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1、普洱参考资料茶黄酮类物质对Dgalactose诱导氧化应激大鼠GSHPx活性影响的研究 科类 农科 编号（学号）57 本科生毕业论文（设计）普洱茶黄酮类物质对D-galactose诱导氧化应激大鼠GSH-Px活性影响的研究Studies of the effects of flavonoid in puer tea on the GSH-Px activity in oxidative stress rats induced by D-galactose 李银丽指导教师： 侯 艳 职称： 讲 师 云南农业大学 昆明 650201 学 院： 龙润普洱茶学院 专 业： 茶学 （茶艺茶道方向） 年级

2、： 2010级 论文（设计）提交日期： 2014年4月答辩日期： 2014年5月 答辩委员会主任： 吕才有 云南农业大学 2014年5月普洱茶黄酮类物质对D-galactose诱导氧化应激大鼠 GSH-Px活性影响的研究 李银丽（云南农业大学，龙润普洱茶学院，昆明，650201）摘 要【目的】探讨普洱茶黄酮类物质对D-galactose诱导氧化应激大鼠GSH-Px活性的影响；【方法】以由D-galactose诱导引起的氧化损伤试验大鼠为模型动物，造模成功的试验大鼠随机分为阳性（D-galactose模型）对照组、药物组，50%乙醇洗脱物（低、中、高剂量）组，30%乙醇洗脱物（低、中、高剂量）组

3、，10%乙醇洗脱物（低、中、高剂量）组，加上为阴性（正常）对照组共12组，每组12只（雌雄各半）。持续分别给予蒸馏水、Vitamin E水溶液（混悬液）、普洱茶黄酮类物质乙醇洗脱物50%（低、中、高）、30%（低、中、高）10%（低、中、高）、蒸馏水。连续灌喂28天后牺牲实验动物，测定试验大鼠心、肝、肾与脑组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。【结果】与正常对照组(Vehicle group)相比，D-galactose诱导氧化应激模型组大鼠主要脏器（心，肝、脑与肾）组织中GSH-Px活性显著降低。药物对照组（Vitamin E）与模型组比较，大鼠脏器（心，肝、脑与肾）组织中GSH-

4、Px活性显著升高（P0.001）。普洱茶黄酮类提取物50%，30%和10%的乙醇洗脱物均具有增加D-galactose诱导氧化应激模型大鼠主要脏器（心，肝、脑与肾）组织中GSH-Px活性的作用（P0.01），并具有剂量-效应关系，且三种物质的作用相当。【结论】普洱茶黄酮类物质具有增加氧化应激大鼠GSH-Px活性的作用。 关键词:普洱茶，黄酮类物质；抗氧化；GSH-Px；大鼠Studies of the effects of flavonoid in puer tea on the GSH-Px activity in oxidative stress rats induced by D-gal

5、actoseLi yin li (Yunnan Agricultural University;College of Long-run Pu-erh tea；Kunming 650201)ABSTRACT 【OBJECTIVE】 To investigate the effects of flavonoid in puer tea on the GSH-Px activity in oxidative stress rats induced by D-galactose. 【METHODS】 In this study, we used oxidativestress rats as anim

6、al model, the successfully established experimental rats models were randomly divided as positive control group, drug group (Vitamin E), 50%ethanolicelution groups (include high, middle andlowthreedosagegroups), 30%ethanolicelution groups (include high, middle, lowthreedosagegroups ), 10%ethanolicel

7、ution group (include high,middle,lowthreedosagegroups) and negtive group with 12 rats in each group. Eachgroupratsweregiven by gavage withdistilledwater, Vitamin E, high, middle,low doses of 50%ethanolicelution, high, middle, low doses of 30%ethanolicelution and high, middle, low doses of 10%ethanol

8、icelution, and distilledwater respectively. The heart,liver,kidney and brain of rats were obtained 4weeks later, in which thevitalityofGSH-Px weredetected.The vitality of GSH-Px in main organsofoxidativestressrats significantlyreduced,Comparedwithnormalcontrol group.The vitality of GSH-Px in mainorg

9、ans ofdrug grouprats significantlyincreased, Comparedwithpositive control group(P0.001). TheflavonoidsinPuer tea(50%,30% and 10%ethanolicelution) could improve the activity of GSH-Px inmainorgansofoxidativestressrats（P0.01) ,andshowed a significantdoseresponserelationship, and these three elutions s

10、ervethesamefunction.【CONCLUSION】Flavonoids in puer tea have significant effect on increasing the GSH-Px activity in oxidative stress rats induced by D-galactose. Key words: the flavonoidson of Pu-ErhTea； antioxidatio；D-galactose；Rats 洱茶黄酮类物质对D-galactose诱导氧化应激大鼠GSH-Px活性影响的研究1 引言1.1 普洱茶的概述及其研究现状 普洱茶是以

11、云南省一定区域内的云南大叶种晒青毛茶为原料，经过后发酵加工成的散茶和紧压茶1。普洱茶属于黑茶类,产于云南省西双版纳、思茅和临沧等地,自古以来即在普洱集散,因而得名2,是我国的特种茶类 3。渥堆发酵是普洱茶的特征工序，对普洱茶的保健功效起着关键作用4。研究表明，普洱茶具有抗氧化5、减肥9、暖胃助消化10、抗癌11、健齿护牙12、降压13、防治糖尿病、提高免疫力、生津止渴、醒酒解毒、降血脂6、降血糖7、抗突变、防癌及防治心血管疾病等功能。普洱茶药理作用的主要成分是茶多酚、茶色素和茶多糖等8。茶叶中的多酚类包括黄烷醇类、黄酮类、黄酮醇类、花青素类、花白素类；酚酸及缩酚酸类等多种结构类型的酚类化合物3

12、。1.2 氧化应激的概述 从生物学角度来看，人体的生命活动是由难以计数的酶促氧化还原反应组成的。例如机体所需能量的产生，是在细胞当中的“发电厂”线粒体中的一系列氧化还原反应产生的。在其反应过程中，不可避免地产生大量的“中间产物”。这些“中间产物”就是所谓的“自由基”。即带有未成对电子的分子基团，反应活性极高。可攻击人体当中任何的分子，因而，这种物质常被称为“有害垃圾”。在正常情况下，这些“有害垃圾”或“自由基”可被细胞中的环卫系统“抗自由基”分子消除掉。当机体的垃圾清理系统能力不足或功能紊乱时，这些垃圾就会在人体中沉积。这些“垃圾”可沉积到皮肤，人体皮肤便会出现“老年斑”；当这些“垃圾”沉积到

13、心脏时，人体可出现心悸、心慌与气短。当这些“垃圾”堆积到脑组织时，就可出现学习记忆的障碍，如失眠、健忘等。当这些“垃圾”沉积到肾组织中时，人体便会出现肾功能的损害，如出现蛋白尿甚至血尿等。所谓的“氧化应激”（Oxidative Stress，OS），其实就是机体在遭受各种有害刺激时，体内活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。即体内“有害垃圾”的产生与“垃圾清除”失衡。垃圾产生大于垃圾清理，结果导致组织的损伤。

14、大量资料证明，炎症、肿瘤、衰老、血液病，以及心、肝、肺、皮肤等各方面疑难疾病的发生机理与体内自由基过多积累或清除自由基能力下降有着密切的关系。自由基和活性氧的生成，主要来自体外、体内各种因素，体外因素主要是各种各样环境因素中的自由基进入到体内，特别重要的是大气污染物质、药物、紫外线、放射线等；体内自由基的产生系统主要有：活性化的巨噬细胞，白血球(嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性细胞、淋巴细胞、单核细胞)，细胞内微粒(线粒体、细胞核膜、微粒体等)，氧化金属蛋白质(氧合血红蛋白)，酶类(黄嘿吟氧化酶、叫睬胺氧添加酶等)，身体内物质的自动氧化(儿茶酚胺、硫醇化合物等)等。因此，降低自由基危害的途径

15、也有两条：一是，利用内源性自由基清除系统清除体内多余自由基；二是，发掘外源性抗氧化剂自由基清除剂，阻断自由基对人体的入侵。 1.3 普洱茶黄酮类物质的概述 黄酮类(Flavone)物质是自然界广泛存在的一类黄色色素，茶叶中黄酮类物质约为茶叶干重的3%-4%。相关试验表明，黄酮类物质能通过其所含的酚羟基结构与自由基反应而达到可有效清除羟自由基和体内自由基,实现抗氧化作用，且其清除自由基的能力大于维生素C和维生素E12。此外，黄酮类物质还作为一种天然的抗氧化剂，以其安全、高效地防止油脂及其制品氧化和酸败，保证含油食品的感官品质和营养价值，延长保存期而受到人们的关注13。黄酮类基本结构是2-苯基色原

16、酮（2-Phenylchromone），现在则泛指两个具有酚羟基的苯环（A与B环）通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物。黄酮具有较高的药用价值,黄酮类物质具有：抗菌作用；抗病毒作用；抗过敏作用；抗衰老作用；抗肿瘤及降血脂等多种生物活性14。1.4 研究目的和意义综上所述，自由基与多种疾病的关系，已愈来愈被重视，自由基生物医学的发展使得探寻高效低毒的自由基清除剂天然抗氧化剂成为生物化学和医药学的研究热点。抗氧化被认为是茶叶保健抗癌的最重要机理。对普洱茶中活性物质具有抗氧化作用的研究越来越深入，而普洱茶黄酮类物质是否具有抗氧化作用，以及其抗氧化作用是如何发挥的还鲜见报道。活性氧自由基伴随代谢

17、而产生，因而氧化应激损伤随时都会发生。为了应对时时刻刻都会产生的损伤，人类和动物在进化中发展了多重防线。除了SOD以外，生物细胞中还存在谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px) 抗损伤系统，只是它们的分工不同。活性氧自由基ROS经过SOD酶的催化，转化为过氧化氢（H2O2），H2O2再经过GSH-Px的催化转化为水和分子氧。实验研究显示，GSH-Px活性随衰老的下降，与多器官的抗损伤能力下降有关。国际上的生物学家做了一些有趣的实验，发现单纯增加SOD的活性，并不能显著地对抗衰老，而同时增加GSH-Px的活性，则显著延长衰老动物的健康寿命。因此，本次试验采

18、用柱层析法以不同乙醇浓度（50%，30%，10%）洗脱液获得的普洱茶黄酮类物质为原料，以由D-galactose诱导引起的氧化损伤试验大鼠为模型动物，对其持续分别经口灌胃普洱茶黄酮类物质50%（高、中、低）、30%（高、中、低）、10%（高、中、低）4周后，牺牲试验动物，测定其主要脏器（心，肝、脑与肾）组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，并确定其剂量-效应关系。揭示普洱茶黄酮类物质的抗氧化作用, 为普洱茶的抗氧化功能评价提供理论依据。2 研究材料与方法2.1 实验时间与地点本试验自2013年10月1日至2014年1月25日进行为期四个月的动物饲养试验。动物饲养试验是在动科院小动物房

19、养殖4房间进行，生化指标的测定是在动科院牧医楼卫检实验室进行。2.2研究材料，4保存。 对照药物：采用经过国际上证明用于抗氧化应激有效的药物，Vitamin E胶囊（美国Spring valley International Vitamin Corporation Freehold公司，Catalog. No：WMT644596，Lot. No:000020, NJ07728 USA），规格：400I.U./per soft gel。 8周龄，SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重180.0-220.0g。购于北京大学医学部实验动物中心。动物许可证号：SCXK-2009。动物置于12h/12h明暗交

20、替环境，自由进食。所有动物实验操作均按北京实验动物管理条例执行。 基础饲料：由昆明医学院动物实验中心提供，配方见表1。表1 基础饲料配方Tab. 1 Basic feed formula成 分配 比（g/kg）配 比（g/kg）配 比（g/kg）玉米350盐5麦麸250菜油5豆粕250矿物添加剂1鱼粉80复合维生素0.3酵母20蛋氨酸1.3骨粉20赖氨酸0.7乳清粉10鱼肝油0.5动物垫料：购于昆明医学院实验动物中心。 牛血清白蛋白（Bovine serum albumin）：美国AMRESCO公司产品（目录：0332。批号：3271C266）；考马斯蛋白测定试剂盒（Coomassie Bra

21、dford Protein Assay Kit, microplate assays）：美国热科皮尔斯生物技术产品（目录：23200,，批号： NH172158）谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（Cat No：A005-1）：南京建成生物工程研究所提供；西门子尿十项干化学检测试纸：西门子医疗诊断公司（目录号：8566001；批号：209044）实验鼠笼、灌胃器具：苏杭实验动物设备厂；80-1/2低速离心机：常州市华普达教学仪器有限公司；80-2电动离心机：常州市普达教学仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅：常州市华普达教学仪器有限公司；20L 微量采血管：安徽赫尔生物医学检验科技有

22、限公司；XW-80A旋涡混合器：上海精科实业有限公司；Epppendorf-4910单道微量可调移液器：德国Epppendorf公司；SUNRISE 酶标仪：奥地利 GmbH公司；AU2700全自动生化分析仪：贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司。其他：磨口瓶、秒表、注射器、剪刀、移液管、烧杯、玻璃匀浆器、手术刀等。2.3方法2.3.1 动物实验原理D-galactose供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起试验小鼠氧化效应后，采用供试样品进行为期4周的干预，测定试验小鼠相应的抗氧化指标，评价受试物的抗氧化能力。2.3.2 实验动物选择参照中华人民共和国卫

23、生部2003年颁布的保健食品检验与评价技术规范和国际公认动物模型，根据所评价的功能性实验动物要求，选择168只(雌雄各半)外形符合健康标准的SPF级近交系SD大鼠为试验对象，体重在180g-220g之间。2.3.3 动物饲养管理大鼠同室每笼4只，雌雄分笼饲养。动物饲养条件为室温：222，湿度：45-60%，12小时明暗交替。笼具、垫料应舒适、卫生、无毒和安全。每2天换一次垫料，饮水瓶定期换水消毒，饲养房间定时用白醋或消毒剂消毒，房间定时通风，使其保持一个良好的饲养环境。2.3.4 过氧化模型的建立 试验大鼠适应性喂养1周后，随机挑选12只（6只雌性，6只雄性）试验大鼠为阴性对照组。其余156只

24、大鼠，每天按照每100g大鼠体重，皮下注射10% 0.1ml的D-半乳糖（D-galactose，100mg/kg.bw）溶液，连续6周；阴性对照组给予等容量的生理盐水。第6周末，留取新鲜尿液，用西门子尿十项干化学检测试纸，对新鲜尿液中的蛋白、红细胞进行初步快速检测。以评价D-Glactose导致的肾组织的氧化应激损伤程度（以肾组织作为评价心、肝、脑等内脏损伤的标志物-biomarker）。选取造模成功的大鼠，即血清MDA水平较正常对照大鼠显著增高，蛋白尿阳性（+以上），镜下血尿阳性（+以上）的大鼠，随机分组进行下一步试验。2.3.5 实验动物分组及剂量确定造模成功的试验大鼠随机分为阳性（D-

25、Glactose模型）对照组、药物组，50%乙醇洗脱物（低、中、高剂量）组，30%乙醇洗脱物（低、中、高剂量）组，10%乙醇洗脱物（低、中、高剂量）组，加上为阴性（正常）对照组共12组，每组12只（雌雄各半）。普洱茶黄酮类提取物低、中、高剂量按照人体推荐量折算为大鼠灌胃量的5倍，10倍,20倍，即为20 mg/kg.bw、40 mg/kg.bw、80 mg/kg.bw；对于药物对照组的大鼠，每日灌喂Vitamin E水溶液（混悬液），依据人的临床剂量，按照国际通用的换算方式（human equivalent dose），换算为大鼠的试验剂量为：如表2所示：表2 实验大鼠分组和剂量设计Tab 2

26、 Experimental group and feed composition实验组别实验动物数量（只）饲料组成普洱茶灌胃剂量（mg/kg.bw）药物组灌胃剂量（I.U./kg.bw）阴性（正常）对照组D-Galactose vs Vehicle12基础饲料蒸馏水-阳性（D-半乳糖模型）对照组D-Glactose12基础饲料蒸馏水-药物干预组Vitamin E12基础饲料-41.350%乙醇洗脱物低剂量干预组50%-Low Vs D-alactose12基础饲料20-50%乙醇洗脱物中剂量干预组50%-Medium Vs D-alactose12基础饲料40-50%乙醇洗脱物高剂量干预组50

27、%-High Vs D-alactose12基础饲料80-30%乙醇洗脱物低剂量干预组30%-Low Vs D-alactose12基础饲料20-30%乙醇洗脱物中剂量干预组30%-Medium Vs D-alactose12基础饲料40-30%乙醇洗脱物高剂量干预组30%-High Vs D-alactose12基础饲料80-10%乙醇洗脱物低剂量干预组10%-Low Vs D-alactose12基础饲料20-10%乙醇洗脱物中剂量干预组10%-Medium Vs D-alactose12基础饲料40-10%乙醇洗脱物高剂量干预组10%-High Vs D-alactose12基础饲料80

28、-2.3.6 给药方法及时间根据每组实验动物的平均体重，将制备的受试样品分别按设计剂量，每日定时经口灌胃，除阴性对照组和模型组每天灌胃等体积的蒸馏水外，其他各组将不同浓度的普洱茶黄酮提取物溶于水中，按照每100g体重大鼠，灌喂1.0ml的比例进行灌胃，连续灌喂28天，结束后即牺牲大鼠。2.3.7 生长指标检测 实验周期28/天，每日观察大鼠活动情况及皮毛状况，每周称量体重根据体重每周调整灌胃剂量，并记录摄食量。2.3.8 普洱茶对过氧化实验大鼠心、肝、肾和脑组织中GSH-Px活性影响的检测喂养28天后，12h禁食不禁水，牺牲大鼠，摘取心脏、肝脏肾脏和脑组织，并制备10%组织匀浆，步骤如下： （

29、1）取各组织1g，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸吸干后放于小烧杯中。用移液管取预冷的匀浆介质（0.86%的生理盐水）6ml于烧杯中，用剪刀将组织剪碎，并将小烧杯置于冰面上操作。（2）将剪碎的组织倒入研钵中，用移液管吸取3ml生理盐水冲洗残留在烧杯上的组织，一起倒入玻璃匀浆器中，左手持匀浆管将下端插入冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动数十次（6-8min），充分研碎，使组织匀浆化。（3）将制备好的10%的匀浆分装于两个10ml的离心管中，2500r/min离心15分钟，离心好以后取上清液分装于1.5ml的离心管中，并放于-20条件下储存待测。用于测定其GSH-Px活性

30、，测定方法均按照说明书进行操作。2.4 数据处理 数据显示为均值标准差（MeanS.D.），不同组别的比较采用one way ANOVA with T-test统计学检验, 统计学检验采用Microsoft excel 软件完成。3 结果与分析3.1普洱茶黄酮类提取物对D-galactose诱导氧化应激大鼠心肌中谷胱甘肽超氧化物歧化酶（GSH-Px）活性的影响 图1. 普洱茶提取物对D-galactose诱导氧化应激模型大鼠心肌组织GSH-Px活性影响注：图柱代表均数标准差，下表均同。图1显示，与正常对照组(Vehicle group)相比，D-galactose诱导氧化应激模型组大鼠心肌GS

31、H-Px活性显著降低（P0.001）。药物对照组（Vitamin E）与模型组比较，心肌GSH-Px活性显著升高（P0.001）。与模型组比较，50%乙醇洗脱物的中剂量（Medium dose，40mg/kg/day ) 和高剂量组（High dose，80mg/kg/day）大鼠心肌中GSH-Px的活性均显著增加（P0.05-0.001）；30%和10%乙醇洗脱物的高剂量组（High dose，80mg/kg/day）心肌中GSH-Px的活性均显著增加（P0.01），并具有剂量-效应关系。3.2 普洱茶黄酮类提取物对D-galactose诱导氧化应激大鼠肝组织中谷胱甘肽超氧化物歧化酶（GSH-Px）活性的影响图2. 普洱茶黄酮类提取物对D-galactose诱导氧化应激模型大鼠肝肌组织G