久泻灵冲剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠病变氧化损伤的影响参考模板.docx

1、久泻灵冲剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠病变氧化损伤的影响参考模板久泻灵冲剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠病变氧化损伤的影响 作者：李海龙,吴玉泓,楚惠媛,车敏,安方玉,王宏伟【摘要】 目的 观察久泻灵冲剂对溃疡性结肠炎模型大鼠的影响,探讨其作用机制。方法 采用异种异体结肠黏膜组织致敏法和乙酸局部灌肠相结合的方法制造动物模型。将Wistar大鼠随机分为空白对照组、模型组、阳性对照组及久泻灵冲剂大、中、小剂量组。连续给药14 d,末次给药后24 h处死大鼠,制备结肠组织匀浆,生化法检测结肠组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、总一氧化氮合酶(tN

2、OS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的水平。结果 久泻灵冲剂可明显降低结肠组织中NO、tNOS、iNOS和MDA的活性或水平,提高GSH-Px、SOD的活性。结论 久泻灵冲剂对溃疡性结肠炎模型大鼠有显著的干预作用,其机制可能与抗氧自由基损伤,抑制NO、tNOS和iNOS生成,增强抗氧化酶活性有关。 【关键词】 久泻灵冲剂；溃疡性结肠炎；谷胱甘肽过氧化物酶；丙二醛；超氧化物歧化酶；一氧化氮；一氧化氮合酶；大鼠 Abstract：Objective To observe the effects of Jiuxieling granules on rats with ulcerative coli

3、tis and explore its mechanism. Methods Ulcerative colitis models were established by immune method combined with local stimulation of 5% acetic acid. Wistar rats were randomly divided into control, model, positive control and low, middle, high dose Jiuxieling granules group. Rats in positive control

4、 group were treated with sulfasalazine, and those in three treatment groups were treated with low, middle and high dosage of Jiuxieling granules respectively for 14 days continuously. 24 hours after last administration, the rats were killed to obtain colon mucous membrane to test GSH-Px, SOD, MDA, N

5、O, tNOS and iNOS concentration of the homogenate of colon mucous membrane. Results Jiuxieling granules could markedly improve the levels of GSH-Px and SOD activity, whereas decrease the levels of MDA, NO, TNOS and iNOS. Conclusion Jiuxieling granules exert its marked curative effects on rats of ulce

6、rative colonitis by resisting oxygen free radical lesion, inhibiting the generation of NO and NOS, and enhancing the activity of antioxidase. Key words：Jiuxieling granules；ulcerative colitis；GSH-Px；MDA；SOD；NO；NOS；rat溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是以腹泻、黏液脓血便、腹痛为主要临床症状,以结肠黏膜慢性炎症和溃疡形成为病理特点的一种慢性炎症性肠病。该病治愈

7、难度大,且愈后又常易复发。近年来发现自由基的产生及脂质过氧化物反应增强与UC损伤的病理改变关系密切1。本研究通过观察UC急慢性病变复合模型大鼠结肠组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、总一氧化氮合酶(tNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的变化及久泻灵冲剂对其的影响,旨在进一步了解其治疗UC的作用机制,为临床用药奠定实验基础。1 材料与方法1.1 动物及分组 SPF级Wistar大鼠60只,雌雄各半,体重(18020)g,甘肃中医学院医学实验中心提供,动物合格证号：医动字FCXK(甘)2004-2006。实验动物按随机数

8、字表法分为空白对照组、模型组、阳性对照组及久泻灵大、中、小剂量组,每组10只。1.2 药物及试剂 处方组成：黄连15 g,法半夏10 g,干姜10 g,补骨脂15 g,肉豆蔻15 g,炒白术15 g,党参18 g,诃子肉10 g。饮片均购自甘肃同济医药公司,由甘肃中医学院中药鉴定教研室鉴定,临洮众友制药厂做成冲剂。每克冲剂含相当于原药材1.42 g。醋酸,由天津市凯通化学试剂有限公司提供；所有检测试剂盒均由南京建成公司提供。1.3 造模 参考文献2-3制作动物模型,取5只家兔的新鲜结肠之黏膜层,制成黏膜匀浆,冷冻24 h,融冻后以3 000 r/min离心30 min,取上清液提纯用考马斯亮蓝

9、测定蛋白质含量,冰箱保存备用。使用时加入完全福氏佐剂,模型组和久泻灵大、中、小剂量组于第1、14、21、28日分别于足跖内注射抗原2 mg(末次注射不加佐剂)。并用醋酸诱导结肠急性溃疡,于第21、28日用25%乌拉坦4 mL/kg麻醉大鼠后,用特制包有圆头的软针头插入大鼠肛门内约8 cm处结肠内,注入5%醋酸1 mL。空白组大鼠相同时间于足跖内、肛门内约10 cm处结肠内注入等量生理盐水。1.4 给药 造模结束后,久泻灵冲剂大(13.5 g/kg)、中(6.75 g/kg)、小剂量(3.375 g/kg)组配置成不同浓度的溶液,分别按2 mL/次, 2次/d灌胃；阳性对照组予柳氮磺胺吡啶(SA

10、SP,0.2 g/kg), 2 mL/次,2次/d灌胃；空白对照组与模型组每日给予生理盐水2 mL/次,2次/d。各组连续灌胃2周。1.5 结肠组织标本制备及指标检测 断头处死大鼠,低温条件下快速取结肠组织,以冰冷的生理盐水冲洗,滤纸吸干,称重后用眼科小剪刀尽快剪碎,置于匀浆器中,用9倍生理盐水匀浆(匀浆器的末端置于放冰块的冷水中),后以3 500 r/min离心10 min,取上清液置4 冰箱保存。结肠组织GSH-Px、SOD、MDA、NO、NOS由甘肃中医学院医学基础实验教学中心生化实验室检测,组织蛋白浓度通过考马斯亮蓝法测定,具体操作严格按说明书进行。1.6 统计学方法 应用SPSS11

11、.5软件处理数据,实验数据以xs表示,统计方法采用方差分析检验,组间比较在方差齐时采用LSD法,方差不齐采时采用Dennett T3法,P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 一般情况 正常组大鼠活泼好动,体重持续增长,大便正常。其他各组大鼠造模后均出现弓背蜷卧、懒动厌食,体重普遍下降。模型组大鼠稀便或半稀便,部分潜血阳性或肉眼黏液脓血便,多有肛周体毛沾染痕迹,且多数稀便持续到实验结束。与模型组比较,久泻灵大、中剂量以及阳性对照组组则随着治疗的延续,大鼠症状均有不同程度的改善,摄食量普遍增加,体重恢复较快,大便成形也较早。2.2 久泻灵冲剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织匀浆中谷胱甘肽过氧化物

12、酶、丙二醛、超氧化物歧化酶、一氧化氮、一氧化氮合酶含量的影响(见表1)表1 UC大鼠结肠组织匀浆中GSH-Px、SOD、MDA、NO、tNOS、iNOS含量变化(略)注：与正常对照组比较,P0.05,P0.01,P0.005；与模型组比较,P0.05,P0.01,P0.0053 讨论 GSH-Px的作用是催化还原型谷胱甘肽生成氧化型谷胱甘肽,并能使有害的过氧化物还原为无害的羟基化合物,从而保护细胞膜结构和功能免受过氧化氢的氧化损伤,因此GSH-Px活性的变化也可反映机体抗氧化能力。而脂质过氧化反应的中间产物MDA间接反映机体内细胞损伤的轻重和脂质过氧化的程度。SOD能抑制脂质过氧化反应,清除超

13、氧阴离子,保护细胞免受损伤,其活性的高低常间接反映了机体清除自由基的能力。 UC患者血清中NO水平明显增高,并与UC的病情呈一致的改变。NO参与了UC发生过程中的炎症和组织损伤,对UC活动期患者的结肠黏膜作还原型辅酶(NADPH)检测发现：黏膜隐窝中NADPH依赖性黄递酶(NADPH-diaphoresis, Nd)染色增多,表明在UC中有NOS存在,而在结肠黏膜层主要以iNOS为主4。由于结肠固有肌层中存在iNOS,UC患者合并有细菌的病原体的感染,产生大量内毒素,使iNOS活性增强；另外,炎性细胞因子亦可使iNOS活性增强,进而导致NO升高。本研究显示：与空白对照组比较,模型组大鼠结肠组织

14、MDA含量升高(P0.01),SOD、GSH-Px计数水平显著降低(P0.01,P0.05),NO、TNOS及iNOS含量升高(P0.001),说明急慢性病变复合模型造模成功。与模型组比较,久泻灵冲剂大、中剂量组SOD、GSH-Px计数水平显著升高,组织MDA含量显著下降,说明久泻灵冲剂通过提高SOD、GSH-Px酶活性,清除MDA,有效地减少代谢产物的堆积,提高机体清除自由基的能力,并阻断自由基连锁反应,从而减轻因脂质过氧化物所导致的结肠组织损伤。与模型组比较,久泻灵冲剂大、中剂量组NO、tNOS和iNOS水平均有下降,尤以久泻灵冲剂大剂量组作用明显。说明其可通过改变NO、tNOS及iNOS

15、含量,调节结肠黏膜血流、胃肠道分泌和运动,修复胃肠黏膜屏障,减少黏膜炎性细胞浸润,促进溃疡愈合。 自由基、活性氧主要是通过中性粒细胞“呼吸爆发”的形式产生的,大量的自由基可以引起膜脂质过氧化反应增强,破坏生物膜的结构和功能,形成一系列脂质自由基及其降解产物MDA,同时影响酶的活性,使SOD和GSH-Px等降解自由基的酶活性降低,相关酶活性的降低同时又不能有效降解已产生的大量自由基,形成恶性循环,加重组织损伤。NO氧化破坏细胞的结构和功能,加剧和扩大结肠黏膜炎症及免疫损伤。活动性结肠炎iNOS的活性明显增高,NOS抑制剂可明显改善结肠损伤的程度和范围,抑制iNOS产生NO可能是治疗UC的主要靶点

16、之一5-6。 久泻灵冲剂具有调理阴阳、燮理虚实、补肾温肠、燥湿止泻的功能,全方体现攻涩兼施、辛开苦降、寒热并投、升降协调四大特点。方中黄连、炒白术和党参有免疫调节作用；黄连、法半夏、干姜及补骨脂有抗炎和抗溃疡的作用。本实验结果表明,久泻灵冲剂通过升高SOD、GSH-Px的活性,提高机体抗自由基损伤的能力,清除MDA,降低NO、tNOS和iNOS的水平,对复合模型大鼠UC损伤有明显的保护作用。【参考文献】 1 黄 俊,罗和生,李 颖.大鼠实验性溃疡性结肠炎中NO、MDA、SOD的变化J.医学文选,2001,20(6)：757759.2 徐淑云.药理实验方法学M.第3版.北京：人民卫生出版社,2002.1335.3 杨孝来,吴勇杰,葛 斌.大鼠乙酸性结肠炎模型的实验研究J.兰州大