1、第十二章 微生物制药 第十二章 微生物制药 第一节 抗生素发酵概念 生化领域:以小分子有机物为最终受氢体的生物氧化过程。 广义:用培养生物细胞制得产物的过程,包括生物细胞的培养和产物的合成。 分为:需氧和厌氧发酵;固体发酵和液体发酵;浅层发酵和深层发酵。 目前工业发酵多采用需氧深层液体发酵抗生素发现历史 拮抗现象:两种微生物培养于同一培养基, 一种微生物抑制另一种微生物生长的现象。 发现过程: 1929,Fleming发现青霉素,对葡萄球菌等细菌有抗菌作用。 1940,萃取青霉菌培养液得到青霉素,1941年,临床使用的抗生素产生。 Waksman分离放线菌培养液得到链霉菌等产生的抗生素。 50
2、年代进入抗生素生产高峰期。60年代,半合成抗生素兴起,70年代进入高潮。 自然界已发现10000多种,半合成接近10万种,临床使用的100多种。一、抗生素的概念和分类 (一)概念 抗生素是生物在其生命活动过程中产生,能在低微浓度下选择性抑制或影响他种生物功能的有机化合物。 种类 植物产生的长春花碱、美登素、地衣酸、蒜素等。 动物产生的鱼素也符合抗生素。 抗生素作用:抗菌,抗肿瘤,抗病毒,抑制免疫,杀虫,除草等。(二)医疗用抗生素的特点 1、较大的差异毒力 差异毒力:对微生物或肿瘤细胞的抑制,杀灭作用,与对机体损害的差异。越大,越有临床应用价值。 Eg青霉素抑制细菌细胞壁合成,动物细胞不具细胞壁
3、,差异毒力大。(二)医疗用抗生素的特点 2、生物活性强大而具有选择性 微量抗生素对微生物具有抑制或杀灭作用。 MIC,最低抑菌浓度,能抑制细菌生长所需药物的最低浓度。Ug/ml 不同抗生素作用机制不同,具有一定抗菌谱。分为广谱抗生素和窄谱抗生素。 抗菌谱:抗生素所能抑制或杀灭微生物的范围和所需剂量。 3、不易产生抗药性、毒副作用小、不易引起超敏反应,吸收快,血药浓度高等。(三)抗生素的分类 1、根据抗生素的产生来源分类 (1)细菌产生的约850种,占9%,主要是芽孢杆菌属中多粘芽孢杆菌、枯草杆菌,假单胞菌属的绿脓杆菌和肠道细菌。 大多数是多肽类抗生素,对肾脏毒性较大,多作为局部用药。还分离到其
4、他类新抗生素。 (2)放线菌产生的,4200种,链霉菌产生最多。主要有氨基糖苷类、四环类、大环内酯类、多烯类、放线菌素等。 (3)真菌产生的,1450种,青霉菌属产生的青霉素,头孢菌属产生的头孢菌素。 (4)植物和动物产生的,2800种,地衣酸、蒜素、鱼素等。(三)抗生素的分类 2、根据化学结构分类 (1)B-内酰胺类抗生素,青霉素、头孢菌素 (2)氨基糖苷类,链霉素、卡那霉素 (3)大环内酯类抗生素,红霉素,麦迪霉素 (4)四环类,四环素,金霉素 (5)多肽类,多黏菌素、杆菌肽等。二、抗生素产生菌的分离和筛选 (一)土壤微生物的分离 (二)筛选 (三)早期鉴别 (四)分离精制 (五)临床前试
5、验研究 (六)临床实验(一)土壤微生物的分离 1、采土 注意环境,性质,时间,记录,无菌操作 较干燥、偏碱性、有机物丰富土壤,春秋季。 操作:去植被、表土,取5-10cm深处土壤,装入无菌容器,贴标签。(一)土壤微生物的分离 2、分离放线菌 无菌水稀释或研碎土壤接种多种放线菌培养基(加入抑制真菌生长药物)挑取放线菌菌落斜面纯培养(二)筛选 1、筛选模型 作为检测抗生素生物学活性的试验菌、噬菌体、肿瘤细胞等,非致病菌。 金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌;枯草芽孢杆菌革兰氏阳性杆菌; 耻垢分支杆菌结核分枝杆菌;大肠杆菌-革兰氏阴性菌;白假丝酵母-酵母;曲霉-真菌;噬菌体-病毒(二)筛选 2、筛选方法
6、琼脂扩散法 试验菌平板放上含放线菌的滤纸片或一定大小琼脂块有无抑菌圈(三)早期鉴别 产生菌方面:和进行形态、培养、细菌生化反应等试验,对抗生素产生菌进行初步分类鉴定。 产生的抗生素方面:抗生素进行抗菌谱测定,极性和溶解度的测定,酸碱性等。(四)分离精制 将产生菌扩大发酵培养,选择合适方法提取,精制纯化。(五)临床前试验研究 对动物毒性试验,动物体内治疗试验,药物在动物体内分布、排泄、代谢等试验,摸索剂量,方式,了解不良反应,致突变等。(六)临床实验 将药物应用到人体的试验,效果良好的经药政部门审查批准,才可投入生产和临床使用。三、抗生素的制备 抗生素的制备分为发酵和提取两个阶段 发酵:抗生素产
7、生菌在一定培养条件下生物合成抗生素的过程,包括菌体生长和产物合成不同性质的代谢过程。 提取:将抗生素从发酵培养物中提取出精制,制成抗生素成品。 菌种-孢子制备-种子制备-发酵-发酵液预处理-提取和精制-成品检验-成品包装(一)发酵阶段 1、抗生素发酵特点 (1)需氧发酵,不断通入无菌空气,机械搅拌。 (2)深层发酵,液体深层发酵,大型发酵罐,温度控制冷却设备。 (3)纯种发酵,防止杂菌污染。(一)发酵阶段 2、抗生素发酵一般流程 (1)孢子制备 培养菌种,制备一定数量和质量的孢子,扁茄形瓶,培养基氮源,碳源不宜丰富。 (2)种子制备 使孢子萌发,形成一定数量和质量的菌丝。种子罐,一级、二级、三
8、级发酵,培养基采用玉米浆等易于迅速利用,生长因子丰富的营养物质。 (3)发酵 分为菌体生长阶段、抗生素合成阶段,菌体自溶阶段。 选择合适发酵培养基和培养条件缩短生长阶段,使菌体代谢转入抗生素合成代谢 进入合成阶段,采用加糖、补料等延长合成期,获得高产量。应控制的因素 A 、防止杂菌污染 原因:培养基和设备灭菌不彻底,种子带杂菌,空气过滤系统被污染,发酵设备渗漏,操作不慎等,无菌操作不规范。 B、 营养物质的控制 适当丰富,廉价而来源广泛,满足生长和合成需要。 C 、Ph的控制 不同生长阶段最适ph值不同,加入缓冲物质保持ph相对稳定,如碳酸钙;或补入酸性或碱性物质,调节ph。青霉素发酵过程补充
9、葡萄糖,补充了碳源和调节了ph酸性。应控制的因素 D 、温度的控制 生长和产物合成所需酶不同,最适温度也不同。抗生素生产采用变温发酵,生长最适温度高于合成温度。发酵产热,通过水循环系统降温。 E、 前体的调控作用 前体:直接参与抗生素分子的组成而自身结构无显著变化的物质。控制发酵合成的方向。 青霉素G发酵以苯乙酰作为前体,红霉素发酵以丙醇为前体。应控制的因素 F、 通气、搅拌及消沫 空气通过过滤系统输入无菌空气。搅拌和挡板增加通气效果。 由于发酵液中蛋白质易发泡,搅拌和通气加剧发泡,易导致染菌,添加消泡剂等。 G 、发酵终点的判断 抗生素产量增加不显著,菌体出现自溶;氨基氮含量上升;发酵黏度升
10、高,ph不正常(二)发酵液预处理及提取阶段 1、发酵液预处理 除去重金属离子、蛋白质、菌体,便于提取。 方法:加热使蛋白质变性,加草酸、磷酸等使钙、镁、铁沉淀,过滤离心除去。(二)发酵液预处理及提取阶段 2、提取 (1)溶媒萃取法:抗生素不同ph条件下状态不同,溶解度不同,分子态易溶于有机溶媒,离子态易溶于水。 调节ph将抗生素转至有机溶媒相,或相反方向,浓缩和纯化。 (2)离子交换法:离子交换树脂分离提取,抗生素解离为阳离子或阴离子与交换树脂交换,抗生素吸附,再洗脱,达到分离、浓缩、纯化。 成本低、设备简单、操作方便 (3)沉淀法 利用等点电时与酸、碱、金属盐形成难溶盐,沉淀析出。 (4)吸
11、附法 一定ph,抗生素吸附于吸附剂,再以洗脱剂洗脱。活性炭、氧化铝、硅胶、大网格聚合物四、抗生素的生物合成 (一)次级代谢产物的特点 初级代谢产物:微生物生产繁殖所必需小分子有机物,通过代谢合成多种组分。维生素,氨基酸,嘌呤,嘧啶等。 次级代谢产物:微生物合成,对自身生长、繁殖无显著功能的代谢产物,抗生素,色素等。 1、对微生物自身的生长、繁殖无显著功能四、抗生素的生物合成 (一)次级代谢产物的特点 2、与初级代谢紧密相连 环境营养充足时,初级代谢,生长,繁殖。 营养受限制,次级代谢,抑制某些初级代谢产物合成,避免某些合成受限。 3、一定条件下大量合成 初级代谢产物受反馈调节,次级代谢产物不受
12、反馈调节,能大量合成。(二)抗生素生物合成的代谢途径 1、抗生素合成的基本过程 营养物摄入形成初级代谢物合成抗生素前体修饰、重排各抗生素合成聚合或装配合成抗生素(二)抗生素生物合成的代谢途径 2、生物合成的调节 (1)受产生菌生长速率调节 加糖、补料,延长菌体生长的稳定期,提高发酵产量。 (2)受分解代谢物调节 培养基中能够被产生菌迅速利用的营养物质及分解代谢产物,对其他代谢酶的调节作用。 青霉素“葡萄糖效应”,产生菌迅速利用葡萄糖,分解代谢物抑制青霉素的合成。 (3)合适的初级代谢基础 初级代谢使产生菌迅速生长繁殖,提供菌体量,代谢能量和有机碳骨架。作业 1、抗生素发酵的特点、过程及影响因素
13、。 2、发酵液的处理方法有哪些? 3、抗生素的分类和主要作用。第二节 氨基酸 一、氨基酸的应用 1、食品工业:补充植物缺少的赖氨酸、苏氨酸和色氨酸;调味,鲜味的谷氨酸-钠和天冬氨酸钠,甜味的甘氨酸、丙氨酸、L-天冬氨酸、苯丙氨酸甲酯 2、饲料工业:提高营养价值,添加赖氨酸、蛋氨酸,促进产蛋和生长。 3、医药工业:氨基酸输液,补充蛋白质营养,术后或烧伤病人;复合氨基酸注射液,浓度高、体积小、无热源质与过敏物质,比水解蛋白好。 4、化学工业:谷氨酸制备洗涤剂(十二烷酰基谷氨酸钠肥皂),润肤剂(焦谷氨酸钠)、聚谷氨酸人造革,人造纤维和涂料。 5、农业:制造特殊农药,N-月桂酰-L-异戊氨酸防止稻瘟病
14、,提高稻米蛋白质含量;提高农作物抵抗力,可被分解,无公害。第二节 氨基酸 二、生产方法 1、抽提法:酸水解蛋白质原料,提取氨基酸。半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸 2、直接发酵法:糖和铵盐发酵生产。大多数氨基酸 3、添加中间产物的发酵法:发酵中添加氨基酸前体,防止合成途径中反馈调节;丝氨酸、色氨酸、蛋氨酸等 4、酶法:完整菌体或酶制造。天冬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸等 5、合成法:化学合成生产蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸等。化学合成中间体酶法制造时发展方向。第三节 维生素 一、维生素C 抗坏血酸,参与人体多种代谢过程,使组织产生胶原质,影响毛细血管的渗透性及血浆凝固,刺激造血机能,是必需的营养成分。较强还
15、原性,做为抗氧化剂。 化学合成法、半合成法、发酵法、重组菌一步发酵法等第三节 维生素 二、维生素B2 核黄素,与蛋白质结合,称核黄素蛋白。是动物发育和许多微生物生长的必需营养因子,治疗眼角膜炎、白内障、结膜炎等炎症的重要药物。 合成:细菌、酵母和霉菌。 主要方法是发酵法,主要存在菌丝里。第三节 维生素 三、维生素B12 钴维素,参与机体许多代谢反应,维持机体生长的重要因子,治疗儿童恶性贫血。 生产:从动物肝脏提取、化学合成。工业主要用微生物生产,细菌和放线菌。方法:从链霉素、庆大霉素发酵废菌体中提取,用丙酸杆菌直接发酵生产。第四节 甾体化合物 多种激素的成分:胆甾醇、胆酸、肾上腺皮质激素、孕激
16、素、性激素等。 作用:调节作用。肾上腺皮质激素抗炎症、抗超敏反应、抗休克等,用于治疗或缓解类风湿关节炎、支气管哮喘、过敏性皮炎、胶原性疾病、过敏性休克、阿迪森病等。性激素治疗性病、口服避孕药等。蛋白质同化激素用于改善蛋白代谢、恢复和增强体力,利尿降压等。 工业生产以天然甾体化合物为原料,化学合成为主。第五节 酶与酶抑制剂 一、医药领域常用酶制剂 1、链激酶和链道酶,乙型溶血性链球菌产生,治疗脑血栓,溶解血凝块;链道酶降低脓液黏度,治疗脓胸。 2、透明质酸酶,存在动物毒液中,化脓性链球菌、产气荚膜梭菌等。与注射剂同时用,加速药物扩散,有利吸收,使肿胀与血肿消退,减轻痛苦。 3、天冬酰胺酶,许多细
17、菌可产生,目前用大肠杆菌生产。水解天冬酰胺,抑制肿瘤细胞生长,治疗白血病和某些肿瘤。 4、消化酶,微生物产生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等,治疗消化不良。 5、青霉素酰化酶,半合成青霉素的生产中有重要作用。第五节 酶与酶抑制剂 二、酶抑制剂 微生物产生的一类小分子生理活性物质,特异性抑制某些酶的活性。来源于微生物的酶抑制剂,低毒性、分子量小、结构新而多样,是研究生物功能和疾病过程的工具,用于增强免疫、生理功能调节、疾病治疗、治疗抗药菌感染等。 采用与抗生素筛选类似的方法。酶抑制剂 1、蛋白酶抑制剂 与炎症、受精、癌症、免疫及肌肉萎缩等有关,用于治疗急性胰腺炎、烧伤、胃溃疡、肌肉萎缩等,还能提高免疫力
18、,抑制肿瘤。 2、细胞膜表面酶抑制剂 与免疫功能、炎症反应、肿瘤发生、病毒感染等有密切关系。酶抑制剂 3、糖苷酶及淀粉酶抑制剂 炎症、癌症、免疫现象、病毒感染等于糖质有密切关系。淀粉酶抑制剂通过妨碍食物中消化作用,治疗和防止肥胖症、动脉硬化症、高血压、糖尿病等。 4、肾上腺素合成酶抑制剂 降血压药物 5、-内酰胺酶抑制剂 治疗产生-内酰胺酶的抗药菌感染。第六节 菌体制剂 一、药用酵母 高温干燥灭活酵母菌,含丰富营养物质,蛋白质、氨基酸、维生素,辅酶A、细胞色素C等,促进身体机体代谢、增进食欲,治疗消化不良和B族维生素缺乏症。 酒精或啤酒发酵后的废酵母加碳酸钠去苦味制得,也可直接发酵。第六节 菌
19、体制剂 二、活菌制剂 防治某些疾病和提高人体健康水平。 乳酸菌制剂,在肠道生长繁殖,分解糖类产生乳酸使肠道环境变酸,防止有害细菌繁殖,防止产生毒素和致病;发酵产生二氧化碳促进蠕动,调节肠功能防止便秘,治疗消化不良、胀气、小儿腹泻等;合成B族维生素,治疗菌群失调引起的维生素B缺乏症;防止菌群失调,维持微生态平衡。 乳酸菌和双歧杆菌具抗癌和延缓衰老的作用,厌氧棒杆菌能激发机体细胞免疫。 蜡样芽孢杆菌,消耗氧气,促进厌氧菌生长,抑制需氧菌生长,预防和治疗幼儿腹泻、肠炎、痢疾等。第七节 其他微生物制剂 一、核酸类物质 嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸及衍生物在治疗心血管疾病、肿瘤方面有特殊疗效。肌苷或辅酶A治疗
20、心脏病、白血病和血小板下降及肝病;ATP治疗代谢紊乱、辅助心脏病、肝病治疗。 农业方面,提高产量;食品工业方面,作为特鲜味精、酱油原料。 生产方法:酶解法、半合成法和直接发酵法第七节 其他微生物制剂 二、生物碱 主要由植物产生,某些微生物。 紫麦角菌生产麦角碱,主要用作子宫收缩剂;诺卡菌产生安沙美登素治疗白血病第七节 其他微生物制剂 三、微生物多糖 食品、医药、石油、化学工业有巨大应用潜力。 医药领域:右旋糖苷,代血浆主要成分,维持血液渗透压和增加血液容量作用,用于抗休克、消毒和解毒等,治疗动脉硬化。 环状糊精,药物稳定剂,提高药效、减缓药物毒性和副作用。 真菌多糖,灵芝、茯苓、猴头、银耳、香菇和冬虫夏草等,增强机体免疫、抗肿瘤作用。第七节 其他微生物制剂 四、螺旋藻 蛋白质含量达干重60-80%,含八种人体必需氨基酸,补充蛋白质营养;含多糖、不饱和脂肪酸、多种维生素、酶类、矿物质等。 海藻多糖能激活免疫受体,提高免疫功能,在癌症的辅助治疗中,具有安全性高、毒副作用小、抑瘤效果好等优点。
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