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1、学年人教版选修1 专题2 第6课时 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 学案第6课时土壤中分解尿素的细菌的分离与计数学习导航1.通过分析具体培养基的配方，归纳选择培养基的选择作用，理解筛选微生物的原理。2.结合实验设计，分析微生物数量测定实验中产生偏差的原因及解决措施，学会微生物的计数方法，并对培养结果进行分析和评价。重难点击1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。2.能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数问题。一、研究培养基对微生物的选择作用1.筛选菌株(1)自然界中目的菌株的筛选原理：根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。实例：能产

2、生耐高温的Taq DNA聚合酶的Taq细菌就是从热泉中筛选出来的。(2)实验室中目的菌株的筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。实例：从土壤中筛选能分解尿素的细菌。方法：利用选择培养基进行微生物的筛选。2.选择培养基(1)概念：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。(2)举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以尿素为唯一氮源，按物理性质归类为固体培养基。1.筛选分解尿素的细菌的选择培养基下面是本课题使用的培养基的配方，请分析并回答下列问题：KH2PO41.4 gNa2HPO42.1 gMgSO47

3、H2O0.2 g葡萄糖10.0 g尿素1.0 g琼脂15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL(1)该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？答案碳源是葡萄糖，氮源是尿素。(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？答案该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。(3)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？答案分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供氮源。2.设计对照实验(1)如何设计对照实验验证该选择培养基的确筛选到了能分解尿素的细菌？答案增设牛肉膏蛋白胨基

4、础培养基并进行涂布平板操作，如果牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则说明选择培养基的确起到了筛选能分解尿素的细菌的作用。(2)如何设计对照实验验证所用的选择培养基没有受到污染？答案设置一个未涂布平板的能筛选分解尿素的细菌的选择培养基。归纳总结选择培养基的分类(1)利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养：通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长。(2)利用化学物质进行的选择培养：在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制某些微生物的生长，同时选择所需的微生物。(3)利用培养条件进行的选择培养：改变微生物的培养条件(如高温、特殊pH等)，筛选特定

5、微生物。1.下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是()A.用全营养牛肉膏蛋白胨培养基筛选大肠杆菌B.用高NaCl的培养基筛选抗盐突变菌株C.含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株D.利用高温条件筛选耐热的Taq细菌答案A解析全营养牛肉膏蛋白胨培养基常用于大肠杆菌的培养，该培养基对微生物无选择作用，A项错误；抗盐突变菌株具有耐高盐的能力，因此可以利用高NaCl的选择培养基进行选择培养，B项正确；分解尿素的菌株能将尿素分解成氨，使培养基pH升高，因此可以利用含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株，C项正确；利用高温条件可以筛选耐热的Taq细菌，D项正确。2.下表是微生物培养基的成分。下列有

6、关说法错误的是()编号 成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O含量/g0.44.00.50.5100 mLA.此培养基可用来培养自养型微生物B.此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源C.若除去，此培养基可培养圆褐固氮菌D.培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源和生长因子答案C解析分析题表可知，该培养基成分中含有水、无机盐、氮源，但不含含碳有机物，可用来培养自养型微生物，A、B项正确；圆褐固氮菌同化类型为异养型，培养基中必须存在含碳有机物，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌，C项错误。 方法技巧选择培养基的常见类型(1)分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，

7、因为菌落只能在固体培养基上形成。(2)常见的选择培养基加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。无氮源培养基可以分离固氮微生物。以石油为唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。将培养基放在高温环境中培养，可以分离耐高温的微生物。二、进行微生物数量的测定1.统计菌落数目(1)方法：统计样品中微生物数量的方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。常用来统计活菌数目的方法是稀释涂布平板法。(2)统计依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。(3)操作设置重复组，

8、增强实验的说服力与准确性。为保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。统计的菌落数往往比活菌实际数目低。(4)计算公式：每克样品中的菌株数(CV)M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。2.设置对照(1)对照实验：是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验。(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。例如，为了确认培养基是否被杂菌污染，需以不进行接种的培养基培养作为空白对照。3.实验操作流程(1)土壤取样取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的

9、微生物数量最大，种类最多。土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿。取样部位：距地表约38 cm的土壤层。(2)样品稀释稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间，便于计数。(3)微生物的培养与观察培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。观察a.观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。b.菌落的特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。(4)菌种鉴定原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示

10、剂，培养某种细菌后，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。4.操作提示(1)无菌操作取土样的用具在使用前都需要灭菌。实验操作均应在火焰旁进行。(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前应标明培养基的种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析回答下列问题：1.实验流程试写出分离土壤中分解尿素的细菌的实验流程(用文字和箭头表示)。答案土壤取样样品稀释取样涂布微生物培养观察并记录结果细菌计数。2.统计菌落数目甲、乙两位同

11、学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？答案不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？答案不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。

12、(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。平板稀释度平板1平板2平板3104320360356105212234287106212318答案105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30300之间，计算其平均值为(212234287)/3244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(2440.1)1052.44108个。(4)为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？答案当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。3.对照实验设计的分析分析教材P22“设置对照”中的实例，探讨下列问题：(1)在A同学确定

13、自己操作无误的情况下，A同学得出的菌落数多于其他同学的原因可能有哪两种？答案可能是他选择的土壤样品不同于其他同学；也可能是培养基受到了污染或操作失误。(2)如何设计对照实验帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？答案其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题；将A同学配制的培养基在不加土样的情况下培养作为空白对照，以判断培养基是否受到污染。4.微生物数量测定的实验设计(1)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？答案土壤中各种微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度

14、进行分离。(2)本实验中应如何统计培养基上生长的菌落数？答案每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。(3)实验中的无菌操作主要有哪些？答案培养基、锥形瓶、试管、铲子、信封等，需要进行灭菌。称取土壤要在火焰旁进行。稀释土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁进行。归纳总结分离尿素分解菌操作中的注意事项(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。(2)样品稀释液的最佳浓度为培养后每个平板上有30300个菌落的浓度。细菌一般选104、105、106倍稀释液进行培养，放线菌一般选103、104、105倍稀释液进行培养，真菌一般选102、103、104倍

15、稀释液进行培养。(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。3.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是()A.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数一定恰为5号的10倍B.5号试管的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7108个C.在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与无菌水充分混匀D.某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得

16、到的结果常会比实际活菌数目高答案C4.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：(1)实验步骤制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。为了得到更加准确的结果，应选用_法接种样品。适宜温度下培养。(2)结果分析测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是_。A.一个平板，统计的菌落数是230B.两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240C.三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289D

17、.四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_。用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量_(填“多”或“少”)，因为_。问题导析(1)因为题中操作的目的是对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是稀释涂布平板法。(2)测定活菌数量时，选择的平板越多误差越小，且选择的平板要能形成30300个菌落。(3)所做的多个平板中，如果其中一个平板中菌落的数目明显多于或少于其他几个平板，则说明该平板不符合要求，应重做或舍弃。答

18、案(1)稀释涂布平板(2)D1.06109个多当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落解析(1)若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(2)应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。2120.21061.06109(个)。因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。一题多变(1)如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中测定的数值高还是低？为什么？答案低。因为稀释倍数太低，则大部分菌落是由多个细菌繁殖而成，所以测定的数值要偏低。(2)第(2)问第小题C项中菌落数为400的平板不符合要求，试分析该平板中菌落

19、数目多于其他平板的可能的原因。答案培养基被污染，一些菌落是由杂菌繁殖而成的；接种过程中由于操作不当感染了杂菌；取菌液时没有摇匀，导致所取菌液中细菌个体浓度偏大等。方法技巧用稀释涂布平板法计数微生物的方法(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复的原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30300之间的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。1.选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物

20、中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为()A.伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基B.含青霉素的培养基、含氨的无机培养基C.含氨的无机培养基、含青霉素的培养基D.含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基答案B解析酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素能够抑制细菌生长，但不能够抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。2.下列操作步骤顺序正确的是()土壤取样称取10 g土样，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布依次稀释至1

21、01、102、103、104、105、106、107稀释度A. B.C. D.答案C3.对尿素分解菌进行初步鉴定时，可在培养基中加入()A.重铬酸钾 B.酚红指示剂C.刚果红 D.结晶紫答案B解析对尿素分解菌进行初步鉴定，可在培养基中加入酚红指示剂。4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是()A.将土壤用无菌水稀释，制备103106倍的土壤稀释液B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上C.用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株答案C解析用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌。5.尿素是一种重要的农业肥

22、料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答下列问题：KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素琼脂1.4 g2.1 g0.2 g10.0 g1.0 g15.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。(1)此培养基_(填“能”或“不能”)用于植物组织培养，理由是_。(2)培养基中加入尿素的目的是_，这种培养基属于_培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中

23、的_和_，实验需要振荡培养，原因是_。(4)图中将细菌转到固体培养基上时，可采用_或_在含尿素的培养基上接种，获得单菌落后继续筛选。初步筛选出来的菌种还需要用生化的方法作进一步的鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成_色，则可准确说明该菌种能够分解尿素。(5)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是_，需要消毒的是_(填序号)。培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、锥形瓶和吸管实验操作者的双手(6)实验结束后，使用过的培养基应该进行_处理后，才能倒掉。答案(1)不能缺少植物激素(或缺少植物需要的一些营养成分)(2)筛选目的菌选择(3)尿素葡萄糖为目的

24、菌提供氧气(4)平板划线法稀释涂布平板法酚红红(5)(6)灭菌解析(1)植物组织培养的培养基中需要含有氮、磷、钾及锌、铜、钼、铁等元素，需要蔗糖为植物细胞提供能量，还需要细胞分裂素和生长素等植物激素。(2)该培养基中尿素是唯一的氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长，属于选择培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖，分解尿素的微生物是需氧型微生物，所以在培养过程中需振荡。(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养利用尿素的细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，由此可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。(5)微生物培养时，一切环境、物质、用具、器材都要消毒或

25、灭菌。(6)为避免实验后培养基中的微生物污染环境，使用过的培养基必须经过灭菌处理后才能丢弃。基础过关1.在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或者阻止其他种类微生物生长的培养基称做()A.鉴别培养基 B.加富培养基C.选择培养基 D.基础培养基答案C解析选择培养基可选择目标微生物，同时抑制或杀死其他微生物。2.可以分离并鉴定出分解尿素的细菌的方法是()A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红试剂D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂答案A解析尿素在尿素分解菌的作用下分解产生氨和CO2，氨会

26、使培养基的碱性增强，pH升高，酚红指示剂变红。3.尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制选择培养基时()A.葡萄糖在培养基中越多越好B.尿素分解菌有固氮能力，故培养基中只需无机氮C.尿素在培养基中越少越好D.尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮答案D解析尿素既可以作为尿素分解菌的氮源，也可以作为其碳源，葡萄糖在培养基中并不是越多越好，葡萄糖过多会使培养基的渗透压过高，不利于尿素分解菌的生长繁殖，A错误；尿素分解菌没有固氮能力，故培养基中需要添加尿素作为氮源，B错误；添加尿素的目的是筛选尿素分解菌，其他微生物不能很好地生活在该培养基上，尿素在培养基中不是越少越好，过少就失去选择作用，过多

27、又会使细胞失水死亡，C错误；尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为化合态氮，D正确。4.产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是()A一个细菌、液体培养基 B.许多细菌、液体培养基C.一个细菌、固体培养基 D.许多细菌、固体培养基答案C解析菌落是一个细菌的子细胞群体，在固体培养基上形成，有一定的形态结构，肉眼可见(液体培养基中肉眼不可见)，菌落可作为菌种鉴别的重要依据，而多种细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态。5.下列关于土壤取样的叙述，错误的是()A.土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤B.先铲去表层土，选取距地表38 cm左右的土壤层C.取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌D.应

28、在火焰旁称取土壤答案C解析土壤取样过程中，为防止杂菌污染，取样用的小铁铲和信封在使用前必须灭菌。6.某同学对101、102、103倍稀释液中的细菌进行计数，平均菌落数分别为2 760、295和16，则样品中菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)()A.2.76104个/mL B.2.95105个/mLC.4.6104个/mL D.3.775104个/mL答案B解析为保证结果准确，一般选择菌落数在30300间的平板进行计数，因此只有295符合要求，其稀释倍数为102，所用稀释液体积为0.1 mL，套入计算公式得样品中菌落总数为2.95105个/mL。能力提升7.在“土壤中分解尿素的细菌的分离

29、与计数”课题中，以土壤中的细菌为研究对象，要达到的目的是()从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解氨的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌统计所取土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌A. B.C. D.答案A解析从土壤中分离分解尿素的细菌并对其计数，统计的是每克土壤样品中含多少分解尿素的细菌，用公式“每克样品中菌株数(C/V)M”进行推测，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。8.给无氮培养基接种土壤稀泥浆的正确方法是()A.打开培养皿盖，取一根接种环沾取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上B.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点C.打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许