973蛋白质翻译后修饰及其调控的定量蛋白质组学研究.docx

1、973蛋白质翻译后修饰及其调控的定量蛋白质组学研究项目名称：肝病发生发展中的蛋白质翻译后修饰及其调控的定量蛋白质组学研究首席科学家：徐平 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所起止年限：2011.1至2015.8依托部门：总后勤部卫生部二、预期目标1总体目标本课题研究的总体目标是充分发挥我国在肝病模型、标本和肝脏蛋白质组研究方面的优势，利用定量蛋白质组学的原理和方法，对肝病发生发展过程中磷酸化、泛素化、糖基化蛋白质本身及其异质体的修饰位点、修饰类型、计量关系和动态变化规律以及控制机理进行系统研究。考察这些翻译后修饰在肝病病因、预后和治疗中的价值。通过本研究，我们将建立高效率、低成本的

2、蛋白质磷酸化、泛素化、糖基化修饰和糖链结构解析的定性、定量研究技术；揭示肝病发生和癌变过程中磷酸化蛋白质信号通路的开关机制、泛素化调控的蛋白质量变引起质变的规律以及糖基化在肝癌发生发展和转移中的变化趋势，阐明这些翻译后修饰在肝病发生发展中的生理病理机制；筛选、鉴定一批具有诊断和药靶意义的肝病相关翻译后修饰蛋白或翻译后修饰调控蛋白。本项目的开展将加速我国定量疾病蛋白质组学研究体系的形成，培养一批从事蛋白质翻译后修饰研究的专门人才，产生一批具有国际影响力的论文和成果，继续保持我国肝病蛋白质组学研究基地在国际上的竞争优势。 2五年目标1）发展一套高通量、高准确度和高精度的磷酸化、泛素化和糖基化蛋白质

3、组的定性、定量研究技术及平台。2）系统比较在肝细胞癌发生发展过程中，HBx侵染宿主细胞后引起宿主细胞蛋白质磷酸化修饰进而导致HCC的分子机制，和肝细胞极性蛋白磷酸化修饰及其调控的下游蛋白磷酸化在肝细胞癌发生发展中的作用机制。阐明该过程信号途径和调控网络；发现肝病发展过程中磷酸化控制的关键蛋白；探索这些验证的关键蛋白作为药靶和肝病标志物的可能性。3）建立特定泛素链形成和脱泛素化的酶学决定机制和关系网络；筛选以Smurf1、NEDL1/2和SCF为代表的特异性泛素化蛋白质；构建2个E3基因敲除小鼠模型，鉴定8-10个新的E3调控蛋白，揭示2-3类新的E3活性调控机制；获得2-3个在肝癌发生发展过程

4、中发生显著变化的泛素连接酶，提供1个候选肝癌标志物。4）发展一套基于质谱数据的糖链结构计算机算法和聚糖结构解析芯片；建立肝病相关糖蛋白/核心岩藻糖化糖蛋白数据库；发现和鉴定100个与肝病相关的糖蛋白，10个有早诊和药靶意义的聚糖结构；解析2-3个糖蛋白聚糖的宏观和微观的不均一性与功能表达的关联和与肝病的联系；确认23种与肝病发生发展和转移密切相关的重要糖蛋白及其配基；阐明1-2个关键糖基转移酶家族成员表达调控及在肝癌发生发展中的分子机制；探索差异调控12种蛋白质糖基化修饰的生物学机制。5）在国际核心刊物发表论文50篇以上，其中影响因子10以上的3-6篇；申请发明专利10项。6）造就一支蛋白质翻

5、译后修饰高水平的科研队伍，培养国家杰青人才1名以上、培养博士和硕士研究生50-80人。三、研究方案1学术思路 本项目立足于我国重大肝病的国情，意图在原有肝脏蛋白质组学和大规模表达谱、翻译后修饰谱研究的基础上，选择研究基础好、与肝病发生发展和状态特征关系密切的蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化展开研究。在改进基于质谱的磷酸化、泛素化和糖基化修饰蛋白高通量的定性和定量研究技术的基础上，结合已经建立的系列肝病相关的细胞、动物模型和临床标本，系统研究与肝病发生发展相关的蛋白质及其异质体的动态表达差异、调控规律和翻译后修饰信号识别的分子机制，进而揭示蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化修饰与肝病关联的生理病理学意义。

6、本研究项目需要蛋白质组学、生物信息学、遗传学、生物化学、基因组学、分析化学和糖生物学等各交叉学科团队的通力合作，而其产生的科研成果又将施惠于各个研究领域。2技术途径 本课题的技术途径包括肝病蛋白质及其翻译后修饰体差异的发现、差异相关的调控途径和网络研究以及重要功能蛋白的功能表征等3个层面的多种途径。1）蛋白质及翻译后修饰体差异谱的产生技术：改进已有的蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化鉴定、定量技术，结合我国在系列肝病模型和疾病标本方面的良好积累，利用代谢过程标记技术产生的重稳定性同位素完全标记蛋白质组为定量内标，进行多维LC-MS/MS或GeLC-MS/MS的蛋白质及其修饰异质体的定性鉴定和定量分析

7、。对发现的差异利用可视化蛋白质及其修饰体差异显示技术等假阳性排除技术进行数据过滤，并用质谱多反应监测技术（MRM）进行验证。 2）参与蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化调控的酶学机制和信号途径研究：利用基因敲除、基因敲入细胞株、肝病细胞或小鼠模型，结合代谢过程标记的重稳定性同位素标记内标和基于MRM的翻译后修饰酶系目标导向定量蛋白质组技术，巧妙避开复杂蛋白质组样品和当前仍然有限的蛋白质组学鉴定能力之间的矛盾，定量比较、建立肝病相关翻译后修饰调控的信号途径。3）重要功能蛋白的表征研究：利用分子生物学技术，在体外生化反应体系、基因工程细胞和小鼠模型进行重要肝病相关蛋白的功能验证和分子生物学机理探索。3创

8、新性和特色本课题的创新之处集中表现在：1) 首次围绕重大肝病进行多个蛋白质翻译后修饰系统研究，有利于发现不同修饰间的交互影响，阐明翻译后修饰相关的肝病病理生理机制；2) 发挥我国在肝病模型和标本方面的积累和优势，注重重大疾病相关生物学问题的解决，变经典的定性数据积累型蛋白质组学研究模式为假设驱动型定量蛋白质组学研究；3) 不仅在组学水平系统调查蛋白质及其翻译后修饰异质体在肝病发生发展转移过程中的质和量的变化，而且监测影响这些变化的翻译后修饰酶学决定机制，便于计算生物学和生物信息学技术的整合，并形成肝病相关蛋白质翻译后修饰系统生物学研究模式阐明肝病的本质；4) 系统集成和发展蛋白质翻译后修饰研究

9、的系列关键技术，解决蛋白质泛素化和糖基化修饰鉴定的国际性难题。本课题的特色在于：1) 目标清晰，着眼于我国重大肝病的国情，问题明确，注重阐明翻译后修饰相关的肝病机理；2) 方法新颖，立足于建立系统的蛋白质翻译后修饰的位点、种类、化学计量及翻译后修饰相关酶的规模化、高精度的定量动态化研究技术，假阳性排除技术、分析策略和生物信息学整合途径，着眼于这些研究成果在我国高发的肝病，特别是肝癌的发生、发展过程中亟需解决的问题上的应用，结论于临床医学对实验基础科学分析结果的严格验证，研究内容间环环相扣；3) 集群效应突出，组合我国在分析化学、蛋白质组学、细胞生物学和生物信息学优秀团队，充分发挥各团队的专长开

10、展相关研究。4取得重大突破的可行性分析本项目瞄准了当前蛋白质组学研究的热点、重点、难点问题和国家急需，充分利用项目组在研究队伍、研究资源和技术上的优势进行联合攻关。资源优势：项目参与单位已经积累了本项目研究所需的肝癌细胞系（包括不转移和具有不同转移潜能的肝癌细胞）、肝病的基因敲入、敲除细胞株和小鼠模型、肝癌高发现场以及正常人和早、中、晚期肝癌患者及相关肝病的组织和血清标本库，具有广泛的样本积累。这为肝病相关蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化的系统研究提供了资源保证。技术优势：本项目试图整合蛋白质翻译后修饰蛋白质组学技术和定量蛋白质组学技术，结合肝病发生发展各阶段的生物学模型，系统考察蛋白质磷酸化、泛

11、素化和糖基化在肝病病因、进程以及预后中的作用、变化规律和调节机制。在深入研究疾病相关翻译后修饰及其调控的信号途径的基础上，结合目标导向的定量蛋白质组学技术系统地筛选和发现肝病相关的翻译后修饰蛋白及其调控的信号途径。项目的研究思路新、基础实。参加本项目的所有课题都建有先进的蛋白质组学研究平台，研究水平处于国际前列。在蛋白质磷酸化、泛素化和糖基化修饰蛋白质组学研究方面已经建立了技术体系。代表着国内蛋白质组学、翻译后修饰的研究水平。研究队伍的优势：本项目集中了我国北京、上海两地在蛋白质磷酸化、泛素化、糖基化、糖生物学及糖化学研究领域中的优势力量。项目组包括2个国家重点实验室（蛋白质组学国家重点实验室

12、、分子生物学国家重点实验室）和3个省部级重点实验室（教育部癌变和侵袭原理重点实验室、卫生部糖复合物重点实验室、中国科学院上海生命科学研究院蛋白质研究分析中心）。课题负责人和主要学术骨干都由具有多年研究经验和高度组织能力的学术带头人担任，并都曾经有过主持或参与国家重大项目的经历，在项目的有效执行及管理上有丰富的经验。绝大多数成员都有在美、日、欧等发达国家的先进实验室多年的工作经历和长期与国外先进实验室合作的经验。多数成员已在蛋白质组学、生物信息学、蛋白质磷酸化、糖基化和泛素化等领域具有多年的研究经验，均做出过重要贡献，在Cell, Science,Nature Cell Biology, Nat

13、ure Biotech, Nature Method, Cancer Cell, Gastroenterology,Hepatology,PNAS, EMBO J, MCP等国际顶尖刊物上发表过论文。综上所述，我们有信心完成本项研究，实现各项预期目标，获得一批创新性的研究成果，并在肝病蛋白质翻译后修饰领域取得突破，以保持我国在肝病蛋白质组学研究领域的国际领先地位。四、年度计划年度研究内容预期目标第一年共性技术：1、建立重稳定同位素体内体外标记相对定量方法。2、翻译后修饰鉴定算法及质控的研究，蛋白质翻译后修饰数据库的研发3、研究HBx基因敲入小鼠肝癌模型在不同肝病发展阶段泛素化水平的差异，确定泛

14、素化蛋白组取样节点和方法。4、发展基于多反应监测（MRM)的绝对定量方法。有标及无标蛋白质定量方法的算法研究。肝病标本：1、收集、整理肝癌标本，建立和完善肝相关疾病的样本库。2、建立完善转移相关生物样本库肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、系统优化并建立一套高通量、高效率的磷酸化肽段在线富集、鉴定新技术。2、HBx稳定表达的肝细胞模型（HBx转染Changliver细胞）的构建及IGF2刺激条件的优化；细胞表型检测（细胞增殖能力及成瘤能力）。 3、Cdc42调控的蛋白泛素化在急性肝损伤中的作用及分子机理；Cdc42调控的蛋白磷酸化在胆汁酸平衡中的作用及分子机理研究。肝病发生发展中的蛋白质磷酸

15、化研究：1、以Nedd4泛素连接酶（E3）家族成员的WW结构域与HECT结构域为诱饵，通过酵母双杂交筛选相互作用蛋白。2、启动建立泛素连接酶NEDL1、NEDL2的条件型敲除小鼠模型。3、研究泛素连接酶Smurf1与SCF类E3 FBXL15的相互作用及其对Smurf1的稳定性调控作用。4、启动真核细胞中13个泛素铰链酶E2单敲除细胞株项目，比较所使用的模式细胞其生长特性和可能的表型差异。5、启动真核细胞中18个脱泛素化酶DUB单敲除细胞株项目，比较所使用的模式细胞其生长特性和可能的表型差异。6、启动真核细胞中泛素活化酶E3单敲除细胞株项目，比较所使用的模式细胞其生长特性和可能的表型差异。肝病

16、发生发展中的蛋白质糖基化研究：1、新型硼酸修饰材料的发展；2、糖肽质谱行为研究；3、发展糖代谢标记技术4、优化糖蛋白组学、糖组学的现有技术，发展以质譜、凝集素为核心的糖蛋白聚糖分析鉴定和鉴定技术，定量蛋白质组学技术，生物信息学等技术的系统生物学技术平台。5、筛选和鉴定卵圆细胞致瘤性转化和肝癌转移相关的糖蛋白聚糖等重要分子群。6、研究肝癌发生关联的特征性糖基转移酶譜及其变化规律。7、富集转移潜能相关细胞MHCC97H/L膜糖蛋白并验证差异性分子。共性技术：1、结合高精度质谱分析，实现大规模蛋白质翻译后修饰位点的鉴定。2、建立从图谱、序列、修饰类型和修饰位点全方位的质控。3、建立肝病蛋白质组定量内

17、标制备技术，制备本课题所需的定量内标。4、重稳定性同位素体内体外标记相对定量方法一次可获得1000个以上蛋白质的定量信息。肝病标本：建成完备的肝相关疾病的生物样本库（500例组织、血清）和病理随访数据库。肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、确定并建立一个能够进行无富集偏好性、高通量的磷酸化富集技术平台。2、得到HBx稳定表达的Chang liver细胞株，明确IGF2刺激Chang liver细胞的最优条件。并通过对所得细胞株进行增殖能力、成瘤能力的检测，确定细胞模型构建成功。3、明确Cdc42调控的蛋白泛素化在急性肝损伤中的作用，并对其分子机理有较明确了解。阐明Cdc42调控的蛋白磷酸化在

18、胆汁酸平衡中的作用及分子机理。肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、获得一批新的Nedd4家族E3结合蛋白，完成酵母回转验证。2、完成两个敲除小鼠的打靶载体构建、中靶ES细胞筛选。3、揭示Smurf1稳定性受SCF类泛素连接酶调控的新机制。4、建立E2、E3和DUB单敲除细胞株阵列。肝病发生发展中的蛋白质糖基化研究：1、完成硼酸基团修饰及表征，并初步应用于糖蛋白质的富集。1.完成硼酸基团修饰及表征，并初步应用于糖蛋白质的富集；2、质谱条件下糖肽裂解优化方法的建立。3、实现细胞表达糖蛋白质的GalNAc标记与富集。4、确定至少30个与肝癌发生和转移相关的糖蛋白和聚糖，至少20个与转移相关的蛋白及

19、其糖基化修饰。5、重要糖基转移酶在肝病中特征性表达譜。6、申请专利2项，发表SCI论文10篇。第二年肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、HBx侵染宿主细胞后，蛋白质磷酸化水平的变化；基于HBx稳定表达的肝细胞模型，研究HBx侵染宿主细胞后及在类胰岛素生长因子（IGF2）刺激下，宿主细胞体内磷酸化蛋白质及位点的规模化鉴定及磷酸化水平的定量变化。2、Cdc42调控的蛋白磷酸化在肝脏肿瘤发生发展中的作用及分子机理，Cdc42调控的蛋白磷酸化与肝脏糖代谢机理研究。肝病发生发展中的蛋白质泛素化研究：1、继续NEDL1、NEDL2敲除小鼠模型的建立工作。2、研究Smurf1与Wolfram综合征致病蛋白

20、WFS1的相互作用及其生物学意义。3、研究Smurf1与类泛素蛋白Nedd8的相互作用及其调控机制。4、研究Smurf1在肝癌等肿瘤发生中的可能作用。5、制备泛素铰链酶E2缺失株中泛素化蛋白组，定量测定和比较泛素链组成。6、制备泛素连接酶E3缺失株中泛素化蛋白组，定量测定和比较泛素链组成。7、制备脱泛素化酶DUB缺失株中泛素化蛋白组，定量测定和比较泛素链组成。8、以HBx基因敲入小鼠为材料制备总细胞蛋白组样品，并与重稳定性同位素标记的定量内标等量混合，亲和纯化泛素化蛋白组。9、特征亲和纯化的泛素化蛋白组。10、研究人肝癌标本的泛素化蛋白组技术。肝病发生发展中的蛋白质糖基化研究：1、继续完善糖代

21、谢标记技术。2、优化凝集素亲和层析等糖蛋白/糖肽富集技术。3、开展定量糖蛋白质组研究。4、糖基化蛋白质结构解析。5、继续致瘤性转化相关糖蛋白和聚糖的动态表达和功能验证。6、乙肝背景的肝硬化中DN和小肝癌演进的特征性糖蛋白和聚糖的比较研究。7、肝癌发生发展过程特征性糖基转移酶GnT、FucT-和1,4GT的动态表达。8、不同转移人肝癌细胞系膜糖蛋白的差异表达和筛选重要的糖蛋白。肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、建立HBx稳定表达所引起的蛋白质组定量变化及磷酸化修饰动态变化谱。2、建立IGF2刺激Chang liver细胞或HBx稳定表达的Chang liver细胞后蛋白质组定量变化及磷酸化修

22、饰动态变化谱。3、确立Cdc42调控的蛋白磷酸化在肝脏肿瘤发生发展中的作用，鉴定受Cdc42影响而与肝脏肿瘤发生相关的蛋白磷酸化。4、初步明确Cdc42在调节血糖水平中的作用，极其影响的糖代谢的过程。5、建立与现有肝脏蛋白质数据库有效整合的蛋白质翻译后修饰数据库。肝病发生发展中的蛋白质泛素化研究：1、获得两个E3基因的FloxP小鼠，构建组织特异性敲除的小鼠模型。2、揭示Smurf1-WFS1相互作用在内质网应激应答调控中的生物学意义。3、揭示Smurf1的翻译后修饰对其活性的调控作用。4、揭示Smurf1与肝癌发生发展的相关性。5、建立E2和7种泛素链的对应关系。6、建立E3和7种泛素链的对

23、应关系。7、建立DUB和7种泛素链的对应关系。8、制备HBx基因敲入小鼠的泛素化蛋白质组。9、建立人肝癌标本的泛素化蛋白组技术。肝病发生发展中的蛋白质糖基化研究：1、建立凝集素富集-同位素糖基化位点标签（IGOT）-质谱的一体化糖蛋白质鉴定技术。2、规模化鉴定糖蛋白数目突破500个，争取达到或超过1000个。3、糖代谢标记技术应用于多种糖型糖蛋白质的规模化富集与鉴定。4、建立系统的CD44糖链结构及糖基化位点分析策略，揭示糖链结构与功能关联。5、开展触珠蛋白（HP）、酸性糖蛋白（AGP）等糖链结构、位点解析及功能调控机制探索。6、验证24个致瘤性转化相关的关键糖蛋白和聚糖结构解析。7、发现与D

24、N演进有关的糖基化蛋白质30个。8解析特征性糖基转移酶GnT、FucT-和1,4GT的的功太表达和规律。9、解析25个蛋白及其糖基化与配体的相互识别和作用。10、申请自主知识产权的专利2个以上；发表SCI论文至少10篇。第三年肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、将磷酸化富集方法和定量方法相结合，对蛋白质磷酸化修饰在外界信号刺激下的变化进行精确定量，并同时对相关的激酶，磷酸酯酶等调控等蛋白质进行定量分析。2、HBx侵染宿主细胞后，差异蛋白数据总体分析；重要激酶或磷酸化蛋白质的选择、验证。3、基于Wnt 和Insulin信号通路，建立细胞质和细胞核蛋白质组和磷酸化蛋白质组定量分析流程， 对特定的

25、转录因子实现高覆盖率鉴定和修饰分析。并能同时完成磷酸化和非磷酸化肽段的绝对定量跟踪。4、Cdc42调控的蛋白磷酸化与肝脏糖代谢；研究Par3不同位点的磷酸化在细胞增殖、迁移及转化中的作用。5、构建Par3肝脏特异性敲除小鼠模型。肝病发生发展中的蛋白质泛素化研究：1、研究NEDL1、NEDL2单敲除与双敲除小鼠的表型。2、研究Smurf1被其辅因子CKIP-1激活酶活性的分子机制。3、利用蛋白质组学技术寻找NEDL1、NEDL2敲除和敲低导致变化的差异蛋白谱。4、利用定量蛋白质组差异显示技术筛选E2单敲除细胞株阵列中差异的蛋白质。5、利用定量蛋白质组差异显示技术筛选E3单敲除细胞株阵列中差异的蛋

26、白质。6、利用定量蛋白质组差异显示技术筛选DUB单敲除细胞株阵列中差异的蛋白质。7、利用定量蛋白质组差异显示技术比较HBx基因敲入小鼠不同肝病阶段变化了的总细胞蛋白和泛素化了的蛋白。8、制备人肝病标本总细胞蛋白组和泛素化蛋白组。肝病发生发展中的蛋白质糖基化研究：1、针对肝癌转移细胞系或组织，开展定量糖蛋白质组研究。2、重要差异表达糖蛋白质的质谱SRM规模化验证。3、继续定量糖蛋白质组研究。4、糖基化蛋白质结构解析。5、继续致瘤性转化重要糖蛋白和聚糖的功能网络分析。6、乙肝背景的肝硬化中DN和小肝癌演进的特征性糖蛋白和聚糖的比较研究。7、特征性糖基转移酶GnT、FucT-和1,4GT的表达谱及在

27、特征性聚糖合成中的意义。8、建立定点突变和基因敲除的细胞系，筛选转移相关糖蛋白的配体，明确其可能结构域；继续验证新筛选出的相互配体肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、建立磷酸化蛋白质组多重精确定量方法；对磷酸化位点的定量规模达到1000个以上。 2、得到与相关信号分子作用特异的磷酸化变化模式，完成至少6个时间点的连续量变跟踪。3、筛选出与信号转导相关的转录因子磷酸化位点，相关的激酶和磷酸酯酶，分析其调控机制，以及验证磷酸化与相关酶活性以及蛋白质相互作用的关系。4、明确Cdc42影响糖代谢的具体环节，发现Cdc42影响肝脏糖代谢的下游信号通路。5、阐明不同的Par3磷酸化突变体在细胞增殖、迁移

28、及转化中的作用。6、完成Par3肝脏特异性敲除小鼠模型的构建。肝病发生发展中的蛋白质泛素化研究：1、初步获得NEDL1、NEDL2在肝脏等组织器官的生理功能。2、获得CKIP-1结合泛素的能力在其激活Smurf1中的功能。3、获得受NEDL1、NEDL2调控的蛋白信息。4、建立E2-泛素链-蛋白质底物对应关系图。5、建立E3-泛素链-蛋白质底物对应关系图。6、建立DUB-泛素链-蛋白质底物对应关系图。7、发现HBx基因敲入小鼠不同肝病阶段变化了的总细胞蛋白和泛素化了的蛋白。肝病发生发展中的蛋白质糖基化研究：1、发现20种左右与肝病发生相关糖蛋白，确认2-3个关键糖蛋白。2、2-3种重要糖蛋白的

29、糖链结构解析及糖链结构与功能关联。3、发现一批与肝癌发生相关的差异表达分泌糖蛋白质、膜糖蛋白等。4、开展骨桥蛋白（OPN）等肝病相关重要糖蛋白糖链结构、位点解析及功能调控机制解析。5、验证24个致瘤性转化相关的关键糖蛋白和聚糖结构解析。6、发现与DN演进有关的糖基化蛋白质30个。7、解析特征性糖基转移酶GnT、FucT-和1,4GT的的功太表达和规律。8、解析25个蛋白及其糖基化与配体的相互识别和作用。9、申请自主知识产权的专利2个以上；发表SCI论文至少10篇。第四年肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、研究HBx基因敲入小鼠肝癌模型的特征，确立HCC发生、发展不同阶段的特征；动物水平上以H

30、Bx knock in小鼠为动物模型验证以上研究得到的HBx引起宿主细胞蛋白质磷酸化修饰进而导致HCC的分子机制。2、通过计算生物学和生物信息学构建完整的细胞生长调控相关通路尤其是Wnt 和Insulin信号分子网络模型，激酶与底物的调控关系，磷酸化与转录的调控关系等。 3、Par3不同位点的磷酸化在球状包囊形成（cyst formation）过程中的作用，及其对细胞极性、细胞骨架等的影响、寻找Par3新的结合蛋白，探讨Par3的作用机理。4、高可靠质谱图谱库的构建。肝病发生发展中的蛋白质泛素化研究：1、利用敲除小鼠模型，继续深入研究Smurf、NEDL等Nedd4家族成员与肝癌的发生发展关系

31、，鉴定新的底物和靶蛋白，揭示分子机制；深入探讨Smurf1介导的Neddylation修饰对Smad通路的调控作用及其与肝病发生发展的关系。2、利用SILAC-AQUA定量比较蛋白质组学技术系统验证HBx基因敲入小鼠肝病过程中的差异蛋白。3、利用体内和体外泛素化技术体系研究差异蛋白的信号途径和生物学意义。4、利用定量蛋白质组差异显示技术系统比较人肝病标本总细胞蛋白组和泛素化蛋白组差异。肝病发生发展中的蛋白质糖基化研究：1、肝脏特异表达凝集素相互作用糖蛋白组解析及在肝病发生中的角色探讨。2、开展肝病相关重要膜糖蛋白质配基发现研究。3、继续研究肝硬化DN向肝癌演进的关键糖蛋白和聚糖分子的网络调控机制及功能表达特征。4、对差异性关键膜糖蛋白及其配体的相互作用及病理生理功能的研究。5、转移复发预测试剂盒/蛋白芯片的开发和验证。6、研究肝癌关联的糖基转移酶群的表达调控和病理学意义。7、乙肝背景的肝硬化和小肝癌病人血清糖蛋白和聚糖的规律性变化，筛选差异性分子。8、研究差异性糖蛋白的结构、功能的关系及其生物学意义。肝病发生发展中的蛋白质磷酸化研究：1、发现各通路间的相互关系，揭示蛋