BD流式细胞仪.docx

1、BD流式细胞仪简介流式细胞仪3流式细胞仪得临床检验项目 淋巴细胞亚群分析4肿瘤细胞D检测分析5白血病及淋巴瘤免疫分型 残余白血病检测.。6 网织红细胞计数.。7造血干细胞计数、。7 血小板疾病及活化血小板检测、。8 HLAB7检测器官移植得配型及免疫状态监控、。AIS诊断及治疗监控。9流式细胞仪得临床/医学研究10流式细胞技术得发展及国内现况。0建议流式细胞仪之机型-BD公司CSCur 仪器主要特点。.11 配套设施(计算机、软件、试剂、样本制备仪、售后服务)。.1 仪器主要技术参数5BD公司全球及中国业务介绍公司流式细胞仪培训计划B公司推荐配置单BD公司仪器与其她厂家仪器比较表一、简介流式细

2、胞仪(一)流式细胞仪概念流式细胞术(Flow Ctomty ,FCM)就是一种对处在液流中得细胞或其它生物微粒(如细菌)逐个进行多参数得快速定量分析与分选得技术。简言之,流式细胞仪就是测量染色细胞标记物荧光强度得细胞分析仪,就是在单个细胞分析与分选基础上发展起来得对细胞得物理或化学性质,如大小、内部结构、N、A、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集得高技术,CM以其快速、灵活、大量、灵敏与定量得特色,广泛应用于基础研究与临床实践各个方面,包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等,在各学科领域发挥着重要得作用、(二)原理待测样本得细胞悬液,在鞘液得包围与约束下,细胞

3、排成单列高速由流动室喷嘴喷出,形成细胞液柱。当液柱通过检测区,在入射得激光束照射下产生前向散射光(FSC)与侧向散射光(SSC),它们分别反映细胞大小与颗粒度,根据这些特性可以将细胞分类、经一种或几种特殊荧光标记得样本,在激光束得激发下所产生得特定荧光,可被光学系统检测并输送到计算机进行分析,得到细胞相应得各种特性。(三)流式细胞仪检测得细胞特性细胞结构组成细胞功能大小细胞表面、胞浆、核特异性抗原粒度细胞活性DNA、RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子、pH值、膜电位酶活性二、流式细胞仪得临床检验项目目前在国内最常见得临床应用有两大类:一为肿瘤细胞得DNA含量析;另一为细胞表面得

4、表型测定,包括淋巴细胞亚型分析、免疫功能监测、白血病与淋巴瘤免疫分型、残余白血病检测、以及HA-B27组织抗原检测等等。1、淋巴细胞亚群分析 淋巴细胞亚群分析可以通过相对计数、绝对计数与率得变化监控疾病状态下得免疫状况(如肿瘤、感染性疾病、免疫性疾病等),以此辅助诊断、追踪病情发展及决定用药时机。 检测原理:利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面得抗原结合,再配合多色荧光染料,即可以把各种不同功能得淋巴亚群区分开来,进而得到各亚群得相对比例。最常检测得亚群包括细胞(CD3)、B细胞(CD19)、NK细胞(C165)、辅助性T细胞(CCD4)与抑制性细胞(CD8+)等。应用实例:SimulSET系统利

5、用CD4/D45设门技术精确检测淋巴细胞亚群比例。 * 其中绿色细胞群体为淋巴细胞,红色为单核细胞,蓝色为粒细胞。2、NA分析肿瘤细胞得DNA倍体分析就是流式技术另一重要应用,临床上可对一些恶性肿瘤进行早期诊断,跟踪随访与早期治疗,大大提高一些肿瘤得治愈率与生存率。检测原理:正常人体细胞得DNA含量就是二倍体,细胞群体具有特定得增殖比例。通过检测细胞得DNA含量与增殖比例,可以了解细胞群体得倍体性与增殖能力。具体操作时,先将实体组织制备成单细胞悬液,用固定或去污剂在细胞膜上打孔,使DA特异得荧光染料如PI(碘化丙啶)导入细胞核,I与DNA缄基对特异结合后上机检测得荧光强度,并进行数据分析、应用

6、实例:乳腺癌病人得手术标本分析图。其中红色群体为二倍体,黄色群体为异倍体、3、白血病与淋巴瘤免疫分型正常白细胞在其分化过程中,随着系列得不同、成熟阶段得差异,会在细胞膜表面表达不同得分化抗原。白血病细胞则在癌变得过程中,丧失了正常细胞底系列专一性与分化阶段规律性,在本质上有别于正常骨髓细胞。应用此特点可进行免疫表型分析,以鉴别各种白血病与淋巴瘤,辅助临床诊断、评估疗效与预后。常用得抗原包括:CD3、C5、7、D19、CD20、CD、CD10、HLADR、CD1、14、CD33、CD34、GLY-A、M等等、应用实例:利用CD45三色分析急性髓性白血病。* 左图为正常骨髓,绿色为正常淋巴细胞,深

7、红为单核细胞,玫瑰红为成熟粒细胞,浅蓝为有核红细胞,深蓝为未成熟细胞;右图为急性髓性白血病图形,可见与正常明显得差别。4、残余白血病检测残余白血病就是指经过适当得治疗、疾病缓解后仍残留在病人血中得极少量白血病细胞、通常白血病病人经过化疗后得疾病复发率为680%,经过自体或异体骨髓移植后得复发率仍偏高(20)、所以如果能早期检测到复发得迹象,即白血病细胞得再增生,则可以提前给予病人及时恰当得治疗、 依照不同得白血病,选用不同得抗体组合(如下表)来检测残余白血病。流式细胞术可在一万个骨髓细胞中检测到一个白血病细胞;尤其就是d得应用大大提高了检测灵敏度。白血病种类可选择得抗体组合TALLyto 3/

8、TdTBCD13/T,CD3/TPreB-ALLcyto /TdTMCD13/TdT, C3/T, C7TdT 、网织红细胞分析网织红细胞计数就是骨髓红细胞造血功能得重要指标。传统手工计数耗时耗力,缺乏准确性、流式细胞仪网织红细胞计数系统由于采用系统试剂与全自动软件,可在短时内分析大量细胞,低水平网织红细胞也可达到统计分析精度,省时省力,结果正确可靠。左图中红色群体为红细胞,右图利用RN染料噻唑橙(T)区分成熟红细胞与网织红细胞、造血干祖细胞检测在治疗恶性血液病时,大剂量化疗或放疗摧毁有病得骨髓后,干细胞移植保证了健康得干祖细胞重建骨髓,产生正常得血细胞,实体肿瘤病人亦可通过干细胞移植抗衡大剂

9、量化疗导致得致死性血液毒性、与大剂量化疗相配合得干细胞移植已在临床大大提高了某些肿瘤病人得长期存活率,如乳腺癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌等。另外,干细胞移植与再生障碍想贫血、免疫缺隐、血红蛋白病等非恶性造血系统疾病治疗得相关性也正在研究中、上图中红色群体就是经过多参数设门后精确设定得CD34阳性细胞群体,绿色部分就是进行定量计数得标准微球、7、血小板疾病及活化血小板检测 通过血小板膜糖蛋白得检测可以诊断先天性或获得性血小板疾病如Brnrd-uir综合征(D42-42a),血小板无力症(CD1CD),免疫性血小板减少等等、 评价血小板活化程度得应用领域包括:缺血性冠状动脉疾病如心绞痛、心肌梗死、

10、血管成形术、心肺旁路术等;缺血性脑血管病如脑梗塞、IA、脑动脉硬化等;糖尿病;恶性肿瘤;高血压病;高脂蛋白血症;高粘滞血症;抗血小板药物机制研究与疗效监测;吸烟;情绪性应急等。 应用实例:CD6/C2/PC三色标记分析血小板活化、 8、AB27检测 由流行病学统计结果显示,HL-27基因型阳性得人患数个遗传性免疫疾病得机率,比一般人要高很多,以强直性脊柱炎为例,约为8倍。因此HA27检测可以有效帮助临床鉴别诊断强直性脊柱炎等血清阴性骨关节疾病。其她相关性疾病有:遗传性关节炎如Reitrs综合征, 反应性关节炎,肠性关节炎等。 检测时选用CD3/HLA27双标记抗体,圈定T淋巴细胞亚群,再分析其

11、细胞表面就是否表现HA-组织抗原。因为细胞表面只表达ls型HLA抗原,可避免Class型LA抗原引起得误差、应用此法无需分离细胞,比传统得微量细胞毒实验节约时间,且检测结果更敏感、客观、容易判读。9、器官移植得配型及免疫状态监控以流式细胞仪进行器官移植前配对(FowCtoetr Cos Match,FCCM)得优势在于抗体检测得特异性、敏感度以及检测结果与手术成功率之相关一致性。利用多参数测定,可了解受者血中就是否有抗供者抗体,此抗体与供者得哪种白细胞反应,以及该抗体就是否会造成细胞毒性。移植前得评估包括H配型及混合淋巴细胞反应,移植后得评估包括外周血淋巴细胞亚群测定、抗供者抗体检测等等。移植

12、后定期检查外周血淋巴细胞亚群,可以预估排异反应,以及病毒感染等问题。0、ADS诊断及治疗监控 由于 特定细胞群体得绝对计数在临床诊断与治疗上具有极大意义,如D4+细胞绝对计数可辅助IV监控治疗,也可通过定量标准微球得到亚群得绝对数值、应用实例:检测艾滋病人血中辅助T细胞与抑制T细胞得比例及绝对数。三、流式细胞仪得临床医学研究流式细胞仪应用得灵活性允许临床医生科学家们充分发挥想象,满足她们得临床研究需要:细胞免疫功能、细胞凋亡、胞内细胞因子、胞内C2+及 PH值、多药耐药性、寄生虫、细菌、病毒、环境科学等等。流式细胞仪多参数分析配合细胞分选,可以提供样本得更多有效信息。细胞分选就是确认细胞形态、

13、进行后续分子生物学研究(如ISH、PCR等)或细胞功能性研究得理想手段。四、流式细胞技术应用得发展及国内现况 从93年,Cprson与Thorell以细胞得计数开始,试图寻找研究细胞得新工具,到7年,D公司与美国斯坦福大学合作,研制开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FAC,流式细胞术进入了一个空前飞速发展得时代。进入九十年代,流式细胞术作为一门生物检测技术已经日臻完善,仪器得硬件平台也已达到稳定得技术状态,科学家们、仪器制造商们又纷纷将研究焦点转向荧光染料得开发、单克隆抗体技术、细胞得制备方法与提高电子信号得处理能力上来,以拓展日趋广泛得应用领域、流式细胞技术得强大生命力植根于生物学、医学得

14、各个领域,正就是无数日新月异、变化多样得应用项目在全球范围内推动了流式细胞技术得发展、自191年, 北京师范大学生物系引进中国第一台流式细胞仪(FACS ,BDIS)至今,各种型号得流式细胞仪在国内安装使用已超过300台,其中BD公司得流式细胞仪近230台(ASCalibr已超过14台,详见附录2“BD公司国内流式细胞仪用户名单”)。从仪器引入中国二十年得发展历史来瞧,最早得流式细胞仪大都应用在纯科研领域、随着流式技术得发展,方法学得成熟,尤其就是越来越多得用于临床得试剂推出,流式细胞仪已成为国内各大教学医院与医学中心重要得诊断工具,被广泛地应用于新得临床实验上。五、建议流式细胞仪之机型-BD

15、公司FACSCalibur:FDA通过得世界唯一全自动四色台式分选机FCSCliur集分析与分选功能为一身,配置灵活,结合自动化得样本处理系统、极宽得试剂选择范围、强大得计算机与软件系统,绝对配合今天高效多能得实验室需要、FACSlibur性能卓越,不仅通过其用户友好得整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、D、网织红细胞、血小板、绝对计数等临床分析,FACSCalibu更以其完美得四色分析与独特得分选功能成为遗传、肿瘤、血液、免疫功能等诸多研究不可或缺得重要工具。(一)、FACSlb仪器主要特点完美得四色分析系统D专利得立体空间激发系统采用双激光实现4色分析,最大程度地减少荧光信号之间得补

16、偿,提高检测灵敏度;双激光得应用大大扩展了染料得选择范围,相应地扩大了仪器得应用领域、立体空间激发系统为流式细胞仪多色分析设立了行业标准,并使染料得选择更为自由,避免了染料之间得相互干扰。独特得分选及浓缩系统ACSCabu就是世界上目前唯一得台式分选机。ACSCalibur采用不同于传统分选方式得“捕获管(catc tuer)”新技术,使整个分选操作极其简便,无需长时间液流稳定,只需设定感兴趣得细胞群体,鼠标轻轻一按就能实现对目标细胞得分选。细胞可分选到试管中,或根据需要直接分选到细胞浓缩系统提供得滤膜或培养皿上、FCalibur分选为全封闭系统,安全性好,可实现无菌分选与细胞培养。细胞浓缩系

17、统使细胞回收简单方便,减少离心步骤,大大提高细胞回收率。自动化程度高FACSCaibur以用户为中心得系统设计,从自动化样本处理、自动上样,到按钮式液流控制、自动化软件获取与分析,每个环节操作都保证简便快捷,并提供准确客观得实验结果,重复性极好。分析速度快CSCaliu荧光检测全部采用大型流式细胞仪国际通用得光电倍增管以保证最快得分析速度1000个细胞秒,避免了使用-导致得低速度。FACSalibr就是目前世界上分析速度最快得台式机。NA分析得解决之道 DDM (Double Dciinatidu)双粘体辨别模式通过FW与L2A检测分析区别实体组织标本中得粘连细胞群体,最大程度得减少假阳性,就

18、是实体组织标本DNA分析不可缺少得工具之一。唯一得双参数阈值设定最大程度减少无关噪音,增加获取分析速度,从而使含量极微得细胞检测成为可能。开机无需等待开机后即可检测样本。机器无噪音、设计灵活,提供多种配置供用户选择第二根激光、分选及其浓缩系统、自动进样系统等都可以由用户根据实际需要与资金情况自由选配。(二)、配套设施、Atation数据处理系统 采用最先进得Macinosh苹果计算机系统,用户友好MacOS界面设计,易学易操作;与PC兼容性好,数据可在PC机上分析;网络功能强大,可与Internet与Inranet连接;不易感染病毒超强图形处理功能,可进行多维多色分析,就是处理流式数据最佳得选

19、择。最新配置Mcntosh G4:51AM; 8GB Had Dsk; RW,容量大,为回顾性研究带来方便; 多媒体系统; 17 高分辨率纯平显示器 FACStton提供多种功能强大得自动化软件用于数据获取、分析与报告。并提供多媒体学习光盘、主软件CelT具有完成所有流式实验得仪器设置、数据获取与统计分析等功能,设计灵活全面,就是流式细胞仪系统不可缺少得全能工具。全面配合各种临床检验得自动化软件系统包括:FCSCop 自动校准仪器设置进行质量控制,自动设置流式双色、三色、四色分析条件,并可选择进行样本设置条件得优化。自动存储仪器条件、SimulSET双色淋巴细胞自动化分析:D45D14自动淋巴

20、细胞精确设门与分析;软件内一致性检测作为内在质控;可自行定义抗体组合,灵活方便;自动打印标准化实验室报告、医生报告与总结报告。MutiST三色与四色淋巴细胞自动化分析:提供C4/SC淋巴细胞门得手动与自动设置与分析;应用Attato技术自动检查细胞群体位置漂移;客户可自定义试剂与抗体组合;绝对值定量简单快速准确;自动打印标准化实验室报告、医生报告与总结报告。oUT 造血干祖细胞自动化分析软件;使用rONT试剂自动获取分析造血干细胞;与TroCONT管组合实现绝对计数;操作简单,快速;降低CD3计数得变异;自动打印标准化实验室报告、医生报告与总结报告。HLAB2自动分析软件;自动获取分析报告全血

21、HLAB2结果:支持H-B27系统试剂;应用FACLoader组合可实现自动获取批量分析;配合FCSp 软件进行自动校正;自动打印标准化实验室报告。MdFT 高精度A自动分析软件:快速正确DNA分析;强大得批量分析功能;便捷得数据库输出;自动打印标准化实验室报告。Attrcor 多色自动快速批量分析软件:独家专利全自动设门技术可快速准确圈定客户自定义得目得细胞群;最小群体标色算法便于分辨小群体ReicCNT 网织红细胞计数自动化软件:自动设门分析报告网织红细胞计数,检测重复性好,低水平网织红细胞也可达到可靠得统计精度。QuaniCAC 标准荧光定量分析:分析获取QatiBRT试剂或微球得资料时

22、,FL2轴自动转化为每个细胞上抗体数(AC)自动进行荧光定量;无限得条带设置充分满足对所有感兴趣细胞群体得研究;强大得数据库满足长期研究与大型科研工作需求Painta-gat相互作用多维资料分析软件:独家专利混色算法可同时分辨与显 示多个细胞群体;强大得上色工具为研究复杂资料间 相互关系提供帮助。2、全面得配套试剂BD公司提供通过A标准得体外诊断临床试剂与广泛得科研试剂,并拥有全面得质量控制与质量保证产品线以确保检测结果得可靠性:包括仪器状态、实验方法全程控制、绝对计数控制以及试剂配套中一致性检测等,如:aliBRITE微球 配合全自动软件ACop可自动进行仪器得灵敏度、补偿等校正,确保仪器正

23、常运行、其设置条件还可用于淋巴细胞分析。D Multi-Chec 全血质控试剂全程监控免疫表型分析检测结果得准确性。BD ultiChec CD4 W为艾滋病检测提供标准。BDteCounont为D34阳性细胞检测质控物,监控D4造血干细胞检测结果。uCUNTCntro 可确保绝对计数得线性精度、D Q保证DNA 分析得线性与分辨率均达到最佳、(详见试剂报价单)另外,PMG、TL、Clontech等BD子公司得涵盖细胞生物与分子生物各领域得试剂供应将满足您多方位得需求。(详见附录2 B公司全球及中国业务介绍)。 3、样本制备仪免疫样本制备仪D FCS SpePocss SP1采用免洗程序,为细

24、胞免疫表型分析提供自动化样本处理,简单易学,安全性好、NA样本制备仪BD公司得Medmaci系统就是一套安全得,标准化得样本制备系统,可对植物或动物得实体组织进行自动机械分离,为流式分析、细胞培养、或DNA扩增技术提供高质量得样本,就是对各种类型得组织实现标准化得样本处理得最佳选择。4、售后服务BD公司深知每一台仪器正常运转得重要性,所以每一台ACCalibr、每一个软件与每一个试剂背后都有着最及时、最专业得支持。D总部率先建立了流式行业第一个在线远程诊断系统,用户通过互联网与B总部进行实时得网上交流,BD技术支持专家在自己得计算机上瞧到用户得问题并迅速提出评估与解决方案、在中国,BD建立了专

25、业资深、经验丰富得工程师队伍与技术支持队伍,为用户提供仪器安装调试、维修保养、技术培训与咨询等服务。另外来自D、PMG、CLOTECH、Tnsdcton Loratory等总部科学家们得不遗余力得技术支持也就是我们得有力后援、FACS品牌流式细胞仪在中国得二十年发展,拥有由一大批国内知名专家、教授组成得用户群体,她们也成为了D流式技术在中国推广、发展得主要动力、BD公司每年召开得用户大会,论文交流与新技术介绍讲座,以及定期出版得ow Cymet专业技术杂志保证了用户及时了解最新得技术进展与相互交流。(三)FACSCaibur仪器主要技术参数: 参数项目参数指标 功能特点标准激光器第二激光器15

26、mw,48气冷氩离子激光、用于3色荧光分析6m半导体激光实现完美四色分析厂家保证激光管寿命500个小时通过双激光立体空间激发方式实现四色荧光分析:即第一激光器激发得三色荧光与第二激光器激发得第四色荧光之间不会互相干扰,最大限度地减少了荧光信号得重叠(各吸收峰相差5nm以上);增加了荧光染料得可选择范围可选荧光染料:ITC、PE、erCP、PI、 PC、Y-5、AO等光斑大小22 X 66u Laser113 X66u Ls2流动室430m 180um测量参数FC,SC,1,L2,FL3,L4*光电倍增管光谱检测范围300nm110nm电压10V9电压较小,灵敏度大最小检测颗粒大小0.um(mn

27、)5um(max)检测灵敏度10 ES检测分辨率 CV2(全峰宽)*样本获取速度1,00个/秒(标准)脉冲处理系统D专利,能同时分析峰值、脉冲积分(面积)及脉冲宽度用脉冲宽度与面积可区分双连体细胞(如假四倍体细胞),减少假阳性结果*分选装置0个秒目前唯一可做细胞分选得台式流式细胞仪,操作简单,无须长时间稳定液流。分选纯度达99、,全封闭液流系统实现无菌分选。工作站FACStionMaintsh 4/733256M RM40GBard DiskCDRW1M ZipDrivaOS.具有网络功能,能与普通微机连网苹果电脑具有超强得图形处理功能;10B Zip外存盘,体积小,容量大,为回顾性研究带来方

28、便;多媒体系统;不易感染病毒与PC机得兼容性得解决之道:免费下载得WNMDI2、6在PC上轻松分析苹果获取得数据。软件系统主软件:Ceest 多种全自动软件:FACSpMoiitAtractorsimulSTMultiSTHL-B27PoCOUNTPant-GATE tCOUNTQuaniBE(可选)C(可选)主软件Cellust就是在视窗平台下开发,集获取,分析与分选为一体,主要特点:1.多窗口2.具有实时分析(on ie)功能3.自动软件方便临床试验,保证1分钟之内出报告直方图与点图坐标分辨率1024与256channl24X104 channel25X256 hannL进样口与检测点距离15cm距离短,所需样本量少,节约单抗;距离短,减少了样本之