常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术.docx

1、常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术10YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4。500B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4。100AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL水中，过滤除菌，存于4。10D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。500生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4，可放1年。10

2、0H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。10M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4，可放2个月。10GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。100AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL水中，过滤除菌，存于4，可放1年。1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.00.1（如果需调pH值，

3、用磷酸或KOH）。过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL100mg/mL遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20。用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4保存。LB平板培养基在LB液体培养基中加入琼脂粉15g，高压灭菌，冷却至45左右时倒平皿，4保存。LA平板培养基待LB液体培养基冷却至45左右加入Amp (100g/mL)，摇匀后倒平皿，4保存。YPD培养基：1%酵母提取物，2%胰蛋白膝，2%葡萄糖；RDB转化

4、固体培养基：(Regeneration DextroseMedium+ Histidine)（lmol/L山梨醇，l%葡萄糖，1.34%YeastNitrogenBasewithAmmoniumSulfate with amino acids(YNB)，0.004%Biotin，0.005%谷氨酸，0.005%甲硫氨酸，0.005%赖氨酸，0.005%亮氨酸，0.005%异亮氨酸，1.5%xx；）100mL：超纯水80ml，山梨醇18g(186g/L)，琼脂糖2g（20g/L）121灭菌20分钟，待温度将至60以后，在超净台内加入10*YNB 10ml,10*D（20%葡萄糖）10ml,500

5、*B（0.02%生物素）0.2ml100*AA（含每种氨基酸0.5%）1ml.混匀，倒平板。YPD-遗传霉素平板：1%酵母浸出物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%不同量的遗传霉素4.0，250mL（8-10个遗传霉素平板）。取1gG418溶于1ml1M的HEPES液或PBS中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl,0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g葡

6、萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。0.50mg/ml，0.75mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml，4.0mg/ml五个梯度MD：选择培养基：(MinimalDextroseMedium+Histidine)（1.34%YNB，0.004%Biotin，2%葡萄糖，1.5%琼脂；）待温度将至60以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D（20%葡萄糖）10ml, 500*B（0.02%生物素）0.2ml，混匀，倒平板。MM：选择培养基：(Minimal Methanol+ Histidine )（1.34%YNB，0.004%

7、Biotin，0.05%甲醇，1.5%xx；）100mL：向90mL超纯水中加入琼脂糖2g（20g/L），121灭菌20分钟，待温度将至60以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, , 500*B（0.02%生物素）0.2ml，5mL甲醇混匀，倒平板。BMGY： （1%酵母提取物，2%蛋白陈，100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，0.004% Biotin，l%甘油(V/V)；）1L：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO411.8G/L，超纯水890Ml，121灭菌20分钟，待温度将至60以后，在超净台内加入10*YNB 10

8、0ml,500*B（0.02%生物素）1ml，甘油10mL。BMMY： 0.5%甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同。1L：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO411.8G/L，超纯水895Ml，121灭菌20分钟，待温度将至60以后，在超净台内加入10*YNB 100ml，500*B（0.02%生物素）1ml，5mL甲醇。主要溶液2*SDS样品缓冲液：25mL 4*TrisHCl，PH6.8(0.lmol/L)20mL甘油20%(w/v)4g SDS4%(w/v)2mL2-巯基乙醇或3.1g DTT1mg溴酚兰0.001%(w/v)加蒸馏水至l00mL并混

9、匀，等量分装成lmL于-70贮存。5*SDS电泳缓冲液：15.lgTris碱(0.125mol/L)72.0g甘氨酸(0.96mol/L)5.0g SDS0.5%(w/v)使用前稀释至1XSDS电泳缓冲液，贮存液不必调教pH值，稀释后溶液pH8.3，考xxxx染色固定液：50%(v/v)甲醇10%(v/v)乙酸40%重蒸水染色液：50%(v/v)甲醇0.05%(v/v)考马斯亮兰R-25040%重蒸水10%(v/v)乙酸配制时先用甲醇溶解考马斯亮兰，再加入乙酸和水。溶液可保存6个月，若出现沉淀，滤除即可。脱色液：7%(v/v)乙酸5%(v/v)甲醇88%重蒸水一、大肠制备感受态细胞需灭菌的设备

10、大离心管：小离心管：50ml大枪头5mlLB培养基：10%甘油1挑单个大肠接入LB液体培养基，培养过夜37摇床，并做抗性对照。2以1：100比例接菌，进行大摇（2ml接入200ml培养基中37摇床）3OD达到0.5-0.7时，冰上放置20min。4离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余4加入等体积的10%甘油轻轻重悬。4离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余5加入体积的10%甘油轻轻重悬。4离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余6加入体积的10%甘油轻轻重悬。4离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余7加入适量灭菌10%甘油，一般500ml菌液加入2ml甘油，重悬

11、，8分装，每管40ul，先冻与液氮，然后放入-80保存二、毕赤酵母GS115电转化感受态的制备1在含5mLYPD的50mL离心管中，培养P. pastoris，30过夜；2取0.1-0.5mL过夜培养物，接种含50mL新鲜培养基的摇瓶，过夜生长至OD6001.3-1.5；3在4，1 500 r/min离心5min收集细胞，用5mL预冷的灭菌水悬浮细胞；4如上离心，用5 mL预冷的灭菌水悬浮细胞；5如上离心，用2mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞；6如上离心，用1 mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5mL（可冻存80L等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多）。三、xx酵母电

12、转化1取80L上述细胞与5-10L经S线性化DNA（约5-20ug）混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；2在冰上放置5min；3根据所使用装置推荐的S. cerivisiae参数进行电击(1 500V，5ms)；4立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；5分成200-600L等份，涂于RDB平板上，进行His营养缺陷筛选；6在30孵育平板3-5d，至His+克隆产生。四G418筛选多拷贝基因1）取出长有克隆的3块板，可考虑先挑1020个菌落先表达；2）第一块加入2ml灭菌的ddH2o，用涂布棒打匀，洗后，菌液吸入第二块；3）第二块加入1ml，洗之，吸入第三块；

13、4）菌液吸入EP管，可适量补充ddH2o；5）混匀后取适量稀释约50倍，4ul50200ul每块G418板，G418浓度从0.254.0mg/ml各一块；6）注意涂布均匀，可适量补充ddH2o，7）300C烘箱培养，25day，其余菌液可40C保存注：a）手册推荐方法：第4）步将菌液转入EP管中，振荡510秒，用分光光度计布105cells；注意agar的存在会干扰分光光度计的读数。五表达：1）从G418板挑单克隆入4ml/管MGY接种，300C，250rpm，2天左右至OD26，颜色乳白；2）取1ml菌液于EP管中保种，余3ml菌液离心，1500g，5min，菌体换3ml BMMY，加千分之

14、五甲醇，300ul/管；3）每隔24小时加千分之五甲醇；4）至表达之日起2天后每天取样80ul，留作电泳分析；5）表达4天结束，1500g离心，5min，分别收集上清和沉淀；6）上清用作蛋白分析，跑SDS-PAGE电泳，WesternBlotting分析，ELISA分析，样品浓缩，纯化分析等六质粒提取（碱裂解）（1）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0),配制200ml。取葡萄糖（C6H12O6.H2O）1.982 g，双蒸去离子水160 ml，0.5 mol/L EDTA 4ml，1mol/L Tri

15、s-HCl(pH8.0) 5 ml，定容至200 ml，高压灭菌后4保存。（2）溶液II：0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。配制100 ml，现用现配。10 mol/L NaOH 2 ml，双蒸去离子水80 ml，10%SDS 10 ml，最后用双蒸去离子水定容至100 ml，室温保存。（3）溶液III：配制100 ml。5 mol/L乙酸钾60 ml，冰乙酸11.5 ml，双蒸去离子水28.5 ml。（4）5 mol/L乙酸钾（200 ml）乙酸钾98.14 g，溶解于160 ml双蒸去离子水中，搅拌溶解后定容至200 ml。（5）3 mol/L乙酸钠（NaAc）（pH5.2)取乙

16、酸钠（CH3COONa.3H2O) 204.1g，溶解于200 ml双蒸去离子水中，用冰乙酸调pH5.2，双蒸去离子水定容至500 ml，高压灭菌后4保存。（6）10 mol/L NaOH溶液（100 ml）NaOH晶体40 g，加水至100 ml。称取SDS 10g，溶解于80 ml水中，68助溶，加数滴1 mol/L HCl调pH7.2,定容至100 ml。（8）0.5 mol/L EDTA（pH8.0)（100 ml）。Na2EDTA.2H2O 18.61 g, H2O 70 ml，边搅拌边加入NaOH固体调节pH，接近pH8.0时才充分溶解，大约需NaOH 2g。最后加水至100 ml

17、。2、质粒的提取（1）吸取1.5毫升菌液至1.5 ml Eppendorf离心管中，3 000 rpm离心3分钟，弃上清液。（2）加上1.5毫升菌液，重复操作（）。（3）用移液器尽可能除去上清液，加入预冷150微升溶液，震荡。（4）加入200微升溶液,缓慢地上下翻转离心管约10次，勿震，混合均匀。室温下放置分钟。（5）加入150微升溶液，上下翻转离心管约10次，混合均匀，冰浴10分钟。，12,000 rpm离心5分钟。（6）用移液器将上清液转移到新的1.5mlEppendorf离心管中，加入倍体积（400微升）异丙醇抽提，12 000 rpm离心分钟。（7）弃上清，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀一次，离心5-10min（8）弃上清，烘干10min。（9）加20微升TE缓冲液（含20ul/ml RNase）溶解DNA沉淀，37半小时，-20保存。1.pPIC9K+pulluGene（histag）GS115（His缺陷筛）G418筛GS115-Pullu酶活性鉴定2.pulluGene分析选择tRNA Genes设计引物以GS115基因组为模板PCRtRNA Genes3.pFLDa+ tRNA GenesGS115-Pullu（zeocin筛）GS115-Pullu-plus酶活鉴定表达量比较