补阳还五汤对老龄大鼠脑缺血再灌注海马齿状回细胞增殖分化的影响.docx

1、补阳还五汤对老龄大鼠脑缺血再灌注海马齿状回细胞增殖分化的影响补阳还五汤对老龄大鼠脑缺血再灌注海马齿状回细胞增殖分化的影响（作者:_单位: _邮编: _） 作者：高剑峰 吕风华 王晓辉【摘要】 目的 从海马齿状回(DG)细胞增殖和分化的变化揭示补阳还五汤(BHD)抗老年脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法 采用大脑中动脉闭塞(MCAO)方法复制脑缺血动物模型，免疫组化方法检测观察DG的5 溴脱氧尿嘧啶(BrdU)、神经元核抗原(NeuN)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞数，观察脑缺血I/R 1、3、7、14、21 d大鼠神经症状积分、脑组织含水量、病理变化、海马齿状回细胞增殖、分化的变化。结果

2、 模型组脑组织含水量(I/R 1、3、7 d)、神经症状积分(各时间点)、BrdU阳性细胞(各时间点)、BrdU/NeuN双标阳性细胞(各时间点)、BrdU/GFAP双标阳性细胞(I/R 7、14、21 d)数目均高于假手术组;BHD组神经症状积分、脑组织含水量(I/R 3、7、14 d)低于模型组，BrdU阳性细胞(各时间点)、BrdU/NeuN双标阳性细胞数目(I/R 3、7、14、21 d)高于模型组,BrdU/GFAP双标阳性细胞(I/R 3、7、14 d)变化相反;BHD组神经症状积分(I/R 7、14 d)低于尼莫地平组，BrdU阳性细胞(I/R 7 d、I/R 14 d)、Brd

3、U/NeuN双标阳性细胞(I/R 7 d、I/R 14、21 d)数目高于尼莫地平组。结论 脑缺血可激活大鼠DG神经干细胞增殖;BHD抗脑缺血再灌注损伤的机制与其促进DG区神经干细胞增殖和分化有关。 【关键词】 补阳还五汤;老年;脑缺血再灌注;神经干细胞;增殖;分化;大鼠脑缺血再灌注可激活脑内神经干细胞发生增殖、迁移1。以往缺血性脑血管疾病的实验研究多忽视脑血管疾病中增龄因素的重要性,致使青年动物的实验研究结果与临床有较大差距，有关老龄大鼠神经再生特点鲜见报道。补阳还五汤(BHD)治疗脑梗死具有明显效果2，机制可能与其改善微循环和拮抗血栓形成及细胞凋亡有关3，4。本研究以老龄大鼠为研究对象,从

4、海马齿状回细胞增殖和分化的变化等方面揭示补阳还五汤拮抗老年脑缺血再灌注损伤机制。1 材料与方法1.1 实验动物和药剂 SD雄性2021月龄大鼠96只(450600 g，动物合格证号：医动字第410117号，由河南省实验动物中心提供)。5 溴脱氧尿嘧啶(BrdU)、兔抗大鼠BrdU、兔抗大鼠神经元核抗原(NeuN)、兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(均由博士德生物工程有限公司提供);尼莫地平片(批号：0312079;规格：20 mg/片由山东新华制药股份有限公司提供);BHD按医林改错原方所载的药方比例，按每钱3 g换算(生黄芪120 g，当归6 g，赤芍4.5 g，地龙、桃仁、红花、川芎各

5、3 g，药材购自河南中医学院附属门诊部并经鉴定)，煎两次，40 min/次，合并后浓缩为含生药2 g/ml,4冷藏备用。1.2 动物分组、模型制备及BrdU标记 采用改良的Bederson等5法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。设假手术组、模型组(根据缺血及再灌注时间不同分为缺血3 h，再灌注1、3、7、14 d)、尼莫地平组(6 mgkg-1d-1)、BHD组(13 gkg-1d-1)，每组每个时间点为6只大鼠,造模前5 d开始灌胃给药，造模前2 h加灌一次，假手术组和模型组灌生理盐水。各组均于术后4 h腹腔注射10 g/L BrdU(50 mg/kg,1次/d)。4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，

6、脱水固定，石蜡包埋切片(免疫组化、光镜病理)。1.3 观察指标及方法1.3.1 神经功能障碍评分 参考吴俊芳6提出的8个等级评分标准，各组各时间点动物均进行神经功能障碍评分。1.3.2 脑组织含水量 各组各时间点动物均断头取脑组织，标本用分析天平分别测定其湿重及在电热恒温干燥箱中100干燥48 h后的干重，以计算含水量。公式如下：含水量=(湿重-干重)/湿重100%。余脑组织脱水固定，石蜡包埋切片(光镜病理、免疫组化)。1.3.3 病理观察 各组各时间点动物均常规HE染色，光镜下进行病理观察。2.5%戊二醛溶液、1%锇酸固定,常规制作超薄切片,经醋酸铀及柠檬酸铅双染色后,透射电镜下观察神经细胞

7、、胶质细胞和毛细血管等超微结构。1.3.4 BrdU、NeuN和GFAP测定 BrdU阳性细胞采用免疫组化方法测定、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP采用双标记染色,全自动彩色图像处理系统进行图像分析，各组各时间点每只大鼠随机选取5张非连续的脑片，在400镜下，每张切片取缺血侧的DG个3个视野，计数BrdU阳性细胞数;双标结果每张切片选取10个视野，计数BrdU阳性细胞及BrdU/NeuN或BrdU/GFAP双标细胞，计算双标细胞阳性率。1.4 统计学处理 应用SPSS10.0软件包进行统计分析，采用方差分析统计处理，数据均以xs表示。2 结 果2.1 病理观察 老龄模型组(I/R 1 d

8、、I/R 3 d)可见神经元、神经胶质细胞肿胀，排列紊乱，出现典型的梗死灶，神经元数目减少。血管周围高度水肿、结构欠清晰，炎性细胞浸润明显，形成“血管套”。BHD组可见神经元、神经胶质细胞排列轻度紊乱，部分细胞出现细胞核固缩、深染及肿胀。血管轻度扩张水肿，部分血管受压变形，管周围有炎性细胞浸润,细胞间隙轻度水肿。与同时间点模型组比较病理损伤均减轻，该药物可以明显减轻脑缺血再灌注损伤。2.2 电镜观察 模型组3 h后神经元、胶质细胞胞质出现水肿，线粒体水肿，嵴和膜消失，内质网脱颗粒，染色质浓缩及边缘聚集。3 d超微结构破坏达到最严重，胞质、胞核高度水肿，线粒体水肿，嵴模糊、消失。714 d细胞超

9、微结构破坏略减轻。尼莫地平组14 d神经元、胶质细胞、血管内皮细胞超微结构较模型组病理变化明显减轻,仅见线粒体嵴排列轻度紊乱，粗面内质网轻度脱颗粒，可见大量线粒体，线粒体周围轻度水肿。BHD组3 d以后脑细胞的超微结构病理变化明显减轻,胞质中可见脂褐素，线粒体仅有轻度水肿，嵴底部分消失，膜部分消失，粗面内质网正常，其余细胞器正常，14 d观察细胞质、胞核、细胞器基本正常。2.3 BHD对脑组织含水量和神经症状积分变化的影响 模型组脑组织含水量(I/R 1、3、7 d)、神经症状积分(各时间点)均高于假手术组;BHD组神经症状积分、脑组织含水量(I/R 3、7、14 d)低于模型组;BHD组神经

10、症状积分(I/R 7、14 d)低于尼莫地平组。见表1。2.4 BHD对海马齿状回BrdU、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP阳性细胞数目的影响 模型组BrdU阳性细胞(各时间点)、BrdU/NeuN双标阳性细胞(各时间点)、BrdU/GFAP双标阳性细胞(I/R 7、14、21 d)数目均高于假手术组;BHD组BrdU阳性细胞(各时间点)、BrdU/NeuN双标阳性细胞数目(各时间点)高于模型组,BrdU/GFAP双标阳性细胞(I/R 3、7、14 d)变化相反;BHD组BrdU阳性细胞(I/R 7、14 d)、BrdU/NeuN双标阳性细胞(I/R 7 d、I/R 14、21 d)数目

11、高于尼莫地平组。见表2。表1 BHD对老龄大鼠脑组织含水量和神经症状积分影响比较表2 BHD对海马齿状回BrdU、BrdU/NeuN和BrdU/GFAP阳性细胞数目的影响与假手术组比较：1)P0.05,2)P0.01;与模型组相同时间点比较：3)P0.05,4)P0.01;与尼莫地平组相同时间点比较：5)P0.05,6)P0.01 3 讨 论脑梗死是临床上常见的缺血性脑血管疾病，致残率和致死率均较高。脑缺血后常引起神经元丢失,导致神经功能缺失。目前,对于脑缺血损伤后的功能恢复主要集中在促进内源性神经干细胞增殖和干细胞移植7。尽管脑缺血后成年脑内增殖区的细胞发生明显的增殖性反应,但由于细胞数量有

12、限可能不足以产生功能恢复性影响。虽然外源性的干细胞移植可弥补上述不足,但由于干细胞移植需要外在的细胞资源如胚胎非人类组织以及培养的细胞,这些移植物的应用,可能引起新的疾病、免疫排斥和需要长期使用免疫抑制剂等问题。神经再生出现在成年脑内不连续的区域，主要包括海马齿状回颗粒下层、侧脑室室管膜及室管膜下区两个主要聚集区域，侧脑室室管膜及室管膜下区新生的神经元可通过嘴侧迁徙流移至嗅球和皮层;海马齿状回颗粒下层新生的神经元可移至海马颗粒层8。因此,动员内源性干细胞的神经发生是促进脑缺血后损伤修复的有效途径。气虚血瘀证贯穿于脑卒中病的始终，益气活血为治疗脑卒中之大法。BHD由黄芪、归尾、川芎、桃仁、红花、

13、芍药和地龙等药物组成,具有补气活血、通经活络功效，可有效改善脑血流及血液流变，拮抗兴奋性氨基酸毒性及合理调控一氧化氮合成酶(NOS)的表达，拮抗脑缺血及再灌注损伤，主要用于治疗缺血性脑梗死及其后遗症3，4，9。BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核昔类似物，在细胞S期可以标记DNA合成，为胞核表达活性物，标记细胞核,因而BrdU阳性细胞可被看作具有增殖活性的细胞10。Kawai等11采用四动脉阻断法制作成年大鼠短暂性全脑缺血模型,观察到缺血后5、7、9 d DG中BrdU细胞数增加,28 d时增殖细胞分化为神经元。Zhang等12利用大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,发现室管膜下区(SVZ)的NSCs在缺

14、血后1 d即开始增殖,11 d达到高峰，脑缺血不仅可以促使缺血侧SVZ和颗粒下层(SGZ)的NSCs增殖,而且可影响到对侧大脑半球SVZ和SGZ的NSCs,其增殖效应并不依赖于增殖区局部是否有受损的神经元,这一过程可能是机体对缺血损伤产生的神经保护反应。本组资料表明，BrdU阳性细胞胞核有两种形态:一种胞核较大深染呈圆形,另一种胞核淡染呈椭圆形,但以前者为主。胞核的形态变化和染色深浅可能与脑老化和神经干细胞的分化有关，胞核大深染呈圆形的分化为神经元，淡染呈椭圆形多分化为胶质细胞。正常成年脑组织中，海马中只有少量BrdU 阳性细胞存在，脑梗死后BrdU阳性细胞数目明显增加,出现在海马(颗粒层和齿

15、状回更为明显)、SVZ及梗死边缘，714 d达高峰，后渐减少，表明脑梗死可以诱导脑内自体神经干细胞原位增殖，但这不是脑梗死的直接结果，可能是引起了脑内某些因子的变化，通过不同途径作用于脑内处于静止期的神经干细胞引起增殖改变。补阳还五汤作用后1 d DG BrdU 阳性细胞明显增加，7 d达高峰，14 d仍维持较高水平，较模型组(各时间点)和尼莫地平组(I/R 7、14 d)BrdU 阳性细胞明显增多，且增殖高峰提前，持续时间延长，说明补阳还五汤可促进DG神经细胞增殖，并在一定时间窗内增强，这为临床治疗可以早期给药提供了理论依据。NeuN是神经元的标记蛋白13，GFAP是星型胶质细胞活化及增殖的

16、标志物14，BrdU/NeuN双标阳性细胞代表增殖的神经干细胞向神经元分化，BrdU/GFAP双标的阳性细胞代表增殖的神经干细胞分化方向为神经胶质细胞。本研究结果显示，BrdU/NeuN+和BrdU/GFAP+细胞在脑缺血后3 d开始增多，714 d达高峰，说明脑缺血激活了原位神经干细胞的增殖，逐渐向神经元和神经胶质细胞分化。BHD治疗后，BrdU/NeuN+1 d即开始增多，14 d达高峰，后渐减少，而BrdU/GFAP+细胞数目高峰推迟;较模型组(I/R 3、 7、14、21 d)和尼莫地平组(I/R 7、14 d)BrdU/NeuN+细胞数增多，BrdU/GFAP+细胞数目下调(I/R

17、7、14 d)，提示BHD可有效刺激神经干细胞向神经元分化，且持续时间长，而神经胶质细胞分化减少，抑制了过强的胶质细胞反应，亦表明针刺具有促进胶质细胞向神经细胞转化的作用趋势。【参考文献】 1 Salazar Colocho P，Lanciego JL，del Rio J,et al.Ischemia induces cell proliferation and neurogenesis in the gerbil hippocampus in response to neuronal deathJ.Neurosci Res,2008;61(1):27 37. 2 谢明剑.补阳还五汤与低分子肝

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