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1、细胞笔记第一章 绪论细胞生物学从显微水平、超微水平和分子水平等不同层次研究细胞结构、功能及生活史。细胞生物学由细胞学Cytology发展而来，Cytology是指对细胞形态（特别是染色体形态）的观察。在我国的基础学科发展规划中，细胞生物学与分子生物学，神经生物学和生态学并列为生命科学的四大基础学科。 第一章 绪论本章内容提要:第一节 细胞生物学研究的内容与现状一、 细胞生物学是现代生命科学的重要基础学科二、细胞生物学的主要研究内容三、当前细胞生物学研究的总趋势与重点领域第二节 细胞学与细胞生物学发展简史附录 细胞生物学参考书:第一节 细胞生物学研究的内容与现状一、 细胞生物学是现代生命科学的重

2、要基础学科 生命体是多层次、非线性、多侧面的复杂结构体系，而细胞是生命体的结构与生命活动的基本单位，有了细胞才有完整的生命活动。 细胞生物学 是研究细胞基本生命活动规律的科学，它是在不同层次（显微、亚显微与分子水平）上以研究细胞结构与功能、细胞增殖、分化、衰老与凋亡、细 胞信号传递、真核细胞基因表达与调控、细胞起源与进化等为主要内容。核心问题是将遗传与发育在细胞水平上结合起来。二、细胞生物学的主要研究内容1、细胞核、染色体以及基因表达的研究2、生物膜与细胞器的研究3、细胞骨架体系的研究4、细胞增殖及其调控5、细胞分化及其调控6、细胞的衰老与凋亡7、细胞的起源与进化8、细胞工程三、当前细胞生物学

3、研究的总趋势与重点领域1、细胞生物学研究的总趋势 细胞生物学与分子生物学(包括分子遗传学与生物化学) 相互渗透与交融是总的发展趋势；当前细胞生物学研究中的三大基本问题:（1）、细胞内基因组是如何在时间和空间上有序表达的？（2）、基因表达产物-主要是结构蛋白、核酸、脂质、多糖及其复合物，他们如何逐级装备成能行使生命活动的基本结构体系及各种细胞器？（3）、基因表达产物-主要是大量活性因子与信号分子，他们是如何调节细胞最重要的生命活动过程的？2 、当前细胞基本生命活动研究中的重要领域:（1）、染色体DNA与蛋白质相互作用关系-主要是非组蛋白对基因组的作用；（2）、细胞增值、分化、凋亡的相互关系及其调

4、控；（3）、细胞信号转导的研究；（4）、细胞结构体系的装配。3、细胞重大生命活动的相互关系 第二节 细胞学与细胞生物学发展简史一、生物科学发展的三个阶段: 1.形态描述生物学时期，19世纪以前； 2.实验生物学时期，20世纪前半世纪； 3.分子生物学时期，20世纪50-60年代至今。二、细胞生物学发展简史1. 细胞的发现2. 细胞学说的建立其意义 细胞学说内容:1） 认为细胞是有机体，一切动植物都是由细胞发育而来,并由细胞和细胞产物所构成； 2） 每个细胞作为一个相对独立的单位，既有它“自己的”生命,又对与其它细胞共同组成的整体的生命有所助益；3） 新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。3. 细胞

5、学的经典时期1）原生质理论的提出2）细胞分裂的研究3）重要细胞器的发现4. 实验细胞学与细胞学的分支及其发展1）细胞遗传学的发展2）细胞生理学的研究3）细胞化学5. 细胞生物学学科的形成与发展三、细胞学说 Jean-Baptiste de Lamark （17441829)，获得性遗传理论的创始人，法国退伍陆军中尉，50岁成为巴黎动物学教授，1809年他认为只有具有细胞的机体，才有生命。Charles Brisseau Milbel（17761854)，法国植物学家，1802年认为植物的每一部分都有细胞存在， Henri Dutrochet （17761847），法国生理学家，1824年进一步

6、描述了细胞的原理， Matthias Jacob Schleiden（18041881)，德国植物学教授，1838年发表“植物发生论”(Beitr?ge zur Phytogenesis)，认为无论怎样复杂的植物都有形形色色的细胞构成。Theodor Schwann（18101882)，德国解剖学教授，一开始就研究Schleiden的细胞形成学说，并于1838年提出了“细胞学说”（Cell Theory)这个术语；1939年发表了“关于动植物结构和生长一致性的显微研究”Schwann提出:有机体是由细胞构成的；细胞是构成有机体的基本单位。1855 德国人R. Virchow 提出“一切细胞来源

7、于细胞”（omnis cellula e cellula）的著名论断；进一步完善了细胞学说。把细胞作为生命的一般单位，以及作为动植物界生命现象的共同基础的这种概念立即受到了普遍的接受。恩格斯将细胞学说誉为19世纪的三大发现之一。 1、1839年，捷克人J. E. Pukinye 用protoplasm这一术语描述细胞物质，“Protoplast”为神学用语，指人类始祖亚当。2、1879年，德国人W. Flemming观察了蝾螈细胞的有丝分裂，于1882年提出了mitosis 这一术语。德国人E. Strasburger (187680)在植物细胞中发现有丝分裂。3、1883年，比利时人E. v

8、an Beneden 发现马蛔虫Ascaris megalocephala的减数分裂现象。7、1953年，美国人J. D. Watson 和英国人F. H. C. Crick提出DNA双螺旋模型。13、1973年，美国人S. Cohen和H. Boyer将外源基因拼接在质粒中，在大肠杆菌中表达，揭开基因工程的序幕。14、1975年，英国人F.Sanger设计出DNA测序的双脱氧法，1980年获诺贝尔化学奖。此外Sanger还由于1953年测定了牛胰岛素的一级结构而获得1958年诺贝尔化学奖。15、1975年，德国人G.J.F.Kohler、阿根廷人C.Milstein和丹麦科学家N.K.Jer

9、ne发展了单克隆抗体技术，荣获1984年度诺贝尔生理医学奖。16、1981年，美国首次发现艾滋病，1983年，法国巴斯德研究所的Luc Montagbier 发现AIDS病毒。艾滋病的全称为Acquired ImmunoDeficiency Syndrome ，由人类免疫缺陷病毒HIV引起。20年来全球共有约5800万人受到艾滋病病毒感染，2200万人死于艾滋病。我国于1985年发现。HIV有以下特点:1嗜T淋巴细胞；2整合宿主细胞终身难以消除；3多变性，基因变异是艾滋病病毒致病能力增强之原因；广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物以及唾液、尿液、脑脊液及有神经症状者的脑组织中；较乙肝病毒对

10、外界的抵抗力低，5630分钟就可以使其灭活；感染者潜伏期长、病死率高；基因组比已知的任何逆转录酶病毒基因都复杂。17、1982年，美国人S.B.Prusiner 在患羊瘙痒病的羊体内发现蛋白质感染因子（prion）。更新了医学感染的概念，获1997年诺贝尔生理医学奖。18、1983年，美国人K.B.Mullis发明PCR仪，于1993年获诺贝尔化学奖。1988年美国Cetus公司获PCR技术专利，1990年其诊断试剂盒和仪器的销售额达2600万美元。19、1990年，美国国会正式批准的“人类基因组计划” （Human Genome Project）,计划在15年内投入30亿美元以上的资金进行人

11、类基因组分析。 我国于1993年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。2000年6月28日人类基因组工作草图完成。20、1990年，美国国立卫生研究院，给一名患有先天性重度联合免疫缺陷病的4岁女孩实施了首例基因治疗。这种疾病因腺苷脱氨酶（ADA）基因变异引起。1991年12月，复旦大学遗传所薛京伦主持对一例血友病患者进行了基因治疗试验，并获得成功。EMBRYO COLONING2002年，英国人悉尼?布雷诺尔、美国人罗伯特?霍维茨和英国人约翰?苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理学或医学奖。Sydney Brenne

12、r2003年，美国科学家彼得?阿格雷和罗德里克?麦金农，分别因对细胞膜水通道，离子通道结构和机理研究而获诺贝尔化学奖。 2004年10月4日，瑞典卡罗林斯卡医学院决定，把2004年的诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家:现年58岁的理查德?阿克塞尔和现年57岁的琳达?巴克，以表彰两人在气味受体和嗅觉系统组织方式研究中作出的贡献。2005年10月3日，瑞典卡罗林斯卡医学院在瑞典首都斯德哥尔摩举行新闻发布会，宣布将2005年诺贝尔生理学或医学奖授予澳大利亚科学家巴里?马歇尔和罗宾?沃伦，以表彰他们发现了导致胃炎和胃溃疡的细菌。第二章 细胞基本知识概要本章内容提要:第一节 细胞的基本概念第二节 非

13、细胞形态的生命体-病毒及其与细胞的关系第三节 原核细胞与古核细胞第四节 真核细胞基本知识概要第一节 细胞的基本概念一、细胞是生命活动的基本单位1、一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位；2、细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位3、细胞是有机体生长与发育的基础4、细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性5、没有细胞就没有完整的生命二、细胞的基本共性1.所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。2.所有的细胞都含有两种核酸:即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。3.作为蛋白质合成的机器核糖体，毫无例外地存在于一切细胞内。4.

14、所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。 第二节 非细胞形态的生命体 病毒及其与细胞的关系一、病毒与细胞在起源与进化中的关系 病毒是非细胞形态的生命体，它的主要生命活动必须要在细胞内实现。病毒与细胞在起源上的关系，目前存在3种主要观点:1.生物大分子病毒细胞 病毒2.生物大分子 细胞3.生物大分子细胞病毒 现在来说，第二种观点和第三种观点比较容易接受，而且第三种观点越来越有说服力。 认为病毒是细胞演化的产物的观点主要依据如下:彻底的寄生性；病毒核酸与哺乳动物细胞DNA某些片断的相似性；病毒可以看成是核酸与蛋白质形成的复合大分子。第三节 原核细胞与古核细胞一、Basic characteris

15、tics of Prokaryotic cell 1. 遗传的信息量小，遗传信息载体仅由一个环状DNA或RNA构成； 2. 细胞内没有分化为以膜为基础的具有专门结构与功能的细胞器和细胞核膜。二、原核细胞的主要代表1、支原体为什么说支原体是一个细胞（1）能在培养基上生长，具有典型的细胞膜；（2）具有环状的双螺旋DNA作为遗传信息量的载体；（3）mRNA与核糖体结合形成多聚核糖体，指导蛋白质的合成；（4）以一分为二的方式分裂繁殖。支原体是最小、最简单的细胞。2、细菌 1）、细菌的三种形态:球状、杆状和螺旋状 2)、细菌细胞的核区与基因组:细菌的核区实际主要由一个环状的DNA分子组成；现在也可以把细

16、菌的环状DNA理解为细菌基因组。 3）、细菌细胞的表面结构:A. 细胞膜:主要功能是选择性的交换物质-吸收营养物质，排出代谢废物，并且有分泌与运输蛋白的作用。B. 细胞壁: 所有细菌的细胞壁的共同成分是肽聚糖，由乙酰氨基葡萄糖、乙酰胞壁酸与四五个氨基酸短肽聚合而成的多层网状大分子结构。 C. 细胞壁特化结构:a. 中膜体-细胞膜内陷而形成的；b. 荚膜-是一层松散的粘液物质，有一定程度的保护作用；c. 鞭毛-细菌的运动器官，与真核生物的鞭毛不同，它是由一种称为鞭毛蛋白的弹性蛋白所构成。 4）、细菌细胞的核糖体部分附着在细胞膜内侧，大部分游离于细胞质中，与蛋白质的合成密切相关。 5）、细菌细胞核

17、外DNA-质粒，是裸露环状DNA，在遗传工程研究中很重要。 6）、细菌细胞的内生孢子，即芽孢，是细菌对不良环境或营养耗尽时的反应。3. 蓝藻细胞:是最简单的自养植物类型之一。基本特征:1）中心质-相当于细菌的核区，是遗传物质DNA所在部位。 2）光合片层-位于细胞质部分，是同心环状的膜片层结构，上边附着有藻胆蛋白体（包括藻蓝蛋白，一藻蓝蛋白和藻红蛋白），能够把光能传递给叶绿素a，进行原始光和作用。 3）细胞质内含物 4）细胞表面结构 5）细胞分裂四、原核细胞与真核细胞的比较1、原核细胞与真核细胞最根本的区别 :（1）、细胞膜系统的分化和演变。 细胞内部结构和职能的分工是真核细胞区别于原核细胞的

18、重要标志。（2）、遗传信息量与遗传装置的扩增与复杂化。 遗传信息重复序列与染色体多倍性的出现是真核细胞区别于原核细胞的另一重要标志。（3）、真核细胞内，遗传信息的转录与翻译有严格的阶段性和区域性，而在原核细胞内则是转录与翻译可以同时发生五、原核细胞与真核细胞基本特征的比较（p36)六、原核细胞与真核细胞的遗传结构装置和基因表达的比较(p37) 七、古细菌古细菌（archaebacteria）与真核细胞曾在进化上有过共同历程主要证据（1）细胞壁的成分与真核细胞一样，而非由含壁酸的肽聚糖构成，因此抑制壁酸合成的链霉素， 抑制肽聚糖前体合成的环丝氨酸，抑制肽聚糖合成的青霉素与万古霉素等对真细菌类有强

19、的抑制生长作用，而对古细菌与真核细胞却无作用。（2）DNA与基因结构:古细菌DNA中有重复序列的存在。此外，多数古核细胞的基因组中存在内含子。（3）有类核小体结构:古细菌具有组蛋白，而且能与DNA构建成类似核小体结构。（4）有类似真核细胞的核糖体:多数古细菌类的核糖体较真细菌有增大趋势，含有60种以上蛋白，介于真核细胞（7084）与真细菌（55）之间。抗生素同样不能抑制古核细胞类的核糖体的蛋白质合成。（5）5S rRNA:根据对5S rRNA的分子进化分析，认为古细菌与真核生物同属一类，而真细菌却与之差距甚远。5S rRNA二级结构的研究也说明很多古细菌与真核生物相似。 第四节 真核细胞基本知

20、识概要一、真核细胞的基本结构体系 1.生物膜系统:以脂质及蛋白质成分为基础的生物膜结构系统； 2.遗传信息表达结构系统:以核酸（DNA或RNA）与蛋白质为主要成分的遗传信息表达系统 3.细胞骨架系统:由特异蛋白分子装配构成的细胞骨架系统。二、细胞的大小及其分析各类细胞直径的比较三、植物细胞与动物细胞的比较植物细胞特有的结构: 1. 细胞壁 2. 液泡 3. 叶绿体第三章 细胞生物学研究方法本章内容提要：第一节 细胞形态结构的观察方法第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术第一节 细胞形态结构的观察方法一、光学显微镜技术（一）普通光学显微镜? 1. 构成：? 照明系统

21、? 光学放大系统? 机械装置? 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。? 3. 分辨率：指分辨物体最小间隔的能力。（二）荧光显微镜 Fluorescence microscope特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形

22、成立体图像。（四）相差显微镜? 把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。? 环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。? 相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。原理用途：观察未经染色的玻片标本（五）微分干涉差显微镜 Differential interference contrast microscope （DIC）? 1952年，Nomarski发明，利用两组平面偏振光的干涉，加强影

23、像的明暗效果，能显示结构的三维立体投影。标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。二、电子显微镜1、电子显微镜的基本知识 电镜与光镜的比较显微镜 分辨本领 光源 透镜 真空 成像原理LM 200nm 可见光（400-700） 玻璃透镜 不要求真空 利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化 100nm 紫外光（约200nm) 玻璃透镜 不要求真空TEM 0.1nm 电子束（0.01-0.9） 电磁透镜 要求真空 利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差 2、 原理? 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比。? 由电子照明系统、

24、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。? 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。? 用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic structures）。3、主要电镜制样技术? 1）超薄切片? 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。? 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。? 2）负染技术? 用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的

25、样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。3）冰冻蚀刻 freeze-etching? 亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。三、扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope，STM? 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针

26、尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。? 分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。? 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。第二节 细胞组分的分析方法一、离心分离技术用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。 （一）差速离心 Differential centrifugation? 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。? 用途

27、：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。? 沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。? 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 （二）密度梯度离心? 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。? 类型：速度沉降（velocity sedimentation）、等密度沉降（isopycnic sedimentation）。? 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。? 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）

28、对细胞无毒。二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法?原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些 特殊基团特异性结合的特征，通过显 色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 Feulgen Staining三、特异蛋白抗原的定位与定性1、免疫荧光技术： 快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 2、蛋白电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹反应(Western-Blot)3、免疫电镜技术：?免疫铁蛋白技术?免疫酶标技术应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等四、细胞内特异核酸的定位与定性?光镜水平的原位杂交技术

29、（同位素标记或荧光素标记的探针）?电镜水平的原位杂交技术（生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合）?PCR技术 五、放射自显影技术1、原理及应用：?利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；?实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。2、步骤：?前体物掺入细胞（标记：持续标记和脉冲标记） 放射自显影六、定量细胞化学分析技术1、显微分光光度术（Microspectrophotometry）?利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法? 流式细胞仪（Flow

30、 Cytometry）?主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量； 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； 分离DNA含量不同的中期染色体。 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术一、细胞的培养1、动物细胞培养 （1） 类型：A 原代培养细胞（primary culture cell)-从机体取出后立即 培养的细胞。1-10代以内的细胞培养称为原代培养细胞。 B 继代培养细胞（sub-culture cell）-适宜在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代培养细胞 (2) 细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制.1050代(3) 细胞系（cell line） 亚二倍体或非整倍体，接触抑制丧失，容易传代培养。50代以后。 2、植物细胞 （1）、 原生质体培养 （体细胞培养） （2）、单倍体细胞培养（花药培养） 3、非细胞体系（cell-free system）： 只来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质组成体系。二、细胞工程 1、细胞工程： 在细胞水平上有计划的保存、改变和创造细胞遗传物质，以产生新的物种和品系，或大规模培养组织细胞以获得生物产品。 其所使用的技术主要是：细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合与显微注射。2、细胞融合（cell fusion）与细胞杂交（