吲哚并32c喹啉衍生物的设计合成与抗肿瘤活性研究.docx

1、吲哚并32c喹啉衍生物的设计合成与抗肿瘤活性研究密级: 及时公开 学号：s1210056 _年公开（最长5年） 硕 士 学 位 论 文吲哚并3,2-c喹啉衍生物的设计，合成与抗肿瘤活性研究Design, Synthesis, and Anti-tumor Biological Evaluation of Indolo3,2-cquinoline Derivatives 学生姓名 杨铁 指导教师 姚和权 教授 学科专业 药物化学 院部名称 药学院 协作指导 林爱俊 副教授 毕业时间 2015年 6月 原 创 性 声 明本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，遵照严肃求实的科学精神

2、，独立进行研究工作所取得的成果。论文中除已注明引用和致谢的内容外，不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对论文研究做出贡献的个人或集体，均在论文中作了明确声明并表示了谢意。本声明的法律责任由本人承担。论文作者亲笔签名： 日 期 ： 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的印刷件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权中国药科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等其他复制手段保存和汇编本学位论文。（保密论文在解密后适用本授权书）学位论文作者亲笔签名： 年 月 日导师

3、亲笔签名： 年 月 日 摘要恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的第二大疾病杀手，由于恶性肿瘤引起的死亡仅次于心血管疾病。每年，全世界约有760万的患者死于恶性肿瘤。传统治疗癌症的方法主要包括以下几类：手术治疗、化学治疗、激素治疗、生物以及靶向治疗等。化学治疗无疑在治疗领域占首要位置。常见的化疗药物主要包括植物来源的天然产物及其衍生物、细胞毒药物、靶向抗肿瘤药物。仅靠这些药物难以满足患者需求，要提高治疗疗效，就必须寻找有效的作用靶点。但是在重多的靶点中，能够作为治疗疾病的靶点却甚少。Top1是细胞生存的必需酶，参与DNA的复制、翻译、重组和修复等多个过程。作为抗肿瘤的一个有效靶点，临床却只有喜树碱碱类

4、Top1抑制剂。但是由于其具有较多缺陷，如母核内酯环极不稳定，很容易水解成羧酸形式；过度表达药物流出泵ABCG2和ABCB1的细胞会产生耐药性 ；Top1cc在药物解离后失活，这便吸引了众多学者寻找成药性更好的非喜树碱类Top1抑制剂。如今茚并异喹啉酮、吲哚咔唑和苯并菲啶类等已有多个化合物在临床研究中活性优于喜树碱。1998年， Cushman Mark发现NSC 314622具有抗增殖活性和中等强度的Top1抑制活性。其后他们对先导化合物进行结构修饰与优化，发现了一系列的活性较好的化合物，其中，Indimitecan与化合物Indotecan已在临床研究中。我们课题组借鉴了Cushman课题

5、组改造NSC 314622的经验，设计出吲哚并喹啉的母环。在课题组前人方法学研究的基础上，共合成获得了20个目标化合物，其结构均经质谱、核磁氢谱和碳谱进行确证。同时，选择MCF7、DU145和 HCT-116三种肿瘤细胞株，进行了目标化合物的初步药理活性筛选，结果发现，Ic、Ii、Ih和IIj四个化合物的抗增殖活性较好。在此基础上，我们总结了初步的构效关系。鉴于吲哚并喹啉类化合物结构稳定，易于修饰，因此可以作为有潜力的抗肿瘤药先导化合物进一步进行优化研究。论文该部分的初步研究结果为课题组进一步深入研究提供了有价值的参考。关键词：Top1抑制剂，茚并异喹啉酮，先导化合物，吲哚并喹啉，IC50值A

6、BSTRACT Malignant tumor has been the second leading cause of death following cardiovascular disease. Each year, 7.6 million people die from cancer worldwide. The traditional methods of cancer treatment include the following surgery, chemotherapy, hormonotherapy, biotherapy and targeted therapy. Chem

7、otherapy drugs undoubtedly occupy the most important position in this area, and they mainly include the following three categories: natural products and their derivatives,cytotoxic drugs,targeted antitumor drugs. To improve the treatment of tumor, we must start to look for effective targets. However

8、, during the thousands of targets, but few of them can be used to antitumor. DNA topoisomerase I (Top 1) is an enzyme essential for replication, transcription, recombination and repair, during a number of critical cellular processes. Camptothecins are the only clinically proved Top1 inhibitors, but

9、they have many liminations. As discussed above, 1) camptothecins are chemically unstable and rapidly inactivated to carboxylate in blood; 2) Cells overexpressing the drug efflux membrane transporters ABCG2 and ABCB1 are cross-resistant to camptothecins; 3) Top1cc reverses within minutes after drug r

10、emoval. Many efforts have been taken to overcome those liminations, including development of new noncamptothecin Top1 inhibitor. Nowadays, indenoisoquinolinone, indolocarbazoles, and benzophenanth- ridines that their activities are better than camptothecins were under review for clinical trials. In

11、1998, Mark Cushman group found indenoisoquinoline NSC 314622 was moderately cytotoxic in cancer cell cultures with an IC50 of 20 mol/L in vitro screen. Following the discovery of NSC 314622 as Top1 inhibitor, a number of promising compounds were developed. Indimitecan and Indotecan had been selected

12、 as new drug candidates for clinical development. Based on camptothecins and indenoisoquinolines, we designed indolo3,2-cquinoline skeleton. Continuing our interest in C-H activition, we synthesized 20 target compounds. Their structures were determined by MS, 1H-NMR and 13C-NMR. MTT assay was used t

13、o evaluate the antiproliferative activities of these compounds against MCF7, DU145 and HCT-116 cell lines. The experimental results revealed that the antiproliferative activities of four compounds (Ic、Ii、Ih and IIj) of them were fairly potent, thus they could be used as good lead compounds. On the b

14、asis of those results, preliminary SAR was summarized. Because target compounds are chemically stable and easy to optimize, they have great potencial to make further optimization. These achievements of the dissertation provide valuable information for further research.Key Words：Top1 inhibitors, inde

15、noisoquinolinone, leading compounds, indolo3,2-cquinoline, IC50第一章 研究背景第一节 抗肿瘤药物的发展概述随着全球经济的快速发展，人们生活质量普遍提高，然而恶性肿瘤（癌症）却越来越严重地威胁着人类的健康与生命。每年，全世界约有760万的患者死于恶性肿瘤1。究其原因，存在内外两大因素，内部原因如遗传突变、激素因素等；外部原因如烟草、饮食、辐射、环境以及感染等。癌症不管在发达国家或者发展中国家，都是造成死亡的重要因素。据推测，到2030年，每年因癌症死亡人数将有可能达到1100万1。尽管自上个世纪以来，在对抗癌症领域已经取得了巨大突破

16、，但是恶性肿瘤的治愈仍然是当前的挑战。在这个领域，仍需要投入大量的精力、财力去进一步的开发研究新成果来满足患者的需求。传统治疗癌症的方法主要包括以下几类：手术治疗、化学治疗、激素治疗、生物以及靶向治疗等1。化学治疗无疑在这方面占首要位置。常见的化疗药物主要包括以下三类：植物来源的天然产物及其衍生物、细胞毒药物、靶向抗肿瘤药物。1.1 植物来源的天然产物及其衍生物植物来源的抗肿瘤药物仍在当今抗肿瘤药物的市场上占有一席之地。随着生物学、药物化学等相关学科的发展，人们对天然产物及其衍生物的研究认识也逐渐加深，已经不再仅仅局限于陆地来源的植物，而是向来源更加广泛的海洋植物去提取开发。为了满足药物市场的

17、需求，必需通过化学修饰、改造以及骨架跃迁等手段，以备得到活性更好，毒性更低新型天然产物衍生物。1.1.1 紫杉醇类抗肿瘤药物紫杉醇(1, Figure 1.1)是1971年Wani等人从短叶红豆杉中提取分离得到，具有很好的抗肿瘤活性2。1979年，Horwitz等阐明了紫杉醇(1)独特的抗肿瘤作用机制3：紫杉醇(1)可使微管蛋白与组成微管的微管蛋白二聚体失去动态平衡，诱导和促进微管蛋白聚合、装配、防止解聚，从而使微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂，防止诱导细胞凋亡，进而有效阻止癌细胞的增殖，达到抗肿瘤的目的。紫杉醇于1992年经FDA批准上市，主要用于晚期卵巢癌II期治疗。在2000年，其销售额达

18、到了16亿美元，创下单一抗癌药销售之最。目前，紫杉醇(1)已成为世界销量第一的抗癌药物，同时也是世界上广谱抗癌药物。Figure 1.1 植物来源的抗肿瘤药物结构1.1.2 长春碱类抗肿瘤药物长春碱(2, Figure 1.1)和长春新碱(3, Figure 1.1)均是从夹竹桃科植物长春花中分离提取得到的双分子吲哚类生物碱，具有明显的抗肿瘤活性。自从上世纪70年代起，长春碱(2)、长春新碱(3)、长春地辛(4, Figure 1.1)、长春瑞滨(5, Figure 1.1)等已广泛应用于临床。尽管长春碱类药物有不同的抗肿瘤谱和细胞毒性，但其作用机制均是通过与微管蛋白结合，抑制微管聚合，阻碍纺

19、锤体微管的形成，从而使细胞中期停止分裂，阻止细胞的增殖4。而如今像长春福宁(6, Figure 1.1)、长春甘酯(7, Figure 1.1)以及脱水长春碱(8, Figure 1.1)也处在临床研究中。虽然植物来源的药物由于其作用机制独特，抗癌效果显著，已经在临床中占主导地位，但是寻找新型骨架的天然分子以及通过结构修饰与改造得到一些活性更好，毒副作用更小的衍生物仍是科学研究的重点。1.2 传统的细胞毒药物细胞毒药物自上个世纪40年以来就开始在临床中使用，几十年来，已经取得了突破性的进展。传统的细胞毒药物主要包括烷化剂、金属络合物、蒽环类药物以及破坏DNA的抗生素等5。但由于其毒副作用大，现

20、临床使用相对较少。1.2.1 烷化剂早在1932年，法国人就已经报道了烷化剂对肿瘤影响的研究性试验。如芥子气(9, Figure 1.2)能够抑制小鼠的Ehrlich癌，从而达到治疗乳腺癌的效果，实验过程中能够明显地观察到肿瘤的消退。二战期间的“巴里灾难”更是驱使药物科学家又一次深入系统地研究烷化剂，使得烷化剂得到飞跃发展。常见的烷化剂如卡莫司汀(10, Figure 1.2)，白消安(11, Figure 1.2)，环磷酰胺(12, Figure 1.2)，塞替派(13, Figure 1.2)等5。Figure 1.2 烷化剂结构1.2.2 金属络合物自上个世纪60年代发现“顺铂(14,

21、Figure 1.3)”具有抗肿瘤的活性以来，金属铂类抗肿瘤药物得到了广泛应用，并进一步发展了以第一代“顺铂”(14)，第二代卡铂(15, Figure 1.3)，第三代奥沙利铂(16, Figure 1.3)为主的药物，如今已经不再局限于金属铂的衍生物，而是向其他过渡金属如金6,7,8、钌9,10,11等发展。Figure 1.3 金属铂类抗肿瘤药物结构1.2.3 蒽环类药物蒽环类药物在抗生素整改之前普遍应用，它们在结构上有一个共同的特征，就是在蒽环并六元环的基础上带有氨基糖类的侧链。这类化合物结构相近，作用机制类似，都是通过嵌入DNA双链的碱基之间，形成稳定的络合物，抑制DNA复制与RNA

22、合成，从而阻碍癌细胞分裂。这类化合物以阿霉素类为代表，包括表阿霉素(17, Figure 1.4)，洋红霉素(18, Figure 1.4)，4-去甲氧柔红霉素(19, Figure 1.4)等。Figure 1.4 蒽环类与抗生素类结构1.2.4 破坏DNA的抗生素博来霉素A2(20, Figure 1.4)是从轮枝杆菌(Str.Verticillus)中提取分离得到的。这类化合物通过嵌入DNA，引起DNA单链或双链的断裂，达到杀死肿瘤细胞的目的。丝裂霉素(21, Figure 1.4)作为另一类抗肿瘤抗生素，主要是从链霉菌(Streptomyces)中提取的，其化学结构具有苯醌，乙酰亚胺基

23、及氨甲酰三个活性基团，作用机制与烷化剂相似，与DNA的双链交联，抑制DNA的复制和转录。总之，传统的抗肿瘤药物有很大的缺陷。虽然其活性很高，但是选择性太差，在杀死肿瘤细胞的同时，往往还杀死正常细胞，这对于患者来说是致命的伤害。因此临床上这类药物用得并不是很多。1.3 靶向抗肿瘤药物随着肿瘤药理学、分子药理学等学科的迅速崛起，靶向抗肿瘤药物的研究开发逐渐成为现代抗肿瘤药物研发的重要方向之一。由于传统细胞毒药物并无特异的选择性，在杀死肿瘤细胞的同时，也能对正常细胞也造成一定损伤，因此常常给癌症患者带来严重的不良反应与毒副作用。而靶向药物则具备一定的特异选择性，能够识别肿瘤细胞上某些特有基因决定的靶

24、点、靶标，并与之结合12，发挥抗肿瘤作用的同时还能够减少毒副作用，提高肿瘤患者生存质量，所以靶向抗肿瘤药物在临床上的应用越来越广泛。根据分子量的大小，靶向抗肿瘤药物可分为单克隆抗体和小分子抑制剂两大类别。1.3.1 单克隆抗体单抗主要是通过杂交的肿瘤细胞生产出来的。由于生产单抗的细胞都源于单一细胞，所以单抗识别抗原的能力特别强，也就具备了靶向性。利用这一特性，人们可以研发诊断试剂和靶向药物。现在普遍认为，单抗是与肿瘤细胞表面上的抗原结合，激活补体介导的细胞死亡，诱导肿瘤细胞的凋亡。另外，一些肿瘤细胞生长、分化需要各种因子的刺激，这些因子也参与肿瘤的侵润、转移，而单抗与受体结合，可以抑制配体与受

25、体的作用，使肿瘤细胞得不到因子而死亡。到目前为止，临床上已有多个靶点的单抗，例如，针对HER2/neu的单抗Herceptin用于治疗乳腺癌；针对ERFR人/鼠嵌合Ig(1)的单抗cetuximab用于治疗转移性结直肠癌；针对VEGF的单抗bevacizumab用于一线治疗结直肠癌。2014年，美国FDA批准上市的41个新分子实体中，其中抗肿瘤单抗就有6个13。抗肿瘤单抗已经成为人们研究的热点之一。1.3.2 小分子抑制剂2001年，Bcr-ab酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(22, Figure 1.5)率先上市，开创了小分子靶向抗肿瘤药物的新时代。随后2003年，吉非替尼(23, Figure

26、1.5)成功用于EGFR突变的肺癌人群，开启了个体化治疗的先河。2011年，用于治疗非小细胞型肺癌的克卓替尼(24, Figure 1.5)，从发现到上市仅仅三年时间14。这些例子告诉我们，小分子靶向抑制剂已逐渐成为当今抗肿瘤药物的主流。在国内，更是激起研究的热潮。根据靶点的不同，可以分为：蛋白激酶抑制剂，组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂，法尼基转移酶，细胞周期调节因子等。其中蛋白激酶抑制剂是研究最广泛，应用最多的小分子靶向抑制剂。蛋白激酶是一种催化蛋白质磷酸化的酶，主要包括丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶和酪氨酸(Tyr)激酶。酪氨酸激酶与体内细胞信号通路相关，控制细胞的增殖、生长、凋亡等。约

27、80%的致癌基因都有酪氨酸激酶，这使其成为抗肿瘤靶向药物的重要靶点。 Figure 1.5 蛋白激酶类抑制剂结构1.3.2.1 EGFR抑制剂吉非替尼(23)是EGFR抑制剂，竞争性地与EGFR-TK (EGFR-酪氨酸激酶)催化区域的Mg-ATP结合，阻断信号传递，促进细胞的凋亡，抑制肿瘤血管的生成15。所以吉非替尼(23)作为一线治疗EGFR基因突变的晚期非小细胞肺癌的药物，与传统的铂类药物相比，能够明显提高患者的生存率与生存质量。1.3.2.2 VEGFR抑制剂阿西替尼(25, Figure 1.5)是辉瑞公司开发的一种强效选择性VEGFR抑制剂，可以持续、显著地抑制肿瘤血管的形成。主要

28、是通过抑制VEGFR磷酸化而发挥抗肿瘤的作用，对VEGFR2的抗增值活性达到0.2 nM。现用于治疗肾细胞癌16。阿帕替尼(26, Figure 1.5)是我国恒瑞医药股份有限公司自主研发的VEGFR抑制剂，于2014年12月经SFDA批准上市，用于治疗晚期胃癌。1.3.2.3 c-MET抑制剂SU1127417 (27, Figure 1.5)是ATP竞争性Met小分子抑制剂，其IC50为10 nM。其选择性是其他激酶EGFR、CDK、FGFR等的500倍以上。也能抑制表达c-Met的NSCLC细胞的活力并抑制HGF诱导的c-Met磷酸化及其下游信号的传导，尤其是对PI3K及Ras途径的抑制

29、作用。PHA665752 (28, Figure 1.5)是c-Met特异性小分子抑制剂18，对c-Met的多个酪氨酸残基有抑制作用，也能阻止c-Met途径中信号调节因子与c-Met的结合。1.3.2.4 BCR-ABL抑制剂普纳替尼19(29, Figure 1.5)是第三代酪氨酸激酶抑制剂，靶向于CML和费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病特有的酪氨酸激酶。其体外抑制ABL与T315I 突变ABL酪氨酸激酶活性的IC50分别为0.4和2.0 nM，临床用于治疗慢性髓细胞白血病。 近年来，多靶点抗肿瘤药已经引起了重视。现在已上市或处在临床不同阶段的激酶抑制剂很多都是非选择性的，可以同时抑制多种信

30、号转导途径。原来在临床中很多单一靶点的酪氨酸激酶抑制剂被发现也能作用于其他靶点。随着CADD、分子生物学等迅速发展，小分子靶向药物将得到进一步的发展。第二节 拓扑异构酶的简介及抗菌药的研究进展2.1 拓扑异构酶简介拓扑异构酶是真核和原核生物体内基本酶之一，普遍存在于细胞核（拟核）之中。根据其功能和作用方式的不同，拓扑异构酶可以分为拓扑异构酶I、II、III和IV四大类20,21。而作为抗肿瘤药物靶点的主要是拓扑异构酶I和拓扑异构酶II (Table 1.1)，它们的区别在于，拓扑异构酶I在DNA复制和转录的过程，只能够解双螺旋结构中一条DNA链释放负超螺旋，而拓扑异构酶能够同时切断两条DNA链

31、释放复制叉前面的正超螺旋，待其旋转恢复正确旋转度后，再次将链连接起来。而在原核细胞中，抗菌药往往都是针对细菌拓扑异构酶II的靶点22。Table 1.1 拓扑异构酶的分类类型酶与DNA复合物人类细菌基因蛋白药物基因蛋白药物IA5-PYTOP3ATop 3无TOPATopo I无TOP3BTop 3无TOPBTopo III无IB3-PYTOP1Top 1抗肿瘤无TOPIMTTop 1mt无IIA5-PYTOP2ATop 2抗肿瘤GYRAGyrase抗菌药GYRBTOP2BTop 2PARCTopo IVPARE在这里，我们以真核生物的拓扑异构酶为例，考察一下拓扑异构酶的作用方式20。首先Top

32、1与DNA结合(Figure 1.6)，Top1的723位酪氨酸残基（Tyr723）上的酚羟基亲核进攻DNA的磷酸二酯键，形成3端Top1-DNA的共价复合物，从而切开DNA的一条链，使得5端游离出来。然后，游离出来的5端围绕另一条DNA链旋转一周，增加或者减少一个超螺旋。最后，Top1再从断开的DNA链上解离，断开的DNA重新连接起来。与Top1不同的是，Top2是同时进攻DNA的两条链(Figure 1.6)，游离DNA的3端，切开DNA的双链，增加或者减少两个超螺旋。另外Top1参与的解螺旋并不需要能量，而Top2的催化部位与DNA形成Top-DNA复合物时，需要ATP的结合，在Tyr亲核进攻