第三章 细胞生物学研究方法.docx

1、第三章 细胞生物学研究方法一、章（节、目）授课计划 第 页授课章节名称第三章 细胞生物学研究方法授课时数2教学目的1、使学生掌握细胞形态结构的观察方法，了解主要工具，侧重掌握基本原理和基本应用2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养3、了解细胞工程技术教学要求1、掌握细胞形态结构的观察方法，掌握光学显微镜技术2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养3、了解细胞工程技术教学重点1、细胞形态结构的观察方法2、细胞组分的分析方法及细胞培养。教学难点1、观察细胞形态的主要方法及工具的介绍。2、细胞组分的分析方法教学方法与手段讲授法、 互动讨论法作业与思考题部分课后作业阅读书目或参考资料1、细胞生物学（第3版）

2、(翟中和等)(高等教育出版社)（2009）2、细胞生物学进展（郑国錩等）（高等教育出版社）（1994）3、分子细胞生物学（韩贻仁）（高等教育出版社）（2007）教学后记二、课时教学内容 第 页教 学 内 容小结技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。 细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的south

3、ern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。第一节 细胞形态结构的观察方法一、有关显微镜的一些概念（1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。 光学显微镜的分辨率 R=0.61/Nsin（/2） 其中为入射光线波长； N =介质折射率；空气中N =1 =物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。它指的是长度的比值而不是面积的比值。例：放大倍数为100，指的是长度是1m的标本， 放大后像的长度是100m，要是以面积计算，则放大了10,000倍。 显微镜的总放大倍数等

4、于物镜和目镜放大倍数的乘积。 （3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数： M=d/d二、显微镜的分类现代显微镜可以分为两大类：一类是光学显微镜，另一类是非光学教 学 内 容小结显微镜 。这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型。三、光学显微镜技术光学显微镜技术至今仍是细胞生物学研究的重要手段。（一）普通复式光学显微镜技术1. 构成： 照明系统：光源、折光镜、聚光镜 光学放大系统：为两组玻璃透镜，目镜与物镜机械装置和支架系统，由镜座

5、、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋和微动螺旋等部件组成，保证光学系统的准确配置和灵活调控。2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。教 学 内 容小结（二）相差和微分干涉显微镜技术光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。从而提高样品反差，提高了各种结构间的对比度，明暗差别通过密度差形成使各种结构变得清晰可见。用途：观察未经染色的玻片标本，样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。1. 环形光阑（annular diap

6、hragm）：位于光源与聚光器之间。2. 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。 微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞中较大的细胞器。教 学 内 容小结（三）荧光显微镜技术 特点：光源为短波光；有两个特殊的滤光片（激发光滤片，阻断滤片）照明方式通常为落射式（这种照明的光束来自物体的上方通过物镜后射到被检物体上，这样物镜又起着聚光镜的作用。这种照明法是适用于非透明物体，检出能力高；对细胞的刺激小；能进行多重染色）。原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物

7、质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性和定量研究。光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。是目前在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位最有力的工具应用：直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术（四）激光共聚焦显微技术原理和应用：激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点（所谓共焦，是指物镜和聚光镜同时聚焦在同一点上），也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较

8、短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。优点是排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.41.7)，可重构样品的三维结构。教 学 内 容小结（五）荧光共振能量转移（FR

9、ET）技术是检测活体中生物大分了纳米距离和纳米距离变化的有力工具，可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。FRET现象：当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠，并且两个探针的距离在10nm以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，称FRET现象。采用融合表达方式，可将两个蛋白的距离拉近于510nm。FRET效率反映了被检的两种蛋白是否直接作用及作用的强弱。（六）荧光漂白恢复技术又称光脱色恢复技术，可用于检测活体细胞表达或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小。原理：利用高能量激光束的照射使特定的区域的荧光发生不可逆的淬灭，光漂白区荧光的恢复可通过非漂白区

10、的荧光标记分子在膜上或胞质中运动至光漂白区来完成。用于检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率的大小四、电子显微镜技术用于研究细胞内部的精细结构。（一）、电子显微镜的基本知识1、电子显微镜与光学显微镜的基本区别显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-51.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差教 学 内 容小结2、电子显微镜的特征以电子束作

11、光源，电磁场作透镜。由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统等4部分构成；分辨力0.2nm，放大倍数可达106；用于观察超微结构（小于0.2m）。（二）主要电镜制备技术1、超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备。通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20-50nm。 由于电子束的穿透能力有限，为获得高分辨率的图像，切片厚度一般仅为40-50nm，即一个直径为20um的细胞可以切成几百片，故称超薄切片。这需要样品具备一定的刚性和韧性，而生物样品不具备这些特性，因此需要包埋于特殊的介质中，包埋时会破坏样品的结构，因此在包埋前必须先将样品

12、固定。（1）固定：保持样品的真实性，细胞内部结构和成分保持在原来位置上通常以锇酸和戊二醛固定样品，低温，防止酶的自溶而破坏样品结构。（2）包埋：各种细微结构在切片过程中获得均匀良好的支撑，使获得的超薄切片连续完整并有足够的强度，且能耐受观察时的电子轰击、高温和真空挥发。常用的包埋剂为环氧树脂。注意：生物样品固定后仍含有大量水分，而包埋剂是与谁不相溶的，因此在包埋前通常需要一系列的脱水处理。（3）切片：通过样品杆的金属热膨胀或机械伸缩控制切片厚度。切片刀：玻璃或砖石。切片需捞在覆有支撑膜的载网上才能在电镜下观察。（4）染色：用重金属盐染色以形成明暗反差，只能观察到黑白图像不同的成分对不同的燃料有

13、不同的亲和性：锇酸脂质；铅盐蛋白质；醋酸铀核酸。2、负染技术用重金属盐(如磷钨酸) 染色；吸去染料干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，衬托出样品的精细结构，分辨力可达1.5nm左右。教 学 内 容小结3、冰冻蚀刻 freeze-etching亦称冰冻断裂蚀刻复型。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露断面结构。向断面喷涂一层蒸汽铂和碳。然后将组织溶掉，把铂和碳的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜面结构，立体感，不需

14、要包埋、固定深度蚀刻主要用来观察胞质中细胞骨架纤维及其结合蛋白。4、电镜三维重构技术将电子显微镜、电子衍射、计算机图像处理相结合的技术。用于分析难形成晶体的膜蛋白、病毒和蛋白质-核酸复合物的三维结构。生物样品的二维晶体在不同倾角下进行拍照，得到一系列电镜图片，傅里叶变换处理，得到三维结构电子密度图展示生物大分子及其复合物表面与内部的空间结构，具有高分辨率5、扫描电镜技术（SEM） 扫描电子显微镜于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在

15、那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张力问题。五、扫描隧道显微镜（STM）它于1981年由格尔德宾宁 (Gerd K.Binnig)及亨利希罗勒(Heinrich Rohrer)在IBM位于瑞士苏黎世的苏黎世实验室发明扫描隧道显微镜，只一种在纳米水平上探测微观世界物质表面形貌的一仪器。 原理：扫描探针与样品接触或达到很近距

16、离时，即产生彼此间相互作用力，如量子力学中的隧道效应（隧道电流）、原子间作用力、磁力、摩擦力等，并在教 学 内 容小结计算机显示出来，从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。主要装置： XYZ方向扫描的压电陶瓷、 逼近装置、 电子学反馈控制系统、 数据采集、处理和显示系统主要特点： 具有原子尺度的高分辨本领：侧分辨率0.1-0.2nm，纵分辩率0.001nm 真空、大气、液体条件下工作 非破坏性测量局限性： 扫描隧道显微镜(STM)所观察的样品必须具有一定程度的导电性，对于半导体，观测的效果就差于导体；对于绝缘体则根本无法直接观察。 在扫描隧道显微镜(STM)的恒电流工作模式下，有时它对

17、样品表面微粒之间的某些沟槽不能够准确探测，与此相关的分辨率 较差。 第二节 细胞组分的分析方法 形态学观察和细胞成分的分析相结合是当代细胞生物学研究中长采用的试验方法。一、细胞组分分离技术 是分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速1025kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89Kg者称为超速离心机。 超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。 （一）差速离心 Differential centrifugation 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。教 学 内 容小结 沉降顺序：核线粒

18、体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 （二）密度梯度离心 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。 类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。1. 速度沉降 velocity sedimentation 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 特点：介质密度较低，介质的最大密

19、度应小于被分离生物颗粒的最小密度。 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2.等密度沉降 isopycnic sedimentation 用途：分离密度不等的颗粒。 特点： 介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。 力场比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速离心。 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。教 学 内 容小结二、细胞内生物大分子的显示方法：原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色

20、的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。DNA：福尔根（Feulgen）反应紫红色多糖类：PAS反应黄色脂肪：苏丹III红色蛋白质：米伦（Millon）红色1、金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。2、Feulgen反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸3、四氧化锇:与不饱和脂肪酸反应成黑色， 脂肪滴4、Millon（米伦）反应：氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的络氨酸残基反应，形成红色沉淀，（有色复合物） 蛋白质5、联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而

21、变成棕色化合物。6、脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。7、茚三酮反应：显示蛋白质三、特异蛋白抗原的定位与定性细胞内蛋白质定位法：免疫荧光技术和免疫电镜技术蛋白质体外定性法：免疫印迹、放射免疫沉淀、蛋白质芯片和质谱分析（一）免疫荧光技术根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素，对抗原进行定位测定的技术。快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 。（二）免疫电镜技术能有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。 免疫铁蛋白技术教 学 内 容小结 免疫酶标技术 免疫胶体金技术 应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定

22、位与骨架蛋白的定位等四、细胞内特异核酸序列的定位和定性分子杂交技术：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。 原位杂交（in situ hybridization）。 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生

23、物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光，对细胞内生物大分子进行定性、定位和半定量研究的一种细胞化学技术。 一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。 14C半衰期为5730年，3H为12.5年。六、定量细胞化学分析技术1、流式细胞仪 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 可定量地测定某一细胞中的DNA，RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量。特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将DNA含

24、量不同的中期染色体，甚至X或Y染色体的精子分离出来。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检教 学 内 容小结测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞仪（flow cytometer）。2、显微分光光度测定技术 实质上是显微镜技术和分光光度技术的结合。它以物质分子的光吸收、荧光发射和光反射特性作为测量基础，可以对细胞内的某些重要的生物分子（如 DNA、RNA、蛋白质等）的含量进行定量测试，是组织化学

25、和细胞生物学中定量研究的必不可少的工具。 显微吸收光度法时一种光度测量的化学方法，它基于细胞内的蛋白质、多糖、核酸、脂类和酶染颗粒能在不同等电点下电离出不同侧基，因而造成对染料亲和力不同，应用不同的化学试剂染色，可使不同的细胞组分染上不同的颜色，在显微镜下成为可见的结构。染料于组分的结合必须是特异性的，即染料、细胞组分结合物的光吸收是遵循朗伯-比尔定律，而且染色深浅与被染细胞组分之间呈化学剂量学关系，符合这两者关系的样本就可应用吸收测量法，通过光检测器（可使光能变成电能）测量有色化合物吸收单色光的量。第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞培养细胞培养就是将动植物组织或细胞从机体取出，

26、分散成单个细胞或直接以单细胞 生物，给予必要的生长条件，让其在培养瓶中或培养基上继续生长与增殖。（一）、动物细胞培养 原代培养（primary culture cell）: 从机体取出后立即培养的细胞。 传代培养（subculture cell）: 适应在培养条件下持续传代培养的细胞。 细胞系（cell line）：通过纯系化或选择法从原代培养细胞中分离出来的细胞群体。 细胞株（cell strain）：从培养细胞中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。 教 学 内 容小结细胞贴壁：分散的细胞悬液在培养瓶中很快（几十分钟货数小时内）就贴附于瓶壁上的现象。（二）、植物细胞培养1. 原生质体培养：培

27、养脱壁后的细胞，特点： 比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； 便于进行细胞融合，形成杂交细胞； 适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。2. 单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。(三)、非细胞体系来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系（cell-free system）。 用途：研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制以及细胞核装配等。二、细胞工程（一）细胞融合与细胞杂交技术 通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusi

28、on）或细胞杂交。 同核融合细胞：基因型相同的细胞融合形成的杂交细胞。 异核融合细胞：基因型不同的细胞融合形成的杂交细胞。 自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。 诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。在自然界中细胞自发融合发生的机率很小，一般需要诱发融合。诱发融合细胞的方法一般有以下几种：诱发细胞融合的方法：1、生物法：病毒促进细胞融合，其中仙台病毒（HVJ）是最早用于动物细胞融合的融合剂。原理：病毒被膜具有凝聚细胞的能力，它一边黏连一个细胞的表面，另一边黏连另一个细胞的表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结，诱导细胞的融合。教 学 内 容小结2、化学法：主要包括盐

29、类融合剂、聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂质、Ca2+配合物等。其中聚乙二醇法是较常用的化学融合方法。其原理是PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。3、物理法：电融合法。其原理是改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。细胞融合的步骤1、动物细胞的融合（）细胞准备。分贴壁和悬浮细胞两种。前者可直接将两亲本细胞混合培养，后者需制成一定浓度的细胞悬浮液。 （）细胞融合，加促融因子于将

30、行融合的细胞之中，诱导融合。 （）杂种细胞选择。利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，而让杂种细胞存活。 （）杂种细胞克隆。对选出的杂种细胞进行克隆（选择与纯化），经过培养，就能获得所需要的无性繁殖系。 2、植物细胞融合植物细胞融合较动物细胞难些。首先，植物细胞外面有细胞壁，因此需要先用纤维素酶去壁，形成原生质体后，才能进行细胞融合。其次，植物细胞融合后形成的杂种细胞，经过培养有可能分化发育成植株，而动物细胞的杂种细胞则缺乏此种能力。植物体细胞融合的过程大致包括：细胞分离，原生质体制备，原生质体融合，杂种细胞筛选及其培养，然后再通过愈伤组织诱导分化出根、茎、叶，最后长成完整的体细胞杂种植株。 细胞融合的意义是不仅打破了常规有性杂交育种的亲和性障碍，而且为实现“超远缘杂交”提供了可能，把亲缘关系较远，甚至毫无亲缘关系的生物体细胞融合在一起，扩大了遗传物质的重组范围，创造新细胞质杂种。（二）单克隆抗体技术 1975年，科勒尔等人采用