基质效应.docx

1、基质效应液质联用技术中基质效应的评价方法王凌 王鹏 卓宏审评五部1. 前言 在人体生物等效性或临床药代动力学试验中，液质联用（LC/MS，LC/MSn）技术被广泛用于生物样品中药物及其代谢物浓度的检测。液质联用技术具有高灵敏度和高特异性的显著特点，研究者往往会认为采用该技术可以简化或者省去样品的前处理和色谱分离步骤。但由于质谱检测是基于化合物离子化并通过特定的核质比来检测和定量，因此任何干扰待测物离子化的物质都可能影响检测方法的灵敏度和选择性，即引入了基质效应（Matrix Effect，ME）的概念。基质效应是指在样品测试过程中，由待测物以外的其他物质的存在，直接或间接影响待测物响应的现象1

2、。由于质谱检测的高选择性，基质效应的影响在色谱图上往往观察不到，即空白基质色谱图表现为一条直线，但这些共流出组分会改变待测物的离子化效率，引起对待测物检测信号的抑制或提高。这些基质成分包含了生物样品中的内源性成分和样品前处理过程中引入的外源性成分。内源性组分包括无机盐或者胆汁中的有机盐、各种有机化合物（糖类、胺类、尿素、类脂类、肽类）和分析目标物的同类物及其代谢物。外源性组分尽管在生物样品中不存在，但同样会产生基质效应，包括处理样品的塑料管中残留的聚合物、离子对试剂、有机酸、缓冲液、SPE柱材料、抗凝管中的抗凝剂如EDTA或肝素锂等2。FDA在生物分析方法建立的指导原则中明确提出对于基于LC/

3、MSn的方法，在整个分析过程中需通过适当的方法减少基质效应的影响，从而保证方法的灵敏度和选择性1；EMEA在生物分析方法的验证指导原则（草案）中更加细化了基质效应的评判标准3。2. 评价方法 目前评价基质效应的方法主要有两种：（1）柱后灌注法（Post-column infusion method）和（2）提取后加入法（Post-extraction spiking method）4,5。其中柱后灌注法能直观的显示基质效应对被测物色谱保留时间的影响范围和影响程度，适合在色谱方法筛选过程中评估基质效应的影响情况，为色谱条件的优化提供信息。而提取后加入法不仅能量化绝对基质效应的程度，也能提供相对基

4、质效应的数据，因此广泛运用于方法学验证过程。2.1 柱后灌注法（Post-column infusion method）4 柱后灌注法属于动态分析基质效应的方法，将针泵及液相色谱系统通过T型进样阀与质谱仪相连。将空白样品按待测样品的处理方法提取后，利用待测样品的洗脱条件通过HPLC进行色谱洗脱，同时用针泵将特定浓度的被测物以恒定速度注入，两种溶液一并通过T型进样阀进入质谱仪，进行待测物离子信号强度检测。被测物信号响应的变化将直接反应生物基质对于被测物的影响，同时信号强度随时间的变化关系也有助于色谱条件的优化。2.2 提取后加入法（Post-extraction spiking method）

5、提取后加入法在评定LC-MSn基质效应中使用的最多，而且，此法还可用于评价绝对基质效应（absolute ME，基质效应影响分析的程度）和相对基质效应（relative ME，样品间基质效应大小的差异）。2.2.1 绝对基质效应的评价5 利用下述方法制备两组待测样品。 Set 1：将被测物溶于非生物基质的空白溶液，如：配制成甲醇、乙腈等标准溶液。 Set 2：提取空白生物基质，浓缩复溶形成溶液，将被测物加入此溶液中。 将上述Set1和Set2样品引入LC/MSn系统进行分析，获得待测物和内标的信号强度，其中待测物或内标在Set2和Set1中信号强度的比值(Set2/Set1)为绝对基质效应，可

6、以用基质效应因子(matrix factor，MF)来表示，待测物与内标MF的比值称为内标归一化基质效应因子(IS-normalized MF)3。绝对基质效应结果主要影响分析方法的准确度。2.2.2 相对基质效应的评价3 相对基质效应大小可以用IS-normalized MF的变异系数(CV)来判断。具体步骤如下：选择至少六个不同来源的生物基质，利用2.2.1方法测定上述生物基质中待测物和内标的MF（待测物浓度通常选择一个低浓度即可，其浓度应在3LLOQ以内），并计算内标归一化基质效应因子，利用获得的6个内标归一化基质效应因子计算变异系数，其值应小于15%。 如果由于某些特殊情况比如全自动在

7、线样品处理、收集和测定过程，无法中断程序按照上述流程制备得到set1和set2，则需要考察待测物和内标在不同生物样品（至少6个不同个体的来源）中响应强度的差异，以此来证明基质效应对于未知生物样本的测定结果影响可以忽略。具体步骤如下：(1)利用至少6个不同来源的生物样品制备一定浓度（3LLOQ以内）的待测标准品（每个生物样品同时至少制备3份）；(2)按正常样品测试方法测定这些待测标准品的浓度；(3)计算精密度（CV表示）和准确度，其中CV应小于15%；而准确度平均值的偏差应在15%以内，对任何样品，如果其准确度偏差超过20%则需要额外考察并判断原因。 对于方法验证而言，相对基质效应的结果直接影响

8、方法的准确度和精密度，较绝对基质效应更为重要，因此EMEA在生物分析方法的验证指导原则（草案）中并没有就绝对基质效应作出限制标准，而是要求6份内标归一化基质效应因子的CV15%。不过需要注意的是如果绝对基质效应影响过大，通常会表示基质对于方法的影响很大，往往导致精密度的实验结果不符合要求，因此在方法建立之初，如果条件允许，应尽可能降低绝对基质效应。3. 克服基质效应的方法克服基质效应的方法包括下面几种：(1)选择合适的样品预处理方法：常用的样品的处理方法包括蛋白沉淀，液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。通常 利用LLE或 SPE制备的样品内源性杂质较少，有助于降低绝对基质效应。但样品前处理

9、过程的复杂会降低分析检测的效率，增加污染的风险，并可能带来待测组分的损失，也直接影响待测组分的提取回收率。因此在样品制备方法的选择中要兼顾基质效应和提取回收率两方面的因素，选择合适的样品制备方法。(2)改变被测物的色谱分离条件：即通过优化色谱分离条件使得内源性杂质与待测物分离。采用反相色谱法分离时，最初流出的主要是基质中的极性成分，而这些极性成分往往是引起基质效应的主要原因。当待测组分的色谱保留时间较短时（10%。McNamura等发现血清冰冻可在免疫法（用apoAI与E抗体分离LDL）直接测定LDL-C时出现明显基质效应，血清冰冻保存226周后，LDL-C测定值平均偏低10%左右。 由于新鲜

10、血清与冻干血清的apoAI测定值一致，显示冻干对apoAI测定不产生基质效应，故apoAI参考血清以冻干形式提供。但冻干对apoB有极明显的影响，在不同原理的免疫法中，基质偏差高达-26%+4%，但这种变化也包括apoB分子本身的结构变化在内。所以apoB参考血清是液态冰冻保存的。5.减少基质效应的方法 Naito等（1993年）提出过减少基质效应的研究方向，至今仍有参考价值：改进室间质评样品，使其作用更像新鲜人血清。 改进仪器设计及试剂组成。 选择方法及方法学参数，使其适应性更强，且容易掌握，对制备物（校准物、室间质评样品与质控物）基质的确切性质不敏感。目前最常用的去除基质效应的方法是，通过

11、已知分析物浓度的标准样品，同时尽可能保持样品中基质不变，建立一个校正曲线（calibration curve）。固体样品同样有很强的基质效应，对其校正也尤为重要。对于复杂的或者未知组分基质的影响，可以采用标准添加法（standard addition method）。在这一方法中，需要测量和记录样品的响应值。进一步加入少量的标准溶液，再次记录样品的响应值。理想地说来，标准添加应该增加分析物的浓度1.5到3倍，同时几次添加的溶液也应该保持一致。使用的标准样品的体积应该尽可能小，尽量降低过程中对基质的影响。6.方法空白就是用不含样品溶质的样品溶剂在同样实验条件下做来校正方法。7.基质加标就是在样品

12、基质里加标，类似内标的意思。8.空白加标就是溶剂加标。这两样联合可推断样品基质对该标物的影响。平行样就是多做几个平行测定哈，减少误差的。9.Anal. Chem. 1998, 70, 882-889Matrix Effect in Quantitative LC/MS/MS Analyses of Biological Fluids: A Method for Determination of Finasteride in Human Plasma at Picogram Per Milliliter ConcentrationsB. K. Matuszewski,* M. L. Consta

13、nzer, and C. M. Chavez-EngAnal. Chem. 2003, 75, 3019-3030Strategies for the Assessment of Matrix Effect in Quantitative Bioanalytical Methods Based on HPLC-MS/MSB. K. Matuszewski, M. L. Constanzer, and C. M. Chavez-EngJournal of Chromatography A, 1058 (2004) 6166Matrix effect in LC-ESI-MS and LC-APC

14、I-MS with off-line and on-line extraction proceduresSandrine Souverain, Serge Rudaz, Jean-Luc Veutheydoi:10.1016/j.jasms.2005.07.012Evaluation of Matrix Effect and Chromatography Efficiency: New Parameters for Validation of Method DevelopmentEduard Rogatsky and Daniel SteinJournal of Chromatography

15、A, 1067 (2005) 153160Operational options to reduce matrix effects in liquid chromatographyelectrospray ionization-mass spectrometry analysis of aqueous environmental samplesAchim Kloepfer, Jose Benito Quintana, Thorsten Reemtsma药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2005，25(4)液相色谱一质谱法在生物样品药物定量分析中的基质效应齐美玲Mass Spect

16、rometry Reviews, 2006, 25, 881 899MATRIX EFFECTS IN QUANTITATIVE PESTICIDE ANALYSIS USING LIQUID CHROMATOGRAPHYMASS SPECTROMETRYW.M.A. Niessen, P. Manini, and R. AndreoliJournal of Chromatography A, 1123 (2006) 7181Tackling matrix effects during development of a liquid chromatographicelectrospray io

17、nisation tandem mass spectrometric analysis of nine basic pharmaceuticals in aqueous environmental samplesJet C. Van De Steene, Kjell A. Mortier, Willy E. LambertAnalytica Chimica Acta 567 (2006) 7986Matrix interference free determination of perchlorate in urine by ion associationion chromatographym

18、ass spectrometryJournal of Chromatography B, 852 (2007) 2234Systematic and comprehensive strategy for reducing matrix effects in LC/MS/MS analysesErin Chambers, Diane M. Wagrowski-Diehl, Ziling Lu, Jeffrey R. MazzeoJournal of Chromatography A, 1157 (2007) 108114Matrix effect in liquid chromatography

19、electrospray ionization mass spectrometry analysis of benzoxazinoid derivatives in plant materialM. Villagrasa, M. Guillamon, E. Eljarrat , D. BarceloJournal of Chromatography A, 1187 (2008) 5866Matrix effects in pesticide multi-residue analysis by liquid chromatographymass spectrometryAnneli Kruve,

20、 Allan Kunnapas, Koit Herodes, Ivo Leito一、基质效应的确认方法1、标准曲线测定法 配2组不同的标准曲线，每组包括5条标准曲线，每条标准曲线有从低到高的7个浓度点。即257=105个样品。2组标准曲线制备方法各不同：第一组，用流动相配制制成含系列浓度待测组分和内标的标准曲线；第二组，5种不同来源的空白生物样品经提取后加入第一组相同系列浓度待测组分和内标后制得。第一组的测定结果(A)可评价色谱系统和检测器的性能和整个系统的重现性。第二组测定结果(B)同第一组测定结果相比，若待测组分响应值得相对标准偏差明显增加，表明存在基质效应。ME(%)=B/A100此计算

21、出来的是绝对基质效应。相对基质效应通过对不同来源样品间的B值进行比较获得。当ME值等于或接近100时，表明不存在基质效应得影响；当ME值大于100时，表明存在离子增强作用，当ME值小于100时，表明存在离子抑制作用。一般me大于 85% 和小于115% 都无基质效应。2、柱后灌注技术将空白生物样品的提取液和空白溶剂分别进样进行液质分析，同时利用注射泵将含油相同浓度的待测物的标准溶液通过色谱柱与质谱接口之间的三通直接注入到色谱柱的流出液中。如果同空白溶剂的萃取离子图谱比，空白生物样品提取液的萃取离子图谱的响应信号明显减弱或增强，则有基质效应的影响二、绝对回收率：空白基质中定量加入药物经处理后所测

22、得峰面积 / 与基质相同体积水（血浆等我们一般用水代替）处理后加入相同量药物所测得峰面积*100%提取回收率：空白基质中定量加入药物经处理后所测得峰面积 / 空白基质处理后加入相同量药物所测得峰面积*100%基质效应：（1-空白基质处理后加入相同量药物所测得峰面积 / 与基质相同体积水（血浆等我们一般用水代替）处理后加入相同量药物所测得峰面积*100%）上面三者知道其二，也可以用下面的公式计算剩余的：绝对回收率=提取回收率 / （1-基质效应）相对回收率：测定浓度 / 标矢浓度基质效应问题一直是我们遇到的大问题，我这方面懂得也不多，建议：1）最好是优化前处理方案，从根本上解决基质效应问题。如果是液液萃取，改