血清清蛋白γ球蛋白的分离纯化与鉴定实验报告.docx

1、血清清蛋白球蛋白的分离纯化与鉴定实验报告南方医科大学生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称血清清蛋白、-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验日期 实验地点 合作者 指导老师 评分XX教师签名李某某批改日期2013-06-03格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。1、实验目的1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。3、了解柱层析技术

2、。2、实验原理1、粗提（盐析法）： 蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。2、脱盐（凝胶层析法）凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的

3、蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。3、纯化（离子交换层析法）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的

4、pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和-球蛋白分离出来。4、纯度鉴定（电泳） 采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和-球蛋白进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和-球蛋白的纯度。三、材料与方法：以流程图示意材料：1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生）2、试剂：0.3mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、饱和硫酸铵溶液、0.9

5、2mol/L（20%）磺基水杨酸、0.05mol/L（1%）BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪。粗提脱盐纯化纯度鉴定（盐析法）（凝胶层析法）（离子交换层析法）（电泳）方法：继续用2ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗涤收集含有蛋白质的峰液12dBaCl2检测SO42-阴性用23ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液再生平衡继续用2ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗涤用23ml 0.0

6、2mol/L NH4Ac缓冲液再生平衡BaCl2检测SO42-阴性收集含有蛋白质的峰液12d离 子 交 换 柱 层 纯 化漂洗电泳准备将氨基黑染色液倒入培养皿中，用镊子取出薄膜浸入染液中，染色5min。过DEAE-纤维素层析柱（1.06cm）过DEAE-纤维素层析柱（1.06cm）收集含有清蛋白的洗脱液每管10d，连续收集2管磺基水杨酸检测蛋白质用0.3mol/L NH4AC缓冲液(约3ml)洗脱，流出液量约2ml开始检测蛋白质收集含有蛋白质的洗脱液每管10d，连续收集3管磺基水杨酸检测蛋白质四、结果与讨论：结果：实验数据、现象、图谱；讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。结果：1、粗提（

7、盐析法）:如图1所示，往血清中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液后，溶液变浑浊，呈乳白色。离心后，溶液分为上层的上清液和下层沉淀，上清液呈浅黄色（见图3），沉淀为白色。如图2所示，使用移液枪吸取上清液，从而分离上清液和沉淀。沉淀加水后溶解，为无色溶液（见图4）。 图1 血清加饱和硫酸铵溶液 图2 分离上清液和沉淀 图3 上清液 图4 沉淀加水后溶解2、脱盐（凝胶层析法）和纯化（离子交换柱层析鉴定）：如图5所示，往层析柱中加样前，应先将层析柱中的上层液放出，用小烧杯接废液，直至下液面离柱床约0.5cm。与葡聚糖凝胶G-25层析柱相对比，DEAE-纤维素层析柱的液体流出速度更缓慢。如图6所示，往磺基水杨酸和B

8、aCl2溶液中分别滴入流出液，生成白色沉淀，说明流出液中含有蛋白质。白色沉淀越多，说明液体所含的蛋白质越多，以此选取浓度最高的1管球蛋白进行醋酸纤维素薄膜电泳。 图5 DEAE-纤维素层析柱 图6 磺基水杨酸和BaCl2检测蛋白质呈阳性 （红色圆圈为磺基水杨酸，蓝色圆圈为BaCl2溶液） 4、纯度鉴定（电泳）：如图7所示将醋酸纤维素薄膜架于电泳槽上，进行电泳。如图8所示，染色后，薄膜上可见5条深蓝色横纹。 图7 直流稳压电泳仪 图8 血清清蛋白、-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱讨论：1、操作失误：1）在进行球蛋白的除盐时，我们倒入球蛋白溶液后没有打开夹子让其进入凝胶柱，而是接着倒入了1ml 0.02

9、mol/L NH4Ac缓冲液，导致球蛋白被稀释。2）血清中各组分分离结果不佳，可能是点样过多。3）电泳图谱不整齐，可能是点样不均匀，或电泳时薄膜未放正。2、注意事项：1）使用移液枪吸取上清液时，应注意从大往小调节吸取体积，小心吸取，避免吸取沉淀物。2）使用层析柱时，注意不要让液面低于凝胶床/纤维素床表面，以免空气进入凝胶床/纤维素床。3）往层析柱加液体时，注意不要将凝胶粒/纤维素粒冲起，破坏凝胶床/纤维素床表面的平整。4）往层析柱加不同液体时，应先让上一种液体进入柱床后再添加另一种液体，否则样品会被稀释，缓冲液等液体会失去其该有的作用。5）流出一定量液体时，要及时用磺基水杨酸和BaCl2检验流

10、出液是否含有蛋白质，以免蛋白质流失过多。6）点样线应窄于薄膜宽度，以免发生边缘效应。7）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能太干，否则样品不易进入薄膜的网孔，导致电泳起始点参差不齐，影响分离效果。8）点样线应窄而均匀，否则电泳图谱会不整齐。9）点样时应做好标记，以免弄混。标记要明显，以免染色漂洗后标记模糊消失。3、讨论题：1）硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵? 在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，-球蛋白沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。但硫酸铵会水解呈酸性，如果

11、浓度大的话酸性也很强，可能使蛋白质变性。若将血清加入饱和硫酸铵，会使部分血清蛋白变性。所以要将硫酸铵慢慢加入血清，边滴加边摇匀。2）为什么实验中DEAE纤维素柱分离-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白? DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。-球蛋白带正电荷，不与DEAE结合，会从层析柱中首先洗脱出来，所以可直接用于纯化清蛋白。3）应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么? 正常人血清蛋白经醋酸纤维素薄膜电泳后可获得5

12、条区带。-球蛋白的等电点约为7.3，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，在电场中比其它蛋白质移动速度慢。而清蛋白等其它蛋白质的等电点均小于7.3，在电场中比-球蛋白移动速度快。其中清蛋白等电点为4.88，带负电荷最多，速度最快。且清蛋白在血清中含量最多。所以离点样线最近的是-球蛋白，离点样线最远的最粗的线是清蛋白。血清的电泳图谱上，从正极端开始分别为清蛋白、1-球蛋白、2-球蛋白、-球蛋白和-球蛋白。对比血清的电泳图谱与样品的电泳图谱上区带的位置，可知样品中含有哪种蛋白。 经纯化后的清蛋白和-球蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳图谱上，若仅在清蛋白和-球蛋白位置上出现区带，说明纯度高；若在其它蛋白位置上出现区带，说明纯度低，含有杂蛋白。