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1、正常小鼠和IL10基因敲除小鼠肠道菌群TRFLP分析论文及综述桂林医学院毕业设计（论文）正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析院 系: 生物技术学院 学 号: * *专 业: 2009级生物技术 *2013年5月22日星期三正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析2009级生物技术 程骏 指导老师 朱嗣博摘要 【目的】设计应用T-RFLP技术，对正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的肠道菌群进行多态性分析；【方法】设计一个引物的5末端用荧光物质标记（常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等），使样本DNA经PCR后都带有这种荧光物质；【结果】PCR产物经纯化后酶切，可以先进

2、行琼脂糖凝胶电泳，最后对酶切后的产物末端进行测序得到了T-RFLP 峰谱图, 该图谱能够快速准确地对不同种的菌群进行定性、定量的分析；【结论】成功使用T-RFLP技术对正常小鼠和IL10基因敲除小鼠的肠道菌群进行多态性分析，得到两种小鼠肠道菌群的差异性，经分析可以得到一种或几种菌群对于IL-10有特殊的联系。对于IL-10的应用有重要作用。关键词 T-RFLP技术；基因图谱；IL-10基因Il-10 GENE knockout mice and normal mice intestinal flora polymorphism analysis2009-biotechnology Cheng

3、Jun Supervisor ZhuSiboAbstract 【 Objective 】 Designing application of T - RFLP technique, the normal mice and IL-10 knockout mice intestinal flora polymorphism analysis. 【 Methods 】 Designing a primer 5 terminal marked with fluorescent substances (commonly used fluorescent substance has a HEX, TET,

4、6 - FAM, etc.), after making the sample DNA by PCR with the fluorescent substance. 【 Results 】 PCR product after purification of the enzyme, can first carries on the agarose gel electrophoresis, finally after enzyme digestion of the end product sequencing got T - RFLP peak spectra, the map can rapid

5、ly and accurately for different kinds of microbes for qualitative and quantitative analysis. 【 Conclusion 】 Successful using T - RFLP technique of IL-10 knockout mice and normal mice intestinal flora polymorphism analysis, get the differences of two kinds of intestinal flora in mice, by the analysis

6、 of one or several kinds of bacteria can be have a special connection for the IL - 10. For the application of IL - 10 play an important role.Key words T - RFLP technique; Gene mapping; Il-10 gene 首先介绍一下IL-10，在1989年，Mosmannand及他们的同事描述了一种新的免疫介质，由Th2细胞克隆分泌，能够抑制Th1细胞克隆IL-2和IFNr的合成。早期被命名为细胞因子合成抑制因子（CSIF）

7、，这种因子后来被命名为IL-10，在这被发现的21年期间，很多研究深入剖析了这个细胞因子的生物学特性.IL-10的分子量为3540kd，通常为二聚体；主要由TH2细胞产生，也可由单核细胞、角质细胞及活化的B细胞产生。IL-10能够抑制活化的T细胞产生细胞因子，因此曾称为细胞因子合成抑制因子（csif），特别是抑制th1细胞产生il-2、ifn和lt等细胞因子，从而抑制细胞免疫应答。IL-10可降低单核巨噬细胞表面mhc类分子的表达水平，损害了apc的抗原递呈能力，实际上这可能是其抑制细胞介导免疫的原因。此外，IL-10还能抑制NK细胞活性，干扰NK细胞和巨噬细胞产生细胞因子；但可刺激B细胞分化

8、增殖，促进抗体生成。近年来分子生物学技术已被广泛地应用于微生物群落结构分析, 主要的研究方法包括: 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、荧光原位杂交法( Fluorescence in situhybridization, FISH)、限制性酶切片段长度多态性分析法(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)、变性梯度凝胶电泳法 (Denaturinggradient gel electrophoresis, DGGE)和末端限制性片段长度多态性分析(Terminal restrictionfragme

9、nt length polymorphism, T-RFLP)等1。T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其中一个引物的5末端用荧光物质标记，常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等。提取待分析样的中DNA，以他为模板进行PCR扩张，所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光标记，然后PCR产物有合适的限制性内切酶进行消化，一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。消化产物用自动测序仪进行测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测到。因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细

10、菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况2。 这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大3。一、材料和实验流程1、实验材料、试剂和设备1.1实验材料：正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠的粪便以及它们的肠道组织。样本有两组,一组样本有十六个,另一组样本有八个。1.2实验试剂：细菌基因组DNA 提取试剂盒，PCR 反应体系所需试剂DNA 聚合酶、dNTP、buffer、上下游引物（自己设计，标记荧光，交由生工合成），纯化试剂盒，酶切反应体系所需试剂酶、buffer，DNA电

11、泳液电泳所需试剂琼脂糖凝胶、电泳液、marker、loading等。1.3实验设备：移液枪，枪头，PCR仪，金属浴仪，DNA电泳仪，灭菌锅，离心机，振荡器，PH计，净化工作台，DNA分析测序仪（交由生工分析）等。2、实验流程2.1 细菌基因组DNA提取（小鼠粪便基因组提取试剂盒）1）将样品加到2ml的EP管中；2）加400ulAP1和4ulRNaseA，65温浴10min，每三分钟颠倒混匀一次（温浴时间可适当延长）；3）加130ulAP2，混匀，冰浴5min，14000rpm 5min；4）将上清转移到2ml吸附柱内，14000rpm 5min；5）将收集管内上清移入一个新的EP管内，不可有沉

12、淀，加入1.5倍的AP3，混匀；6）分次将混合液移入一个新的2ml吸附柱内，8000rpm 1min，弃掉收集管中液体；7）将吸附柱移入一个新的收集管内，加500ulAW，8000rpm 1min，弃掉收集管中液体；8）再加500ulAW，14000rpm 2min；9）将吸附柱移入一个2ml的EP管内，加100ul超纯水（55）洗脱，室温静置5min，8000rpm 1min，在通风处放置1min，再重复一次效果更佳。2.2 引物设计上游引物8F(5-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3)，在5末端加上荧光物质6-FAM标记，下游引物806R(5-GGACTACCRGGGTATCTA

13、A-3)，在5末端用HEX进行标记456。2.3 PCR扩增反应PCR 扩增反应体系采用50 L, 模板量为2 L, 阴性对照用ddH2O代替模板DNA。PCR 扩增条件为: 94 C 5min; 94 C 30 s, 52 C 30 s,72 C 2 min, 共30 个循环; 72 C 10 min。PCR反应完成后用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收800bp位置的DNA条带。2.4 限制性内切酶酶切选用Hha作为实验的限制性内切酶。酶切体系采用40 L, PCR 产物为6 L,在37 C 酶切6 h, 反应完成后, Hha在65 C 水浴中20 min失活。2.5 琼脂糖凝胶电泳分析在酶切完

14、全之后，取5ul的酶切液进行电泳，140V，30min，看电泳条带，一般这个条带会很淡，因为主条带被切碎成很多的片段，大小不一，分布的很开，因此我们主要还是看800bp位置的条带是否还是存在，一般酶切完全之后这个位置的条带基本就已经没有了，其实在酶切的过程中就会进行多次电泳来决定其酶切的时间和程度，以便于及时停止酶切反应，保证酶切的质量。2.6 T-RFLP分析的流程图 上面是两张简易的T-RFLP流程图，可以比较直观方便了解其实验的步骤：2.7 T-RFLP图谱预处理对于每个图谱，去除荧光强度小于100和片段大小35或者500的片段数据，将剩下片段的峰面积进行标准化处理，并去除相对丰度小于1

15、的片段78。2.8 数据分析将T-RFLP的数据转换成10矩阵（1表示有，0表示无），利用SPSS16.0中的聚类分析工具（Classifiy-hierarchical Analysis），采用非加权配对算法平均法对每组样本进行聚类分析。接下来用软件SPSS16.0进行物种丰度（S）和Shannon-Weiner指数（H）的计算,结果用图表显示。二、结果用提取的八个粪便样本的基因组做PCR，电泳图如右：八个样本的编号从左到右依次是：P3、21B、23、59A、P1、29、47A、P4前四个样本是干预组的，后四个是对照组。每一组四个样本的小鼠都是经过相同处理的，通过电泳图的观察来决定酶切时所加的

16、PCR产物量的多少，来保证酶切的DNA量接近，不会相差太多，导致误差太大。Hha酶切充分之后，进行DNA分析测序，得到T-RFLP的图谱和原始数据。图谱分析：遵循的原则：Any fragment of 35 or 500bp was excluded；T-RFs can vary over a range of 13 bp among different gels or lanes910.左面是干预组的两张图谱，样本号分别是23和P3.坐标表示-（Size，Height）同一组样本的图谱在峰值区域的存在基本上是一致的，500bp以上的峰值可能是没有酶切开或者是酶切不了的片段，不作为参考依据。峰

17、值的高低差异在一定范围内都是属于正常的。左面是对照组的两张图谱，样本编号分别是P1和59.这两张图谱的峰情况基本相同，差异不大。比较对照组和干预组的图谱，不难发现这两组之间最大的差异大致就在size95bp100bp间的峰。接下来就进行具体的统计学分析，见表格一。表格一：从统计学分析中能看到差异较大的有两个区域，size大小分别是92bp99bp，225bp369bp。三、讨论人体肠道内有1014 的细菌，包括大量的专性厌氧菌。由于传统方法的局限，有不少的菌是无法进行培养的，因此一般分离培养方法只能分析出人肠道内40% 左右的细菌，导致研究的片面性。而基于16srRNA 的TRFLP不需要分离

18、培养过程，理论上可以检测到微生态系统中所有的菌11。IL-10基因的发现及IL-10细胞因子在动物体中的重要作用越来越引起大家的注意，特别是其在免疫系统中的作用。现在有一些病人因为IL-10细胞因子的原因患了一些疾病，因此我们对IL-10进行了研究，我们通过T-RFLP技术对IL-10细胞因子在肠道菌群中的影响进行研究12。通过T-RFLP技术得到的数据，我们可以初步判定IL-10基因对于小鼠的肠道菌群是有很大影响的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之间肠道菌群存在很大差异，至少有一种或多种菌群在数量上差异很大13。T-RFLP技术能够对微生态系统进行准确快速的动态检测，拥有易于自动化和数据共

19、享等优势14。参考文献：1 Aas JA, Barbuto SM, Alpagot T, Olsen I, Dewhirst FE,Paster BJ. (2007). Subgingival plaque microbiota inHIV positive patients.J Clin Periodontol 34: 189195.2Aas JA, Griffen AL, Dardis SR, Lee AM, Olsen I, DewhirstFE et al. (2008). Bacteria of dental caries in primaryand permanent teeth

20、in children and young adults.J Clin Microbiol 46: 14071417.3Aas JA, Paster BJ, Stokes LN, Olsen I, Dewhirst FE. (2005).Defining the normal bacterial flora of the oral cavity.J Clin Microbiol 43: 57215732.4Becker MR, Paster BJ, Leys EJ, Moeschberger ML, KenyonSG, Galvin JL et al. (2002). Molecular an

21、alysis ofbacterial species associated with childhood caries.J Clin Microbiol 40: 10011009.5Cole JR, Chai B, Farris RJ, Wang Q, Kulam-Syed-MohideenAS, McGarrell DM et al. (2007). The RibosomalDatabase Project (RDP-II): introducing myRDP spaceand quality controlled public data.Nucleic Acids Res35: D16

22、9D172.6 Craig RG, Boylan R, Yip J, Mijares D, Imam M, Socransky SS et al. (2002). Serum IgG antibody response to periodontal pathogens in minority populations: rela- tionship to periodontal disease status and progression. J Periodontal Res 37: 132146.7de Lillo A, Ashley FP, Palmer RM, Munson MA, Kyr

23、iacou L, Weightman AJ et al. (2006). Novel subgingival bacterial phylotypes detected using multiple universal polymerase chain reaction primer sets. Oral Microbiol Immunol 21: 6168. 8Denepitiya L, Kleinberg I. (1982). A comparison of the microbial compositions of pooled human dentalMicrobiota correl

24、ated with oral health status T Takeshita et al76The ISME Journalplaque and salivary sediment. Arch Oral Biol 27: 739745. 9Donley CL, Badovinac R, Sapir S, Shapira L, Houri Y, Kantarci A et al. (2004). IgG antibody levels to Porphyromonas gingivalis and clinical measures in children. J Periodontol 75

25、: 221228.10Dray S, Dufour AB. (2007). The ade4 package: implement- ing the duality diagram for ecologists. J Stat Softw 22: 120.11Forney LJ, Zhou X, Brown CJ. (2004). Molecular microbial ecology: land of the one-eyed king. Curr Opin Microbiol 7: 210220.12Haffajee AD, Cugini MA, Tanner A, Pollack RP,

26、 Smith C, Kent Jr RL et al. (1998). Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. J Clin Periodontol 25: 346353. 13Hart GT, Shaffer DJ, Akilesh S, Brown AC, Moran L, Roopenian DC et al. (2004). Quantitative gene expres- sion profiling implicates genes for susce

27、ptibility and resistance to alveolar bone loss. Infect Immun 72: 44714479.14Hooper LV, Gordon JI. (2001). Commensal hostrelation- ships in the gut. Science 292: 11151118. Jenkinson HF, Lamont RJ. (2005). Oral microbial commu- nities in sickness and in health. Trends Microbiol 13: 589595.15. Binder,

28、H.J.; Filburn, B.; Floch, M. Bile acid inhibition of intestinal anaerobic organisms. Am. J. Clin. Nutr. 1975, 28, 119125. 16. Floch, M.H.; Gershengoren, W.; Diamond, S.; Hersh, T. Cholic acid inhibition of intestinal bacteria. Am. J. Clin. Nutr. 1970, 23, 810. 17. Rowland, I.; Faughnan, M.; Hoey, L.

29、; Whl, K.; Williamson, G.; Cassidy, A. Bioavailability of phyto-oestrogens. Br. J. Nutr. 2003, 89(Suppl. 1), S45S58.综述T-RFLP技术在肠道菌群研究中的应用进展关键词 多样性; 肠道菌群微生物群落的多样性一直是微生态学和环境微生物学研究的重点，在人类疾病的预防和治疗及机制研究中占据着举足轻重的地位。随着分子生物学技术的迅速发展，人们不再满足单纯的依赖传统的培养及镜检方法对微生态进行研究，而越来越多的是从分子水平的角度去研究复杂的微生物群落组成及其多样性。一种以PCR技术、RFL

30、P技术和DNA测序技术为基础产生的准确、高通量、快速简便的对微生态系统进行动态检测的技术，即末端标记的限制性片段长度多态性分析 ( Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T -RFLP)，成为人们研究各类微生物群落多样性的工具。通过对带荧光标记片段(Terminal restriction fragment，TRF)的大小、峰高和峰面积的分析得到目标系统的菌群结构，对生态系统的多样性进行分析及动态监测，因此拥有易于自动化、数据共享等优势。本文就其在人体肠道微生物菌落分析中的应用和展望进行阐述。1 TRFLP 在人肠道菌群菌落分析的应

31、用人体肠道内有 1014的细菌，包括大量的专性厌氧菌。由于传统方法的局限，有不少的菌是无法进行培养的，因此一般分离培养方法只能分析出人肠道内 40% 左右的细菌，导致研究的片面性。而基于16s rRNA 的TRFLP不需要分离培养过程，理论上可以检测到微生态系统中所有的菌。Nagashima1通过对 8 个正常人粪便的 DNA TRF分布与 TAP (TRFLP analysis program)软件模拟分析的结果进行比较，得出适合用于检测人粪便菌群，尤其是双歧杆菌的新的引物酶组合。Mstsumoto 等2通过建立种系发生比对的数据库，印证了该方法可达到对人结肠群落种水平的分析，与TAP 数据库中的细菌种类有 80% 的匹配度。Li 等3对 TRFLP 的实验条件进行了优化，对总DNA提取的方法进行了摸索，最终得出该技术具有高通量、高重现性的特点，能很好的反映人类肠道菌群的结构特征的结论。Anonia 等4对一个成年人的粪便进行分析，得到82个菌种，其中拟杆菌属、球形梭菌和柔嫩梭菌亚种占据了95%。目前，由于数据库及相关资料的缺乏，只有24%的TRF可以查出对应的菌种，如多形类杆菌、普拉梭杆菌、直肠真杆菌等。1.1 TRFLP 在研究各年龄阶段人体肠道菌群差异中的应用人肠道内的菌群处于一个动态的变化中，不同生理阶段、不同的环境等都会造成菌群结构上