻轻吸出管内溶液，加入0.45%氯化钠溶液1.0ml清洗磁珠5次。消磁。 将消磁后的磁珠用0.5ml 0.45%氯化钠溶液悬浮备用 将磁珠悬液吸取0.3ml接种于选择性增菌液中，或用非金属接种环划线与选择性分离培养基纯化培养。5免疫磁珠的交联制备： 5.1 将2mg 磁珠加入2mL Eppendorf管中 5.2 向管中加入500uL MEST（10mM MES，pH5.0，0

6、.05 w/w%Tween 20）对磁粒子进行洗涤3次（结合磁分离操作）。 5.3 加入EDC与NHS各2.5mg，调整最后反应体积为500uL，旋转器上旋转，37恒温，0.5小时。 5.4 活化后，用上述的MEST洗涤除去未反应的活化剂，再换管（去除管壁上可能吸附的活化剂），再洗涤2遍。5.5 再用BST液洗涤两遍后，再分散到BST中。 5.6 向每管中加入抗血清300 uL，调整最后反应体积为500uL，进行偶联，4，20小时。 5.7 用BST液洗涤四次（第一次需换管，一定要洗涤干净，每次洗涤时要将磁珠重悬吹散）。5.8 500L保存液重悬偶联好抗体的磁珠。5.9 采用DYNAL社产 D

7、ynabeads M-280 磁珠时用下列方法处理：5.9.1取羊抗兔 Ig (G)0.5ml，加1ml(PBS-Tween) 液混匀。5.9.1离心4000rpm/min，2min,弃去上清液（PBS-Tween）。5.9.3加PBS-Tween 液1ml使磁珠重新分散悬浮其中。5.9.4加布鲁氏杆菌免疫血清1ml ,4垂直于水平面、轻缓旋转振荡18h。5.9.5上磁，吸取液体并弃去。5.9.6消磁，用1ml洗液清洗，重复5.9.5步骤。5.9.7将洗净5次后的免疫磁珠放4冰箱备用。6样品制备6.1 冷冻样品应在45以下不超过15min或在25不超过18h解冻。若不能及时检 验,应放于15左

8、右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于610冰箱保存,在24h内检验。6.2 取样:在严格生物防护下以无菌操作进行。6.2.1肝脏:取器官不同部位。6.2.2去脂肪肌肉:剔除脂肪和结缔组织的肌肉。6.2.3乳汁:直接挤取的鲜乳汁。6.3以无菌操作称取50g检样放于均质袋中,以灭菌剪刀充分剪碎。液体直接吸取50ml于均质袋内。5.4加增菌液150mL,拍打均质15min,如无均质器,则应以剪刀尽量剪碎,并充分振荡。（所用器械必须回收到专用消毒箱内，因为该菌高度致病和传染风险极高！）6.5选择性增菌液于36培养48h。6.6 该菌生长缓慢，因此，增菌时间需要延长到8d后

9、方可排除阴性可能。7实 验7.1 将10ml 增菌液加到含有50ul免疫磁珠小管中，室温垂直轻缓旋转振荡20min。7.2 上磁架，用磁场架固定磁珠吸取样液弃去。（注意：弃去的样液要回收在专用容器内灭菌不得直接排出！该菌具有极强生物传染性！）7.3 加1ml洗液复混后同前操作。7.4 清洗45次后，加100ul PBS-Tween液使免疫磁珠和目标混匀备用。7.5 用塑料接种环划线接种到选择性培养基或增菌液中培养365d。7.6 直接样品吸附富集法：7.6.1 吸取样品均质液5ml,放入含有2mg免疫磁珠试管中，室温垂直轻缓旋转振荡20min。7.6.2上磁架，用磁场架固定磁珠吸取样液弃去。7

10、.6.3加1ml洗液复混后同前操作，用洗液清洗悬浮磁珠3次。7.6.4用0.45%氯化钠溶液1.0ml悬浮磁珠备检。8增菌培养和分离8.1将免疫磁珠备检液吸取0.5ml接种到选择性增菌液中,于37进行选择性适时增菌培养。8.2将免疫磁珠备检液用非金属接种环划线与选择性培养基或等效的选择性培养基上37培养5d。6.5 布鲁氏杆菌在选择平板上的典型菌落呈圆形,边缘整齐、湿润菌落,直径24mm。附录A培养基及试剂A.1布鲁氏杆菌选择培养基A.1.1成份白细胞介素2 - 1g赤藓醇 - 0.5g胰蛋白月示 - 20g葡萄糖 - 1g氯化钠 - 5g马学清 - 50ml维生素B1 - 0.5gD-环丝氨

11、酸 - 321.5mg甲基乙醚 - 1:20000多黏菌素B - 1:4000杆菌肽 - 1:25000放线菌酮 - 1:100000制霉菌素 - 10000单位微量元素液1mlPH 6.8 116灭菌 30minA1.2将除白细胞介素2、抗生素、马血清、维生素B1外的组分溶入900ml水中,微热溶解后115灭菌15min，当温度降到50时加入过滤灭菌的抗生素、马血清、维生素B1、白细胞介素2 100ml,趁热铺平板。平板冷却凝固后4备用。A2 布氏杆菌菌液A2.1成份牛肉汤500ml猪胃消化液500ml白细胞介素2 1g维生素B10.5g氯化钠2.5%马血清50ml赤藓醇0.5g多黏菌素B 1:4000杆菌肽 1:25000放线菌酮 10000微量元素液1mlPH 6.4-6.7 116灭菌30minA3微量元素液微量元素液成分：（1000ml含如下克数）硫酸锌 2硫酸锰 10氯化铜 1硫酸钴 2硼酸 0.5三氯化铁27三氯化铝10盐酸 50ml