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1、第三章细胞工程doc课程名称： 现代生物技术概论授课主题： 第三章 细胞工程授课教师：生命科学系 王国霞目的要求：1，了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法。2，学习如何进行动植物细胞及组织的培养方法。3，探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。4，掌握利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及其重要意义。内容重点：植物细胞工程、动物细胞工程内容难点：动物细胞工程、细胞融合第三章细胞工程细胞工程是在细胞水平上研究、开发、利用各类细胞的工程。是现代生物技术中涉及面极为广泛的一门工程技术，它与基因工程一起代表这现代生物技术的最新发展前沿。概念：是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培

2、养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植物个体，以获得某种有用物质的一门综合性科学技术。按研究对象可分为：植物细胞工程、动物细胞工程、微生物细胞工程按技术水平分为：动、植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术、细胞器移植技术。第一节细胞工程的基础知识与基本技术一，基础知识细胞是细胞工程的操作对象。是生命结构和功能的基本单位，是生命活动的基本单元。细胞 英文名:CELL 在文章中简称C。细胞并没有统一的定义，近年来比较普遍的提法是：细胞是生命活动的基本单位。组成细胞的元素：组成细胞的最基本的元素是C。在人体细胞干重中C的含量达到5

3、5.99% 组成细胞的基本元素有4种：C、H、O、N。在细胞中这四种元素的含量，占组成细胞元素总量的90%左右。 组成细胞的主要元素有6种：C、H、O、N、P、S。这6种元素占细胞总量的97%。二，基本操作技术三个关键的的操作技术：无菌操作技术、细胞培养技术、细胞融合技术（一）无菌操作技术细胞工程的所有操作都是在无菌条件下进行的。1，细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。2，基本设备配制基本设备 冰箱、天平、酸度计、纯水器、电炉、培养基分装器、搅拌器。灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。无菌操

4、作设备 净化工作台、接种箱。光温控制设备 时间程序控制器、空调及温度感应器。细胞培养设备 培养设备根据需要而定，包括培养架、培养箱、摇床、生物反应器等。细胞学鉴定设备 光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜。除上述基本设备外，如果有条件和需要还可配制摄影设备、生化分析设备等。（二） 细胞培养技术 细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。1， 取材和除菌。植物材料在取材后，动物材料在取材前都要进行严格的表面清洗，消毒。2， 要根据各类材料的特点，配制细胞培养基， 对培养基进行灭菌或除菌。3， 接种，采用无菌操作技术，将材料接种与培养基上。4， 培养，最后将接种后的培养基放

5、在培养室或培养箱中，提供细胞生长所需的最佳培养条件，如温度、湿度、光照、氧气及二氧化碳等。（三）细胞融合技术两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。1、制备原生质体 。微生物和植物细胞外面有坚硬的细胞壁，通常需要用酶进行降解。动物细胞不需要。2、诱导细胞融合 。两亲本细胞（原生质体）的悬浮液调至一定细胞浓度，按1：1的比例混合后，逐渐滴入高浓度的聚乙二醇（PEG）诱导融合，或用电激法促进融合。3、融合细胞的筛选。将混合液移到特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地长出，其他未融合细胞无法长出。第二节 植物细胞工程包括植物组织培养、植物

6、细胞培养、次生代谢物的生产、人工种子的研制。一，植物组织培养定义：在无菌和人为控制外因（营养成分、光、温、湿）条件下，培养和研究植物组织、器官，甚至进而从中分化、发育出整株植株的技术 。（一）理论依据理论基础就是植物细胞具有全能性。细胞的全能性：离体的体细胞或性细胞在一定的培养条件下，可以长出再生植株，再生植株具有与母株相同的全部遗传信息。植物细胞全能性的概念是1902年由德国著名植物学家Haberlandt首先提出的。并设想一个体细胞可以被人工培养成一个胚。哈伯兰德被誉为“植物组织培养之父”。（二）培养过程1预备阶段（1）外植体的选择外植体选择部位要是去分化相对容易的部位，一般以幼嫩的组织或

7、器官为宜。（2）外植体的灭菌除菌的一般程序：外植体自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干无菌外植体切割成小块外植体放置于培养基进行培养灭菌的时间和消毒剂的选择要根据外植体的情况进行选择，通常对幼嫩组织消毒的时间要比成熟组织的短。（3）配制培养基总体来讲用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐；有机化合物；生长调节剂三大基本组成以及根据不同需要的其它附加成分。A无机盐类大量元素：C,H,O,N,S,P,K,Ca,Na,Mg等微量元素：Mn,Zn,Cu,B,Mo,Fe； 有机化合物糖类、维生素、腺嘌呤、氨基酸、植物激素其它天然提取物 如椰乳、番茄汁、YE(酵母提取物)，琼脂，活性炭2

8、，诱导去分化阶段材料除菌后，切成小片段插入培养基即可，可采用固体培养基，这种方法简便易行，占地面积小，可多层培养。但会出现极化现象：愈伤组织过早分化出芽和根；液态培养，营养吸收快捷，需要震荡设备，一旦污染后果严重。3，继代增殖阶段 移植扩增 分割继代必须通过继代增殖，才能使愈伤组织的细胞数大量扩增。4，生根成芽阶段 再分化：愈伤组织继续培养，重新分化成根或芽等器官。愈伤组织只有通过重新分化才能形成胚状体，继而长成小植株。要移植到汗适量细胞分裂素和生长素的分化培养基中，才能诱导胚状体的生成。光照是本阶段必须的。5，移栽成活阶段生长在容器中的小苗，要适时移栽到室外以利生长，一般要经过室内炼苗来提高

9、成活率。 保湿是关键 避免强光直射 温度适宜二、植物细胞培养和次生代谢物的生产工业化植物细胞培养系统主要有两大类： 悬浮细胞培养系统：适于大量增殖细胞，但次生物质的积累少； 固定化细胞培养系统：细胞生长缓慢，但次生物质含量较高； （一）悬浮培养系统悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术 。特点：系统结构简单，易于操作。生产效率不高，产物量少。改进：半连续培养方法：每个一定时间收获部分培养物，在加入等量的培养基。连续培养方法：在培养若干天后连续收获细胞的同时不断补充培养液的方法。（二）固定化细胞培养系统1979年首先用藻酸钙固定化培养长春花和鸡眼藤获得成功。1优点：

10、（1）次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性（2）细胞固定化有利于组织化的形成；（3）细胞固定化有利于在细胞团内外形成化学物质和物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键；（4）细胞固定化有利于对外环境参数进行调控；（5）细胞固定化有利于回收次生代谢物。固定化细胞培养：将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在他的表面进行培养。2，常见的固定化细胞培养系统（l）平床培养系统 优点：制作简单； 能生产较多次生代谢物。缺点：占地面积大； 分化区比例较小；02供应受限。（2）立柱培养系统立柱培养系统操作要素尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物（品种）；选用高产细胞株系；在营养液中加入目的产物

11、的前体物质有利于增产；寻找最佳的营养液的氮源、碳源和激素配比；适量光照有利于目的产物生成； (三) 植物细胞培养的意义1，细胞培养技术的优点 （1）节约能源，减少耕地占用面积，不受季节、地域限制； （2）无菌的培养条件排除病菌和害虫的影响；（3）可以通过特定的生物转化途径获得均一的有效成分；（4）可以探索新的合成路线，获得新的有用物质。2，细胞培养的主要产物（1）药用代谢产物目前通过细胞培养技术生产珍贵药物已经成为细胞工程一个重要研究领域。苷类；包括皂苷（三七皂苷、人参皂苷、等）甾醇；生物碱；主要又吡啶、喹啉、萘醌等；醌类；包括蒽醌、菲醌、萘醌等蛋白质类；胰岛素、氨基酸、蛋白质抑制剂、植物抗生

12、素等。（2）天然食品、食品添加剂（3）杀虫剂、杀菌剂；（4）饲料、精细化工等产品：三、植物原生质体制备与融合植物细胞融合包括：原生质体的制备原生质体的融合杂合体细胞的鉴别筛选（一）原生质体的制备1，取材与除菌植物的任何部位都可以作为外植体用于制备原生质体。但一般取生长活跃的部位作为供试体。常用的有嫩叶、根尖、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、愈伤组织、悬浮培养的细胞等。灭菌要因材而异，一般无菌清洗干净即可，悬浮培养细胞无需灭菌。2、酶解植物细胞壁降解：纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶、果胶酶等物质除菌后叶片撕去下表皮 切块放入反应不时轻摇25-30处理2-4h反应液转绿3、分离过滤法比重漂浮法：低

13、速离心法 4、洗涤 5、鉴定形态识别： 完整、颜色新鲜的正常球形相差显微镜观察法：原生质环流和正常细胞核存在染色法：酚藏花红、伊凡蓝，有活力不着色 （二）原生质体的融合诱导融合的方法：化学法：聚乙二醇（PEG)结合高pH、高钙离子法;物理法：显微操作，电场刺激；1化学法PEG结合高 Ca2+、pH诱导法 化学法主要包括：NaNO3诱导、高Ca2+和高pH诱导、PEG诱导、PEG结合高Ca2+和高pH诱导，最常用后一种方法。PEG结合高Ca2+和高pH诱导过程按比例混合双亲原生质体滴加PEG溶液，摇匀、静置滴加高钙、高pH溶液，摇匀、静置加原生质体培养液洗涤数次离心获得原生质体细胞团筛选、再生杂

14、合细胞 2，物理法电融合诱导法 （1）作用原理 在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。 （2）基本过程电融合装置的电极有两种：微电极法和平行多电极法1 将制备好的双亲原生质体溶液混合均匀后放入融合小室中；2 A微电极型电流刺激原生质体，使两层膜之间形成小孔，连接成桥，连接融合；B平行多电极型产生双向电脉冲，使原生体紧密排列成串珠状，制模被击穿融合；3,融合处理后再生的细胞株类型：(1)完全的杂合细胞株：双方的细胞核和细胞质完全合为一体，发育成完全的杂合细胞株；（2）核质异源的细胞

15、株：一方的细胞核另一方的细胞质构成，发育成核质异源的细胞株；（3）融合细胞由双方细胞质与一方细胞核或者附加少量他方染色体或DNA片段构成。（4）原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开，以后它们各自分生长成嵌合植株。（三）杂合体的鉴别与筛选1，杂合细胞的显微镜鉴别 个体差异，颜色差异2，遗传互补法筛选杂合细胞 白化互补、生长互补、抗性互补、代谢互补 3，细胞与分子生物学的方法鉴别 染色体核型分析、染色体显带分析、分子杂交、RAPD标记等4，根据融合后处理再生的植株的形态进行鉴别四、单倍体植物的诱发和利用单倍体生物：细胞中只含有一组染色体的个体。自然界中单倍体的发育途径1，

16、孤雌繁殖途径植物卵细胞不经过受精儿发育成单倍体胚，继而长成单倍体植株。2，孤雄繁殖途径镜子进入胚囊后不与卵细胞受精儿肚子发育成单倍体胚，在发育成植株。3，无融合繁殖精卵结合后，不仅受精卵发育，由于某种原因，助细胞或反足细胞也与受精卵同步发育成单倍体胚，形成双胚或多胚种子。人工诱导单倍体途径1，花药培养（1）选取成熟度适中的花药：花粉正处于形成营养细胞和生殖细胞的阶段，早晚都不行。（2）花药预处理：低温，高温处理，零磁空间处理，高渗溶液处理，可促进愈伤组织形成和提高单倍体的比例；（3）选择适当的培养基和培养条件：有些用添加生长素的培养基有利于形成愈伤组织，有些仅需蔗糖和无机盐即可完成整个过程。加

17、入适量的脯氨酸或羟脯氨酸对促进愈伤组织形成有明显作用。2，花粉培养离体成熟花粉培养，分离花粉后进行培养，3，未授粉子房或胚珠的培养4，杂交法获单倍体植株5， 单倍体培养物的加倍 0.2%0.4%秋水仙素处理2448h。染色体加倍五、人工种子的研制这是细胞工程中最年轻的一项技术，是1978年由英国科学家Muralshige首先提出的设想，80年代后开始进行研究。人工种子（人为制造的种子）：是最外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。是一种含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以及其他成分的人工胶囊。（一）人工种子的构成、分类及特点 1，构成：人工种皮、人工胚乳、胚状体三部分 胚状体：由组织培养或细胞培养产

18、生 人工胚乳：营养物质+激素+农药+抗生素+ 除草剂等 人工种皮：抗压，保水，透气2，优点：（1） 繁殖速度快，结构完整；可以不受环境因素制约，一年四季进行工厂化生产；（2） 通过人工无性繁殖获得的胚状体有利于保存该种系的优良性状；（3） 可根据不同植物对生长的要求配置不同成分的“种皮”；（4） 可在胚乳中添加营养物、激素、农药等附加物，促进胚状体的健康生长；（5） 与试管苗相比，成本低，便于运输和储藏，适于机械化田间播种，节省劳动力；（6） 胚状体发育的途径可以作为高等植物基因工程和遗传工程的桥梁。 （二）人工种子的制备 1，胚状体的制备及其同步生长诱导胚状体的同步化生长是制备人工种子的核心

19、问题。促进胚状体同步生长常用措施 ：低温法、抑制剂法、分离法、通气法、渗透压法2，人工胚乳的制备常用的人工胚乳有：MS（或SH、White)培养基加入1.5%的马铃薯淀粉水解物；SH（0.5）培养基加入1.5%的麦芽糖；还可根据需要添加适量激素、抗生素和农药等。3，配制包埋剂及包埋褐藻酸钠作包埋剂的操作程序 在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀。 将其逐滴滴入2.0%-2.5%的CaCl2溶液中，经2030min.的离子交换作用即形成含有繁殖体具有一定刚性的人工种子， 用无菌水漂洗20min.以终止反应。 (三)人工种子的贮存与萌发 人工种子的贮存与萌发现在还是一个未能攻克的难

20、关。一般要将人工种子保存在低温（4 7）、干燥（ 67相对湿度）条件下。自然条件下人工种子的贮存时间较短，萌发率较低。 六、植物脱病毒技术许多植物带有病毒，特别是无性繁殖植物，并中国种子直接传给子代，对花卉来说影响花卉的观赏效果，对经济作物来说影响产品的产量和质量。（一）植物脱毒途径1，物理学方法：病毒和寄主的最适温度相差较大的话，尤其是寄主耐高温，可以用高温培养脱毒。2，化学方法：用病毒的抑制物进行处理，孔雀绿，病毒唑等。（较难实现）3，生物学方法：1943年，White(怀特)发现生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒。所以茎尖培养成为获得无病毒植株的重要途径。例如通过马铃薯茎尖培养已获得无毒

21、品种用于生产。材料：芽尖、根尖茎尖越小越没病毒，但越小越难成活,一般要超过2万个细胞，或至少310 mg茎尖。4，综合脱毒方法综合上述两种或三种方法的。（二）植物脱毒检测（1）外形观察法，性状改变（2）电镜法，观察是否还有病毒颗粒（3）免疫血清法，这是最为可信的方法第三节 动物细胞工程动物细胞工程是以动物细胞为对象，通过工程技术手段对细胞的遗传与生理特性进行改良和修饰，从而获得人类所需要的产物或器官乃至个体的生物技术，动物细胞工程技术涉及动物组织、细胞以及胚胎操作的相关技术。一，动物细胞组织培养（一）动物细胞培养法1.动物细胞培养的基本步骤：获取组织块切割大组织块为小组织块消化液离组织获得分散

22、细胞收集细胞培养 2.培养方法动物细胞多数为贴壁生长，因此进行体外培养需提供较大的支持面。因此，在进行设计时首先要考虑这个问题。（1）微导管培养法把外径不超过1mm的微导管平铺成层构成培养系统的核心装置，把微管床浸没于培养基中，动物细胞可贴附于微管床上生长。这种方法分离和纯化分泌物时比较方便，在生产激素和单抗时经常使用。（2）微载体培养法 微载体是以葡萄糖聚合物或其他聚合物制成与培养基比重基本相等的直径在60-250um的固体小珠。在培养时，要先通过试验选择合适的微载体，以微载体能全部悬浮于培养液中为最好。将微载体和培养基混合均匀，根据细胞类型决定接种浓度，通入无菌空气，培养生长。收获分离细胞

23、一般采用酶消化法，胶原酶法专一性强，不损坏细胞膜，效果较好。（3）微胶囊培养法 与人工种子类似，吧动物细胞与褐藻酸钠混合制成微胶囊，将细胞包裹在微囊中，在培养液中悬浮培养。细胞在微胶囊内生长，既可吸收外界营养，又可排出自身代谢废物。胶囊内细胞和产物不受培养液中复杂成分的污染，细胞密度增加，纯度提高。（二） 组织培养法组织培养方法和细胞培养方法类似，省去了消化组织分散细胞的过程。（1）获得组织，无菌操作（2）培养，切成1-2mm2小块放入培养瓶（3）加入培养基浸润组织，把培养瓶平翻180度，搁置1-30分钟，以利于贴壁生长（4）翻回培养瓶，平卧静置于37度培养。（三）培养物的传代 悬浮培养直接移

24、置 贴附培养先分离再移置（四）无血清培养培养基中包括了血清中的主要有效成分，一般有三类：基础培养基 基质因子 生长因子、激素和维生素等微量物质 （五）培养物的长期保存 经典传代法:细胞始终处于活跃状态，要不断传代。手续繁琐，费用较高 Carrel是经典传代法的创始人之一和代表，他用 34年对鸡胚心肌细胞传代3400次。冷冻保存法：操作简便，保存期长 液氮保存法二、细胞融合细胞融合的主要步骤：两原生质体或细胞互相靠近细胞桥形成胞质渗透细胞核融合（一）生物法仙台病毒法大多病毒都具有凝集细胞的能力，可以粘接两个细胞的表面，使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。仙台病毒也叫日本血凝病毒HVI，是RNA

25、病毒，具有很强的凝集细胞能力，即便是处死的仙台病毒也具有促进细胞融合的作用。仙台病毒是产生细胞杂种的标准融合剂。病毒促使细胞融合的主要步骤： （l）两个亲本在病毒黏结作用下靠近 （2）病毒作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透。 （3）两个亲本细胞核互相融合为一体（4）杂种细胞分裂成含有两种染色体的杂种子细胞（二）化学法PEG诱导法 动物细胞融合PEG分子量1000-2000，浓度30%40%。pH值多为中性或弱碱性，7.48.0为宜。1974年，高国南发现PEG能诱导植物细胞原生质体融合1975年，Pontecorvo用PEG法融合动物细胞取得成功（三）电激诱导融合同植物细胞电激诱导融合（

26、四）杂种细胞筛选 抗药筛选 营养缺陷筛选三、淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞 单克隆抗体制备过程（如图）四、细胞核移植与动物克隆（一）细胞核移植细胞核移植：利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术。核移植所得的杂种称为核质杂种。细胞核移植技术（1）供体和受体的准备 （2）去卵膜和卵核（3）供体细胞制备 （4）移核1，异种核质关系研究杂种鱼，我国科学家童第周教授和美籍华人牛满江教授，把鲤鱼的细胞核放入鲫

27、鱼的去核受精卵中，有些性状象鲤鱼，有些性状象鲫鱼，还有中间性状，出现中间性状鱼，是不是细胞质中还有某种遗传物质插入到移入进来的细胞核基因组，发挥作用改变了性状。这是细胞核遗传理论无法解释的。2，细胞核遗传全能性的研究处于不同发育时期的细胞，不同作用的细胞，是否都具有细胞全能性？生物学家进行不断研究探索。1952年 美国人Briggs成了研究细胞核遗传全能性的第一人，豹纹蛙，囊胚期（胚胎早期）的细胞核移植可以发育个体，胚胎发育后期和蝌蚪、成蛙的细胞核移植均失败，认为只有囊胚期的细胞核具有全能性，1964年，南非科学家Gurdon，非洲爪蟾体细胞的细胞核移植发育成蝌蚪，证明体细胞的细胞核也具有全能

28、性。1981年，小鼠幼胚细胞核克隆出正常小鼠。后来其他科学家相继用幼胚细胞核克隆出猪、羊、兔等（二）体细胞克隆1997年，多利羊的诞生与以往克隆动物最大的区别是他的核供体是高度分化了的体细胞乳腺上皮细胞，而不是尚保留细胞全能性的早期胚胎细胞。这是克隆技术的一大重大突破，利用这一技术，可以大批复制动物。科学杂志评为1997年世界十大科技成就之首。操作过程：（1） 去绵羊A（白色6岁绵羊）的乳腺上皮细胞，用饥饿法时期进入休眠状态，而使其基因具有活性，或者说具有细胞全能性。（2） 给绵羊B（黑色）注射激素促使排卵。取出卵细胞后快速去核，饥饿使其进入G0期作为受体细胞。（3） 用电激法促使乳腺细胞融入

29、卵细胞内，形成一个含有新遗传物质的卵细胞，（4） 将这个卵细胞培养到囊胚期时移入绵羊C的子宫内（5） 产下的多利羊是绵羊A的复制品，也为白色，多利羊与其他克隆动物的区别在于共和细胞的分化程度不同。再起胚胎细胞基本上是未分化细胞，具有全能性，即使是成形胚胎的已分化细胞，其分化程度也远低于成年个体的已特化细胞。因此说，这是一项技术上的重大突破，说明已特化细胞的遗传结构是可以逆转的。5，克隆技术的应用与意义 （1）检验动物细胞全能性多利羊诞生以前，普遍认为高等动物的体细胞没有全能性，只有低等生物和高等植物的细胞具有全能性，（2）加速动物繁殖，保护珍贵动物动物克隆技术有助于加速动物育种的进程。可以缩短

30、育种周期，提高育种效率。在拯救濒危动物方面也收到了广泛的关注。（3）医药领域 基因治疗，器官移植，可以用患者本人的细胞培育出新组织用于治疗，不会出现免疫排斥反应。五、染色体转移1、微细胞介导法微细胞：也叫微核体，是指含有一至几条染色体（即致函一部分基因组）、少量细胞质和完整的细胞膜包裹而成的核质体。这种细胞一般只能存活几个小时。 微细胞介导法：以微细胞作为供体，通过与遗传性完整的受体细胞融合，从而将微细胞内所含的一条或几条染色体转移至受体细胞中去，而成为能够存活的杂合细胞的一种技术。 具有供体信息简单，受体细胞被影响小，染色体不受或很少受损伤等优点。转移方法过程：优点： 简化供体 受体细胞受影响小 染色体很少损坏或不损坏2、直接转移法 供体细胞的染色体获得步骤 ：供体细胞秋水仙素处理低温处理细胞破碎收集染色体染色体向受体细胞的转移方法： 微注射针向胞内注射染色体悬液。 染色体与细胞共培养，被细胞以胞吞方式摄入染色体与高浓度CaCl2混匀后滴加到受体细胞用脂质体包裹染色体，再经PEG诱导与细胞融合 六、干