湖南大学生物信息学实验报告W13.docx

1、湖南大学生物信息学实验报告W13实验七 PCR引物设计及评价1 基本信息：姓名：程瑶 学号：201378020205班级：医学1301 实验日期：2016-05-24 2 实验目的和要求：1） 掌握引物设计的基本要求，并熟悉使用Primer premier5.0软件进行引物搜索；2） 掌握使用软件oligo6.0对设计的引物进行评价分析。3 实验仪器、设备与材料：计算机（联网）4 实验原理：1） 引物设计原则：A：引物应在序列的保守区域设计并具有特异性；B：引物的长度一般为15-30 bp；C：引物不应形成二级结构；D：引物序列的GC含量一般为40-60%；E：引物所对应模板位置序列的Tm值在

2、72左右最佳；F：引物序列自身或者引物之间不能在出现3个以上的连续碱基；G：引物3端不可修饰； H：引物3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高。2） 引物设计软件Primer premier5.0及Oligo6.0：Primer premier5.0：“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分析和DNA 基元(motif)查找。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列，软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择。Oligo6.0：Oligo 6.0的界面是三个图，Tm图

3、、G图和Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。所以引物设计的最佳搭配是“Premier”进行引物搜索“Oligo” 对引物分析评价。5 实验内容：1） 使用Primer premier5.0软件进行人瘦素 (leptin) mRNA引物的设计；2） 使用oligo6.0对引物进行评价分析；3） 使用blast工具帮助设计引物和评估引物特异性；6 实验步骤：略7 作业：提交使用Primer premier 5.0 及Oligo 7.37软件进行人肉素(leptin)mRNA引物的设计结果：1） 使用引物设计软件Pr

4、imer premier5.0进行人瘦素 (leptin) mRNA引物搜索结果截图。（包括Sense链和Anti-sense链截图）：A：先把leptin的序列输入到Primer中：然后进入primer：然后点击search，可修改部分数据去得到你想要设计的引物：得到search的结果，分三种：sense、anti-sense、pair： Sense Anti-sense Pair 因为pair是综合sense和anti-sense的结果，所以我在pair中选择引物：根据引物设计的原则，如sense链和anti-sense链的Tm值相差不能过大，GC含量要在40%-60%之间，hairpin

5、、dimer和false priming要尽量少的found等，我选择第二条引物，即2672-2968：其sense链为：其anti-sense链为：2） oligo6.0分析此对引物的结果。（包括Duplex formation、Hairpin formation、False Priming Sites截图）：A：首先呢要把leptin的序列输入到Oligo中去，并把之前从Primer premier 5.0中所得到的引物在Oligo中表示出来：即这段：然后进行分析，我在analyse中进行了4种分析，分别是Duplex formation、Hairpin formation、Composi

6、tion & Tm、False Priming Sites：A：Duplex formationB：Hairpin formationC：Composition & TmD：False Priming Sites从上面4种分析可见：在5和3的引物中，有4个碱基位点可以互补，可以配对形成双链。但无形成环状的配对位点；无发夹结构；Oligo所分析出的Tm值与primer引物设计出的Tm值有差异；正义链有三个假启动位点，反义链有5个假启动位点。总结可知，该引物无发夹结构，但是会有双链形成的和数个假启动位点的可能，所以并不是多么完美的引物。但相比较其他几条引物来说，这条是最好的3） 综合Primer

7、premier5.0与oligo6的引物设计结果为：A：sense ： 5- GTAGAGTTTGAAGGAGGTGA -3 (20bp) antisense： 5- CAGCCTGATTAGGTGGTT -3 (18bp) 8 思考题： 1） 怎么设计引物把上面提到的leptin的全长拉出来？A：老师，说实话，我还是没完全理解你说的拉出全长，我就按我的理解来了首先，进入primer：可见一开始时引物为1-25，sense链和anti-sense链都是25个碱基；因为sense链已经是从1开始了，所以我只需要调节anti-sense链即可；先点击primer处的A，然后调节下方滑动到最后区域，

8、用鼠标将anti-sense链的5端移到3444的位置，这样就把leptin的全长拉出来了：其实一开始，我不想来这么简单粗暴的方法所以我想在search中修改数据来得到全长的引物，如下图：然后结果是酱紫滴没办法，我只能作罢，选择第一种那样简单粗暴的方法2） 请比较芯片设计与引物设计的异同。A：因为基因芯片探针和PCR引物都是通过配对来形成双链的，而且基因芯片的探针也是通过PCR来扩增的，所以PCR引物的设计原则基本上也是基因芯片的探针的设计原则，如下：产物的特异性；产物的长度一般为15-30bp，产物中G、C序列的GC含量一般为40-60%，并且不能在出现3个以上的连续碱基；避开产物的二级结构区，不能形成双链和发夹结构；产物的3端不能修饰，而5端可以修饰；但是PCR引物只有一条双链，即只有sense链和anti-sense链两条引物；而基因芯片的探针有成千上万种，所以基因芯片的探针设计还需要考虑到下列因素：探针序列的互补序列在所有基因序列中必须是唯一的；探针序列的任一长度为15的子序列在整个基因组中必须是唯一的；探针序列不能自杂交，即探针序列中的互补片段的长度不能超过探针长度的30%。