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1、1流式细胞仪在植物科学中的应用流式细胞仪在植物科学中的应用The Application of Flow Cytometry in Plant Sciences摘要：流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)的产生标志着对细胞进行定性、定量分析及分选时代的到来。自20世纪70年代发明以来，流式细胞仪已被广泛应用在生物学和医学的各个研究领域，创造了无数个里程碑式的发现，极大地推动着生物学和医学的发展和应用。流式细胞仪应用于植物科学(Plant sciences)领域38年来，在诸如植物细胞计数(Cell count)、细胞核分析(Nucleus analysis)、原生质体分析(Pro

2、toplast analysis)、染色体分析(Chromosome analysis)、植物细胞和染色体分选(Sorting plant cell and chromosome)、染色体文库构建(Chromosome library construction)、细胞结构和功能分析(Cell structure and function)、逆境植物学研究(Plant anti-stress biology)、植物病理学(Plant pathology)、植物分类学(Plant taxonomy)、植物育种(Plant breeding)等植物科学的各个领域都有着广泛的应用。接下来我们将对流式细

3、胞仪在植物科学领域的研究方法、样品制备及应用前景等做一详细的介绍。一、前言：流式细胞术是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，按照细胞的物理或化学性质，同时具有分析和分选细胞的功能1-3。因而自1974年BD (Becton, Dickinson and Company)公司研制出第一台商用流式细胞仪(Fluorescence Activated Cell Sorting, FACSTM)以来，就在技术方法上不断推陈出新，使流式细胞仪在生物学和医学领域受到了广泛的应用。因此，流式细胞仪被誉为

4、“实验室的CT”。BD流式细胞仪走进中国市场30年，也极大地推动着中国生物医学领域的基础研究、产业化应用和公众健康。流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的1-3。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可对细胞表面和细胞内抗原、DNA、RNA和蛋白质含量等进行快速检测并可分类收集1-4。流式细胞仪以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色，广泛应用于血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学和细胞生物学等学科的基础研究及临床实践各个方面1-6。由于植物细胞自身的特性使得流式细胞仪在植物科学的应用稍稍滞后于血液学、免疫学等领域。但是流式细胞仪应用于

5、植物科学38年来，在植物育种、生长发育、生理生态、系统进化、分类等领域，分子、细胞、整体乃至系统生物学水平都有着广泛的应用1-6。二、流式细胞仪在植物科学中的研究方法2.1 流式细胞仪参数简介流式细胞仪两个最基本的参数是前向散射光(Forward scatter, FSC)和侧向散射光(Side scatter, SSC)1-2。FSC和细胞直径相关，用来检测细胞大小，通常应用排除细胞碎片和样品中颗粒的干扰以及细胞状态分析。SSC感性细胞的折射率，通常用来反映细胞表面形态、细胞内颗粒大小及精细分布。综合FSC和SSC两个参数，即可对细胞大小、状态、活性等加以表征1-4。流式细胞仪另外一个重要的

6、参数是荧光信号(Fluorescence signals)。化学荧光染料、激光技术和单克隆抗体技术的发展和应用使得流式细胞仪的功能变得异常强大。细胞表面或胞内颗粒经荧光染料特异标记后就可以对其进行多参数，多层次的分析，使得对植物细胞多个参数同时进行综合研究成为可能。另外还可以根据细胞形态或标记染料的荧光信号对特定细胞进行分选，以便进行进一步的筛选和研究1-5。2.2 植物细胞形态学(Cell morphology)检测 根据植物细胞的FSC和SSC两个参数可以对细胞进行形态学分析。增殖中的细胞，细胞变大，表现为FSC和SSC均升高。而凋亡细胞一般都出现细胞膜皱缩、核解聚、凋亡小体形成、胞浆浓缩

7、等形态学上的特点，凋亡细胞的典型特征是前向角散射下降和侧向角散射升高2-3, 5。2.3 植物细胞周期(Cell cycle)测检测和细胞增殖(Cell proliferation)研究植物细胞周期在其生长发育过程中是严格调控的，因此对植物细胞周期及其调控方式的研究有着重要的生物学意义。流式细胞仪对细胞周期的分析主要是用Hoechst 33258、Propidium iodide (PI)或溴化乙锭(Ethidium bromide, EB)对单个细胞DNA进行染色，对其DNA含量进行分析，从而计算出处于G0/G1期、S期（超二倍体）、G2/M期（四倍体）及非整数倍体细胞的含量。可以同时分析多

8、个细胞，操作简便易行，统计结果稳定可靠6-9。细胞增殖伴随在植物细胞生长发育的过程中。通常通过5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入法或CFSE染料标记稀释法研究细胞增殖。也可以通过Hoechst/PI/EB染色法测定G2/M期细胞的含量来表征植物细胞增殖。这些研究方法成熟、可靠，被广泛应用在功能基因组学及植物生长发育过程等研究中6-9。2.4 植物细胞凋亡(Cell apoptosis)研究细胞凋亡是伴随在植物生长发育过程中的正常现象，在生物体形态构成、细胞更替以及维持细胞内环境稳定等过程中发挥重要作用2, 5。流式细胞仪通常通过植物细胞形态学分析、DNA含量分析、Annexin-V/PI染色等方法

9、研究细胞凋亡，广泛应用在植物生长发育、功能基因组学和逆境植物学研究中5, 10。2.5 植物细胞表面受体和细胞内蛋白测定 植物细胞表面受体和细胞内蛋白的测定广泛应用于植物细胞信号转导研究中，其应用在很大程度上依赖于特异抗原单克隆抗体的制备1, 2。荧光染料标记的单克隆抗体和待测抗原结合，其荧光信号被流式细胞仪检测到。这些技术的应用推动着植物激素受体等信号转导通路、功能基因组学等领域的研究11。2.6 植物细胞活性检测 植物细胞活性检测包括细胞本身的死活和活细胞生物功能的检测。植物细胞及原生质体(Protoplast)活性检测对培养细胞的研究有着重要意义。流式细胞仪通过FSC/SSC参数可以研究

10、培养细胞的活性12。Hoechest/PI染色也用来检测植物细胞活性2。对细胞活性的检测还也应用在逆境植物学研究中，植物活细胞和原生质体分选中。对于活细胞生物功能的检测可通过细胞增殖，植物激素或胞内蛋白分泌等方式进行11, 13。2.7 植物细胞器(Organelles)检测除了细胞核和线粒体等细胞器外，植物细胞还具有自身独特的细胞器，如叶绿体(Chloroplasts)，中心液泡(Center vacuole)等。这些细胞器都有自己特殊的标志物(Marker)分子，通过对这些Marker分子的染色，就可以对这些细胞器结构和功能、细胞生命活动过程等加以研究2, 14。2.8 植物细胞、原生质体

11、及细胞器的分选除了对植物细胞进行各种分析外，流式细胞仪另外一个强大的功能是对细胞、原生质体、细胞器及染色体等进行分选14-17。流式细胞仪的细胞分选功能使得对单个细胞或某类细胞进行定性分析和研究时代的到来。我们可以根据细胞大小、细胞表面或胞内Marker分子等对细胞进行标记，有目的地对其进行分析，加以分选并进行深入研究。基于这些优点，流式细胞仪分选技术已广泛应用在植物细胞生物学研究、植物育种研究及植物染色体库的构建中15-19。三、流式细胞仪在植物科学研究中的样品制备方法由于植物细胞自身的结构特点，与动物细胞相比，植物细胞胞间连接紧密；植物细胞具有细胞壁、特殊细胞器以及中央液泡等，因此流式细胞

12、术应用于植物细胞时，在样品制备、染色、仪器的使用等方面除了应该遵循一般的原则外，还应适应植物细胞的上述特点2, 5。3.1 植物单细胞悬液及原生质体的制备方法流式细胞仪是在单细胞水平上进行分析或分选研究，因此用流式细胞仪研究植物细胞时首先要把样品制成单细胞悬液。由于植物细胞具有细胞壁的特点，经常选用纤维素酶、果胶酶等去除细胞壁，从而制备原生质体。原生质体的制备是研究植物细胞的前提。在制备原生质体时要把细胞置于近似生理条件下，并要保持细胞的活性。因此，根据研究目的的不同来选用适当的缓冲液，并注意控制酶处理的时间2, 15。在选用研究材料时，还要考虑到植物细胞核型的稳定性。由于大多数植物的根尖较易

13、获得且其核型较稳定，因此利用根尖材料制备染色体悬液成为广泛使用的方法。制备好的原生质可以应用于测定原生质体大小、细胞壁生物合成、原生质体融合产物分选、被膜抗原的表达等。在植物细胞研究中主要应用于分选出活的原生质体，并通过分选出来的原生质体再生出植株，其中最有意义的就是选出由原生质体融合所产生的异核体。同时也可以应用于植物细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡等植物细胞生物学研究中15, 18-19。3.2 植物染色体悬液的制备方法在植物遗传学、功能基因组学和植物育种研究中，经常用到流式细胞术分析植物染色体数目和结构的畸变，以及非整倍体和染色体缺失等。然而这些研究的基础是完整的染色体悬液15。制备植物染色

14、体悬液有两种常用的方法。其一、需要首先利用果胶酶和纤维素酶酶解细胞壁，然后将所获得的原生质体置于低渗缓冲液中，使得染色体得以释放。其二、利用秋水仙素(Colchicine)、甲基氨草磷(APM, Apiprophosmethy1)、安磺灵(Oryzalin)或氟乐灵(Trifluralin)将细胞同步化，同步化的细胞经甲醛固定后进行机械分离从而释放染色体。相对而言，后者更加快速，并且避免了长时间的酶解，减轻了对染色体的伤害2, 15。3.3 植物原生质体及染色体的分选方法流式细胞仪另外一个强大的功能便是其细胞或亚细胞分选功能。由于植物细胞原生质体较大且脆弱，为了得到有活性的原生质体，一般选择1

15、00-200m孔径的喷嘴，还可以通过降低鞘液的压力，同时降低液滴形成的信号频率，以使直径大的液流能准确的形成液滴。此外还需降低液滴偏转系统，以便观察液滴。分选而来的原生质体便于对其生化生理特性，分子细胞功能等进行研究2, 15, 20-21。四、流式细胞仪在植物科学研究中的应用流式细胞仪已经深入到植物学研究的诸多领域，推动着植物科学研究的飞速发展。目前，利用流式细胞术不但可以对植物细胞进行计数、测量基因组大小、还能分析细胞周期、进行流式核型（染色体的DNA含量）分析、分拣染色体以及构建染色体文库等。流式细胞仪可分选制备高纯度的特异性细胞群，因此利用流式细胞术分捡纯化出的染色体在分子生物学后续研

16、究领域有着广阔的应用前景2-5。下面就对流式细胞仪在植物科学领域的应用进行概括的介绍。4.1 植物细胞核分析 细胞核是细胞指令的发出场所和遗传物质的储存、加工及传递场所。流式细胞仪在细胞核分析方面涉及的应用范围颇为广泛：例如DNA、RNA、蛋白质含量的分析、染色质结构分析、细胞周期分析、染色体倍性分析等方面7, 21。4.2 原生质体分析正如前面所述，由于植物细胞结构的特殊性，流式细胞仪对植物细胞结构和功能的研究依赖于其原生质体的制备。通过对原生质体的分析研究植物细胞结构和功能等。通过流式细胞仪还可以研究原生质体产物分选，细胞融合产物分选，改良作物品种等方面15, 19。4.3 植物细胞染色体

17、分析和染色体文库构建流式细胞仪利用荧光染色手段能识别和分拣单个染色体。分拣的单一的染色体是构建染色体专性DNA文库和基因定位的最好材料。因此流式分拣的染色体的一个主要用途是构建染色体专性文库。这些染色体文库可以广泛应用在基因组分析和基因定位克隆中22-25。4.4 植物细胞结构和功能研究流式细胞仪已广泛应用到植物细胞结构研究中。例如细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、RNA含量、蛋白质含量、配体及特异抗原的研究中；流式细胞仪也被广泛应用在诸如细胞特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）、细胞内细胞因子、细胞活性、酶活性、激素结合位点、细胞受体信号转导等功能性研究方面26-

18、28。这些应用为植物细胞生物学研究提供强大工具和理论基础，并不断丰富其发展。4.5 植物分类学和植物系统学(Plant systematics)研究植物分类学和植物系统学是根据植物的特征，植物间的亲缘关系、演化的顺序，对植物进行分类的科学， 并在研究的基础上建立和逐步完善植物各级类群的进化系统29-31。流式细胞仪可在分子水平上对所研究物种待测的多个分子Marker如DNA、RNA序列等同时进行检测，然后综合定性、定量分析，从而对物种进行特征、归类，并为其系统发育研究提供分子水平上的遗传证据31。4.6 逆境植物学和植物病理学(Plant pathology)研究植物如何应对诸如干旱、低温、高

19、温、盐碱、病虫害、环境污染等逆境胁迫是植物科学和农业科学共同关心的重大科学问题11, 32-33。逆境条件可以通过境信号在细胞中通过信号转导和传递，最终诱导基因表达；逆境胁迫也可以通过代谢来调节基因表达，合成抗冻蛋白(Antifreeze proteins, AFPs)、热激蛋白 (Heat Shock Proteins, HSPs)、渗透调节蛋白(Osmotin)等抗逆蛋白质11。然而植物抗逆的分子机制并不清楚。基于流式细胞仪在细胞信号传导和蛋白功能研究等方面的强大功能，已被广泛应用于植物抗逆研究和植物抗病研究中。流式细胞仪为抗逆因子和抗病因子的表达和活性检测提供了很好的工具11, 32-3

20、3。4.7 植物育种研究植物育种是植物科学和农业科学研究领域另一重大科学问题。包括作物育种、园林植物育种等34。流式细胞仪应用到鉴定植物倍性和分选原生质体及染色体等方面。流式细胞仪根据DNA含量的多少可以判断染色体的数量，从而可以鉴定植物倍性，达到快速准确的效果，尤其适用作物育种群体检测如多倍体育种7。另一方面，通过对植物原生质体及染色体的分选使从分子水平上筛选特定优良基因，导入优良基因，改造物种成为了可能15, 34。流式细胞仪在植物育种中的应用，在提高作物抗逆能力和作物产量、培育园艺花卉等领域有着重要的研究意义。五、总结和展望综上所述，流式细胞仪在植物科学研究中已经得到了广泛的应用，几乎涉

21、及到植物科学和农业科学研究的各个方面，极大地推动着植物学科的发展；同时，也在植物科学研究中扮演着重要的作用1-6。自从BD流式细胞仪发明以来，就不断利用新的科学技术手段不断革新，服务于生物医学研究。通过我们对流式细胞仪在植物科学领域的研究方法、样品制备及应用前景的介绍，但愿能够更好地服务于您的科学研究！参考文献1. 耿慧霞(Geng HX), 王来(Wang L), 王强(Wang Q). 流式细胞仪在生物学中的应用(The application of flow cytometry in biology). 生物学杂志(J Biology), 2005; 22(4):44-46.2. 焦旭雯

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