仪器分析课程设计.docx

1、仪器分析课程设计环境与土木工程学院学生课程设计论文（2008级）题目名称 高效液相色谱 专业名称 环境工程 课程名称 仪器分析 指导教师 罗丽 学生姓名 杨丹妮 学生学号 200803020315 高效液相色谱作者:杨丹妮 专业：环境监测与治理班级：2008030203 指导教师：罗丽摘要高效液相色谱法又称“高压液相色谱”“高速液相色谱”“高分离度液相色谱” “近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统。高效液相色谱用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在

2、柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。这种方法已成为化学、生化、医学、工业、农业、环保、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术，是分析化学、生物化学和环境化学工作者手中必不可少的工具。关键词： 液相色谱 高效液相色谱 色谱法 流动相High-performance liquid chromatographyAbstract： High-performance liquid chromatography, also known as high-pressure liquid chromatography, high-speed liquid chromatograp

3、hy, high-resolution liquid chromatography, Modern chromatography and so on. HPLC chromatography is an important branch of the liquid as the mobile phase, high pressure infusion system. High-performance liquid chromatography with high-pressure infusion pump with a single solvent or a different polari

4、ty, different combinations of solvents, buffers and other mobile phase pumped into the column with the stationary phase, the injection valve into the sample, the mobile phase into the column, the column the components are separated, turn into the detector for testing, in order to achieve sample anal

5、ysis. This approach has become the chemistry, biochemistry, medicine, industry, agriculture, environmental protection, inspection and seizure law in important subject areas such as separation and analysis technology, analytical chemistry, biochemistry and environmental chemistry indispensable tool i

6、n the hands of workers.Key words： Liquid chromatography HPLC Chromatography Mobile phase目录目录 I第一章 概述 11.1高效液相色谱的发展历史 11.2高效液相色谱特点 21.3高效液相色谱的基本概念和术语 3第二章 高效液相色谱基本理论 62.1高效液相色谱的分类 62.2流程与结构组成 72.2.1流程 72.2.2结构组成 82.3使用方法 92.3.1综述 92.3.2色谱柱的理论板数 92.3.3分离度 92.3.4拖尾因子 102.4 测定方法 102.4.1面积归一化法 102.4.2主成分

7、自身对照法 102.4.3内标法 112.4.4外标法 112.5设备选型 122.5.1综述 122.5.2相对分子质量 122.5.3溶解度 132.5.4化学结构 13第三章 高效液相色谱仪 133.1高压泵 143.2梯度洗提 143.3进样装置 153.4色谱柱 153.5检测器 15第四章 高效液相色谱仪操作注意事项 164.1操作注意事项 164.1.1流动相 164.1.2样品 164.1.3色谱柱 174.2操作过程 17第五章 高效液相色谱的应用 185.1色谱技术的联用 185.2高压液相色谱法的应用举例 195.2.1在食品分析中的应用 195.2.2在环境污染分析中的

8、应用 205.2.3其它方面的应用 21总结 22致谢 22参考文献 22第一章 概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在中国药典中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。高效液

9、相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

10、1.1高效液相色谱的发展历史色谱法最早是由俄国植物学家茨维特在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引

11、起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。1906年俄国植物化学家茨维特首次提出“色谱法”和“色谱图”的概念。他在论文中写到： “植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，就象光谱一样，称之为色谱图。”1930年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技

12、术。1952年，英国学者Martin和Synge 基于他们在分配色谱方面的研究工作，提出了关于气液分配色谱的比较完整的理论和方法，把色谱技术向前推进了一大步，这是气相色谱在此后的十多年间发展十分迅速的原因。1958年，基于Moore和Stein的工作，离子交换色谱的仪器化导致了氨基酸分析仪的出现，这是近代液相色谱的一个重要尝试，但分离效率尚不理想。1960年中后期，气相色谱理论和实践的发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC。1970年中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精

13、度。1990年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类基因组计划，蛋白质组学有HPLC作预分离等。1.2高效液相色谱特点高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏

14、塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数量。应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流

15、型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。1.3高效液相色谱的基本概念和术语1色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相

16、及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)。前者少见。拖尾因子(tailing factor，T)用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。峰底基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peak height，h)峰的最高点至峰底的距离。峰宽（peak width，W)

17、峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W4半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)峰高一半处的峰宽。Wh/22.355标准偏差（standard deviation，)正态分布曲线x1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。峰面积(peak area，A)峰与峰底所包围的面积。Ah2.507h1.064 Wh/2h2定性参数（保留值）死时间(dead time，t0)不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱

18、的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积(dead volume，V0)由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0Ft0（F为流速）保留时间(retention time，tR)从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。保留体积(retention volume，VR)从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VRFtR调整保

19、留时间(adjusted retention time，tR)扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR只决定于组分的性质，因此，tR（或tR）可用于定性。tRtRt03柱效参数理论塔板数(theoretical plate number，N)用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐

20、渐降低。用半峰宽计算理论塔数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）理论塔板高度(theoretical plate height，H)每单位柱长的方差。4相平衡参数分配系数(distribution coefficient，K)在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸

21、附系数，离子交换色谱法为选择性系数(或称交换系数)，凝胶色谱法为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。在条件(流动相、固定相、温度和压力等)一定，样品浓度很低时(Cs、Cm很小)时，K只取决于组分的性质，而与浓度无关。这只是理想状态下的色谱条件，在这种条件下，得到的色谱峰为正常峰；在许多情况下，随着浓度的增大，K减小，这时色谱峰为拖尾峰；而有时随着溶质浓度增大，K也增大，这时色谱峰为前延峰。因此，只有尽可能减少进样量，使组分在柱内浓度降低，K恒定时，才能获得正常峰。在同一色谱条件下，样品中K值大的组分在固定相中滞留时间长，后流出色谱柱；K值小的组分则滞留时间短，先流出色谱柱。混合物中各组分的

22、分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各组分的分配系数不同是色谱分离的前提。在HPLC中，固定相确定后，K主要受流动相的性质影响。实践中主要靠调整流动相的组成配比及pH值，以获得组分间的分配系数差异及适宜的保留时间，达到分离的目的。容量因子(capacity factor，k)化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。选择性因子(selectivity factor，)相邻两组分的分配系数或容量因子之比。要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异

23、，即分子间相互作用力的差异。5分离参数分离度(resolution，R)相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R。当W1W2时，R。当R1时，称为4分离，两峰基本分离，裸露峰面积为95.4%，内侧峰基重叠约2%。R1.5时，称为6分离，裸露峰面积为99.7%。R1.5称为完全分离。从基本分离方程可看出，提高分离度有三种途径：增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加选择性。当1时，R0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值；b. 改变

24、柱温；c. 改变固定相。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在110范围内，最好为25，窄径柱可更小些。第二章 高效液相色谱基本理论2.1高效液相色谱的分类根据分离原理的不同，可分为：（一）液液分配色谱法流动相和固定相都是液体。试样溶于流动相后，在色谱柱内经过分界面进入固定液（固定相）中，由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。跟气一液分配色谱有相似之处：分离顺序决定于分配系数的大小

25、，分配系数大的组分保留值大。分配系数为溶质在固定相和流动相中的浓度之比。但是气相色谱法中流动相的性质对分配系数影响大小，而液相色谱中流动相的种类对分配系数却有较大的影响。（二）吸附色谱法流动相为液体，固定相为吸附剂。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。溶质分子被固定相吸附，将取代固定相表面上的溶剂分子。如果溶剂分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子将相应地减少。吸附性大的溶质就会最后流出。液一固色谱适用于分离相对分子质量中等的油溶性样品，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。凡能用薄层色谱成功地进行分离的化合物，亦可用液一固色谱进行分离。缺点是由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象。（

26、三）离子交换色谱法离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的一种方法。离子交换色谱主要用来分离离子或可离解的化合物，它不仅用于无机离子的分离，例如稀土化合物及各种裂变产物，还用于有机物的分离。20世纪60年代前后，已成功地分离了氨基酸、 核酸、蛋白质等，在生物化学领域得到了广泛的应用。四）离子对色谱法离子对色谱法是将一种（或多种）与溶剂分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。离子对色谱，特别是反相离子对色谱解决

27、了以往难分离混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子和非离子的混合物，特别对一些生化样品如核酸、核苷、儿茶酚胺、生物碱以及药物等的分离。另外还可以借助离子对的生成给样品引入紫外吸收或发荧光的基团，以提高检测的灵敏度。（五）离子色谱法离子色谱是目前唯一能获得快速、灵敏、准确和多组分分析效果的方法，因而受广泛重视并得到迅速的发展。检测手段已扩展到电导检测器之外的其它类型的检测器，如电化学检测器，紫外光度检测器等。可分析的离子正在增多，从无机和有机阴离子至金属阳离子，从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用离子色谱法进行分析。（六）空间排阻色谱空间排阻色谱以凝胶为固定相，它的分离机理与其它色谱完全不同。它类似于

28、分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积或分子大小有关。2.2流程与结构组成2.2.1流程流程流程：如上图所示，溶剂贮器（1）中的流动相被泵（2）吸入，经3梯度控制器按一写的梯度进行混后然后输出，经（4）测其压力和流量，导入（5进样阀（器）经（6）保护柱、（7）分离柱后到（8）检测器检测，由（10）数据处理设备处理数据或（11）记录仪记录色谱图，（12）馏分收集器收集馏分，（13）为废液。 2.2.2结构组成高效液相色谱仪可分为以下几个部分：1.高压输液泵

29、：（1）功能：驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统；（2）性能要求：流量稳定（1 ），耐高压（3060Mpa），耐各种流动相：例如：有机溶剂、水和缓冲液；（3）种类：往复泵和隔膜泵。2.色谱柱（1）功能：分离样品中的各个物质；（2）尺寸：1030cm长，25mm内经的内壁抛光的不锈钢管柱；（3）填料粒度：510m，高效微粒固定相；3.进样器（1）功能：将待分析样品引入色谱系统；（2）种类：注射器，10Mpa以下，110l微量注射器进样；停流进样；阀进样，常用、较理想、体积可变，可固定；自动进样器，有利于重复操作，实现自动化。4.检测器（1）功能：将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或

30、电学信号；（2）分类：示差折光化学检测器紫外吸收检测器 紫外一可同分光光度检测器二极管阵列紫外检测器荧光检测器电化学检测器5.馏分收集器（1）功能：如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析，而是为了做其它波谱鉴定，或获取少量试验样品的小型制备，馏分收集是必要的；（2）方法：手工，少数几个馏分，手续麻烦，易出差错。馏分收集器收集，比较理想，微机控制操作准确。6.数据获取和处理系统功能：把检测器检测到的信号显示出来。2.3使用方法2.3.1综述色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定.常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基键合硅胶次之,氰基或氨基键合

31、硅胶也有使用；离子交换填料,用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等，用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时,所用流动相应符合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。 1.正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变,以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2.系统适用性试验。按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。 2.3.2色谱柱的理论板数在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间t(R)和半高峰宽W(h/2)，按n5.54t(R)W(h/2)2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的