基因克隆备课教案.docx

1、基因克隆备课教案备 课 教 案学年学期：2011-2012秋季学期课程名称：基因克隆主讲教师：李海英授课对象：2009级生命科学学院本科黑 龙 江 大 学第 1 教学周/第 3.4.5 节 （第 1 次课）教 学 基 本 内 容备注教学目的：通过本章的学习，使学生掌握基因克隆、重组DNA等相关概念，同时介绍基因工程的发展简史和基因工程的巨大意义，引导学生对科学的严谨、谦虚态度。教 具：多媒体课件教学重点：DNA嵌合体概念课时安排：3学时教学难点：基因克隆与基因表达的技术路线的区别教学内容： 第一章 绪论一、基因工程的概念1. 基因工程（genetic engineering）、遗传工程、重组体

2、DNA技术2. 嵌合DNA、DNA嵌合体（DNA chimera)3. 分子克隆（molecular cloning)、基因克隆 (gene cloning)、重组DNA (recombinant DNA)4. 基因工程的操作步骤（1）基因克隆的操作步骤（2）基因表达的操作步骤二、基因工程发展简史三、基因工程的巨大意义1. 利用微生物制药（1）利用微生物生产胰岛素（2）重组微生物生产生长激素（3）重组微生物生产干扰素2. 克隆技术（clone technology）（1）克隆的概念（2）器官移植（3）干细胞研究及人类伦理观念3. 基因工程育种（1）基因改造的农作物（2）转基因动物四、基因工程的

3、安全性问题复习题1、基因克隆与基因表达技术路线的区别。 2、收集整理有关转基因植物、转基因动物的报道和照片资料。 1、启发式教学内容：启发学生的学习科学和实验操作的态度。2、互动教学内容：课堂讨论克隆的伦理道德问题。3、启发式教学内容通过对转基因植物和转基因动物的介绍，激发学生的学习兴趣。 第 2 教学周/第 3.4.5 节 （第 2 次课）教 学 基 本 内 容备注教学目的：本节主要讲述有关“限制性核酸内切酶”的相关知识，通过对大肠杆菌限制-修饰现象的讲解，引导学生探究宿主控制性限制的生物学机理；掌握各类限制性核酸内切酶的生物学功能和命名原则。教 具：多媒体课件教学重点：型限制性核酸内切酶的

4、特点和限制性核酸内切酶生物学功能的英文表述。课时安排：3学时教学难点：限制-修饰现象的理解教学内容：第二章 基因工程的工具酶第一节 限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶的发现 1. 发现过程2. 相关概念（1）限制 (restriction) （2）修饰 (modification) （3）宿主控制性限制(hostcontrolled restriction) 3. 限制性核酸内切酶的生物学功能Restriction-modification systems occur in many bacterial species, and constitute a defense mechanism

5、against the introduction of foreign DNA into the cell. They consist of two components; the first is a restriction endonuclease, which recognizes a short, symmetrical DNA sequence, and cuts (hydrolyzes) the DNA backbone in each strand at a specific site within that sequence. Foreign DNA will hence be

6、 degraded to relatively short fragments. The second component of the system is a methylase, which adds a methyl group to a C or A base within the same recognition sequences in the cellular DNA. This modification renders the host DNA resistant to degradation by the endonuclease.二、限制性核酸内切酶的分类1. 型限制性核酸

7、内切酶2. 型限制性核酸内切酶（1）一般性质（2）型酶的识别序列与切割作用A. 识别序列B. 平末端（blunt/flush end/termini)C. 粘性末端（sticky/cohesive end/termini)（3）型限制性内切酶的特点（4）酶切位点的计算3. III型限制性内切酶三、限制性核酸内切酶的命名复习题一、填空题1、完全的回文序列具有两个基本的特点，分别是（ ）和（ ）。2、由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是（ ）。3、第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是（ ）。4、核酸内切酶命名原则是，第一个大写字母取自（ ），第二、三两

8、个字母取自（ ），第四个字母则用（ ）表示。二、简答题下面几种序列中，那些最有可能是类酶的识别序列，为什么？ GAATCG，AAATTT，GATATC，ACGGCA1、课前提问（1）DNA嵌合体概念（2）基因克隆的操作步骤（3）基因表达的操作步骤2、通过对大肠杆菌限制-修饰现象的描述，引导学生探究其中的原因。3、利用对Smith和Nathans获得1978年诺贝尔生物医学奖的介绍，激励学生探索生命的奥秘。 4、注意区别粘性末端和平末端、同裂酶和同尾酶两对概念。第 3 教学周/第 3.4.5 节 （第 3 次课）教 学 基 本 内 容备注教学目的：通过本章的学习，使学生掌握天然DNA的制备、纯化

9、和浓缩以及限制性内切酶反应系统的建立，本章重点内容是影响限制性核酸内切酶活性的各种因素，并要求学生掌握限制性核酸内切酶的星活性、限制性图谱等概念。教 具：多媒体课件、教具教学重点：影响核酸内切限制酶活性的因素课时安排：3学时教学难点：DNA分子的限制性图谱的构建教学内容： 第二章 基因工程的工具酶 第二节 DNA分子片段化一、天然DNA的制备 1. 天然DNA的来源2. 天然DNA的提取 二、DNA的纯化 三、DNA的浓缩 四、限制性核酸内切酶反应系统 1. 限制性核酸内切酶反应缓冲液 2. 单酶切法 3. 双酶切法 4. 部分酶切5. DNA分子的限制性图谱五 、影响核酸内切限制酶活性的因素

10、1. 性活性2. DNA样品的纯度3. DNA甲基化的程度4. DNA的分子结构5. 侧翼序列长度6. 酶切反应缓冲液7. 酶切反应温度和时间复习题1. 什么是限制性内切酶的星活性？受哪些因素影响？2. 分别用EcoR、Hpa、EcoR+Hpa酶切一个DNA片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离 DNA片段，溴化乙锭染色后观察DNA带型（如下图），请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明EcoR和Hpa识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。并请写出分析的过程 1、 课前提问型限制性核酸内切酶的特点。2、互动教学内容：让学生总结DNA的制备、DNA的纯化和DNA的浓缩三个概念的区别，

11、引导学生利用比较的方法学习知识。 第 4 教学周/第 3.4.5 节 （第 4 次课）教 学 基 本 内 容备注教学目的：通过本章的学习，使学生掌握DNA聚合酶概念、分类、各种DNA聚合酶的性质和用途，以及对一些专业名词的正确理解，如间断、缺刻等。教 具：多媒体课件教学重点：各种DNA聚合酶的性质和用途课时安排：3学时教学难点：用切口平移（缺口转移）方法标记DNA以及一些专业名词的正确理解。教学内容： 第二章 基因工程的工具酶第三节 DNA聚合酶 一、DNA聚合酶概述1. DNA聚合酶（polymerase）的概念 2. DNA聚合酶的分类（1）以DNA聚合酶I为代表的“合成型”；（2）以kl

12、enow聚合酶为代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性；（3）逆转录酶类，以RNA作为聚合模板。二、大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）1. 性质2. 用途：用切口平移（缺口转移）方法标记DNA三、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）1. 性质2. 用途四、T4噬菌体DNA聚合酶1. 性质2. 用途五、T7噬菌体DNA聚合酶1. 性质2. 主要用途六、Taq DNA聚合酶1. 性质2. 用途：用于PCR反应，使得PCR技术得以推广。七、逆转录酶（reverse transcriptase）（依赖于RNA的DNA聚合酶）1. 性质2. 用途复习题一、填空1. T4 DNA聚合酶与Kleno

13、w酶一样，具有53 聚合酶和3 5外切酶两种活性，但它的35外切酶活性比Klenow酶强（ ）倍，T4 DNA聚合酶作用于（ ）链的活性要强于（ ）链。2. 反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有（ ）的作用，可以将DNA -RNA杂种双链中的（ ）水解掉。二、判断题1. 反转录酶能够以单链RNA或DNA为模板，在引物的引发下合成一条互补的DNA链。2. 以 RNA为模板，用反转录酶可同时产生单链和双链的 cDNA，双链 DNA是由自身引物引导合成。三、问答题如何利用T4 NA聚合酶制备3隐含末端或双链平末端？1、课前提问：（1）影响限制性核酸内切酶活性的因素有哪些？（2）双酶切时有哪些是需要

14、主义的问题？2、 启发式教学内容：（1）启发学生比较间断（discontinuity）和缺刻（nick）两个概念。 （2）引导学生比较三类DNA聚合酶在作用方式上的差别。3、课堂活动内容：大肠杆菌DNA聚合酶I同时具有53方向的聚合酶活性和35核酸外切酶活性，这意味着即使53方向的聚合酶活性新合成了DNA分子也会立即被其同时具有的35核酸外切酶活性所降解。真实情况是这样的吗？4、课堂互动内容自1983年PCR技术问世年到发明人 Dr. Kary Mullis 1993年获得诺贝尔化学奖经历了10年的时间，那么一项技术得到广泛应用、认同需要什么？第 5 教学周/第 3.4.5 节 （第 5 次课

15、）教 学 基 本 内 容备注教学目的：通过对本次课的学习，重点使学生掌握锚定PCR、不对称PCR和反向PCR三种特殊的聚合酶链式反应以及一种分子标记技术RAPD。教 具：多媒体课件教学重点：三种特殊的聚合酶链式反应的原理课时安排：3学时教学难点：RAPD技术的基本原理教学内容：第二章 基因工程的工具酶第四节 聚合酶链式反应及应用一、 锚定PCR1. 已知序列3端区域的扩增 2. 已知序列5端区域的扩增 二、不对称PCR三、反向PCR 第五节 RAPD技术一、多态性（polymorphism)1. 多态性/差异性的概念2. 多态性的种类3. 多态性产生的过程4. 多态性的相关技术二、RAPD基本

16、原理三、技术问题1. 引物 2. Mg2+浓度要求四、RAPD技术的应用1. 遗传指纹作图 2. 检测遗传多样性与稳定性复习题1. 生么情况下可以考虑使用不对称PCR?2. 反向PCR的原理？3. RACE技术的原理？1、课前提问：（1）缺刻（nick）和间断（discontinuity）两个概念。（2）比较各种DNA聚合酶的活性用什么不同之处。互动内容：提问常规PCR的原理，引导学生思考如果目的片段两侧的序列未知，而是只知道目的片段中间的一部分的序列信息，用什么方法可以获得目的片段？第 6 教学周/第 3.4.5 节 （第 6 次课）教 学 基 本 内 容备注教学目的：通过对本次课的学习，重

17、点使学生掌握DNA连接酶相关知识，如DNA连接酶的特性、粘性末端连接技术、连接反应的建立等。教 具：多媒体课件教学重点：DNA连接酶的功能和粘性末端连接技术课时安排：3学时教学难点：粘性末端连接技术教学内容：第二章 基因工程的工具酶第六节 DNA连接酶（ligase） 一、连接酶反应1. 间断修复功能2. 连接功能二、常用的DNA连接酶1. E. coli DNA连接酶 2. T4 DNA连接酶T4 DNA ligase repairs breaks in a dsDNA backbone and can covalently rejoin annealed cohesive ends in

18、the reverse of a restriction enzyme reaction,to create new DNA molecules.T4 ligase can even ligate one blunt end to another,albeit with rather lower efficiency.3. RNA连接酶三、粘性末端连接技术 1、衔接体(linker)技术 2、结合体(adaptor)技术3、同聚体(homopolymer)加尾技术第七节 结合体技术的应用AFLP一、 概述二、 基本原理AFLP technology is based on the select

19、ive amplification of genomic restriction fragment using PCR. DNA is digested with restriction endonucleases, and double-stranded DNA adapters are ligated to the ends of the DNA fragments to generate template DNA for amplification. Thus, the sequence of the adapers and the adjacent restriction site s

20、erve as primer binding sites for subsequent amplification of the restricton fragments by PCR. Selective nucleotides extending into the restriction fragments are added to the 3 ends of the PCR primers such that only restriction fragments in which the nucleotide flanking the restriction site match the

21、 selective nucleotide will be amplified. The amplified fragments are then analyzed by gel electrophoresis to generate the fingerprint.三、 技术特点四、主要应用复习题（填空题）（1）为了防止 DNA的自身环化，可用（ ）脱去双链 DNA( )。（2）欲将某一具有突出单链末段的双链 DNA分子转变成平末段的双链形式，统常可采用（ ）和（ ）的作用。2、判断题（1）T4 DNA连接酶和E.coli连接酶都能催化平末端和粘性末端的连接。（2） T4 DNA连接酶和E.

22、coli连接酶都能催化双链DNA和单链DNA连接。课前提问：1、反向PCR？2、RAPD的原理？课堂互动内容1. 启发学生思考DNA连接酶和DNA聚合酶的功能差别。2. 为什么在基因克隆中连接酶是另一个重要的工具酶？3. 为什么粘性末端要比平末端的连接效率要高？课堂互动内容：粘性末端的连接效率远远高于平末端的连接，但在基因工程操作中得到的片段往往都是平末端的，同学们能否想出一些办法，将本是平末端的连接转变成粘性末端的连接呢？第 7 教学周/第 1.2.3 节 （第 7 次课）教 学 基 本 内 容备注教学目的：本节课主要讲述核酸修饰酶（如未端转移酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶等）、单链核酸内切酶

23、（如S1核酸酶和Bal 31核酸酶等）以及核酸外切酶等基因工程常用酶，使学生掌握这些酶的生物学活性，明确这些酶在基因工程中的应用。教 具：多媒体课件教学重点：核酸修饰酶和单链核酸内切酶生物学活性课时安排：3学时教学难点：核酸修饰酶的应用教学内容：第八节 基因工程的其它酶类一、核酸修饰酶1. 未端（脱氧核苷酸）转移酶 2. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）3. 多核苷酸激酶(polynucleotide kinase)二、单链核酸内切酶1. S1核酸酶2. Bal 31核酸酶三、核酸外切酶(exonucleases)1. 核酸外切酶VII(exoVII) 2. 核酸外切酶I

24、II (exoIII)3. 核酸外切酶(exo) 4. T7基因6核酸外切酶复习题1. 欲将某一具有突出单链末段的双链 DNA分子转变成平末段的双链形式，统常可采用（ ）和（ ）的作用。2. 为了防止 DNA的自身环化，可用（ ）脱去双链 DNA( )。3.、简答题按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶。课前提问：1、AFLP技术的英文表述？2、衔接体(linker)、结合体(adaptor)、同聚体(homopolymer)加尾等技术。课堂互动内容在基因操作中，常常会遇到不希望发生连接作用的互补粘性末端末端发生了自连作用，引导学生思考怎样才能避免这种情况的发生？第

25、 8 教学周/第 3.4.5 节 （第 8 次课）教 学 基 本 内 容备注教学目的：本章首先基因克隆技术做了概述讲述了基因工程载体的基本概念和载体的种类、性质。着重介绍了质粒载体的概念、生物学特性、质粒的遗传与复制、构建质粒克隆载体的基本策略。教 具：多媒体课件教学重点：质粒的生物学特性课时安排：3学时教学难点：构建质粒克隆载体的基本策略教学内容：第三章 基因工程载体第一节 基因克隆技术概述一、基因克隆技术二、目的基因的取得三、重组体的构建1. 载体的概念2. 载体的性质四、转化及重组子筛选鉴定1. 转化（transformation)2. 重组子3. 重组子的筛选方法第二节 质粒载体（Pl

26、asmid Vector）一、质粒的概念二、质粒的一般生物学特性1. 质粒DNA（1）SC构型（2）OC构型（3）L型2. 质粒的复制与遗传3. 构建质粒克隆载体的基本策略 4. 质粒的改造复习题 1、 基因克隆技术的一般过程？2、 在琼脂糖凝胶电泳中，质粒DNA的SC型、OC型和L型是如何分布的？3、 质粒载体必须具备的4个特性？4、 构建质粒克隆载体的基本策略？ 课前提问：采取什么措施可以防止接头发生自连作用？课堂互动内容：基因工程操作为什么要用到载体？课堂互动内容：转化子与重组子的区别？课堂互动内容：质粒DNA在琼脂糖凝胶上会呈现出几条带？为什么？第 9 教学周/第 3.4.5 节 （第

27、 9 次课）教 学 基 本 内 容备注教学目的：本章主要讲述pBR322质粒载体、pUC质粒载体、TA克隆载体和酵母中的质粒载体等内容。要求学生重点掌握pBR322质粒载体的构建、pUC质粒载体的结构和TA克隆载体的构建等内容。教 具：多媒体课件教学重点：pBR322质粒载体的构建、pUC质粒载体的结构和TA克隆载体的构建课时安排：3学时教学难点：pBR322质粒载体的构建教学内容：第二节 质粒载体（Plasmid Vector）三、常用的质粒载体 1. pBR322质粒载体（1）标准的质粒载体命名法则 （2）pBR322质粒载体的物理图谱（3）pBR322质粒载体的构建 （4）pBR322质

28、粒载体的优点 2. pUC质粒载体（1）概述（2）pUC质粒载体的结构（3）pUC质粒载体的优点 3. TA克隆载体 4. 酵母中的质粒载体 复习题 1. 在质粒中如何增减酶切位点？2. 构建质粒载体的基本原则是什么？课前提问：1. 克隆基因的一般过程？2. 重组子、转化子、转化。3. 构建质粒克隆载体的基本策略？课堂互动内容“pBR”是指“细菌抗药性质粒”吗？第 10 教学周/第 3.4.5 节 （第 10 次课）教 学 基 本 内 容备注教学目的：本章主要内容为噬菌体的生物学、噬菌体克隆载体、柯斯克隆载体、人工染色体克隆载体等内容，要求学生重点掌握噬菌体克隆载体的相关知识以及温和噬菌体、溶

29、源性细菌、溶源化、整合、原噬菌体和YAC、BAC等概念。教 具：多媒体课件教学重点：噬菌体克隆载体课时安排：3学时教学难点：噬菌体克隆外源DNA的策略教学内容：第三节 其他克隆载体一、 噬菌体概述1. 噬菌体的基本特征2. 噬菌体的结构及其核酸类型3. 噬菌体的感染性（1）噬菌体的溶菌生命周期（2）噬菌体的溶源周期 温和噬菌体（temperate phage） 溶源性细菌（lysogen) 溶源化（lysogenization) 整合（intergration） 原噬菌体（prophage）二、 噬菌体克隆载体1. 与构建克隆载体相关的噬菌体性质 2. 噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 3. 构建噬菌体克隆载体的基本策略4. 噬菌体克隆载体的主要类型5. 重组体DNA的体外包装6. 重组体分子的选择方法7. 噬菌体克隆载体的应用 三、柯斯 （cosmid）克隆载体四、 人工染色体克隆载体 1. 酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome，YAC） 2. 细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）复习题1、如何将野生型的噬菌体改造成为一个理想的载体？2、为什么野生型的噬菌体不宜作为基因工程载体？3、什么是YAC? 什么