气相色谱质谱对三种硅藻脂肪酸组成的测试规律性分析图文百精.docx

1、气相色谱质谱对三种硅藻脂肪酸组成的测试规律性分析图文百精气相色谱2质谱对三种硅藻脂肪酸组成的测试规律性分析夏静芬,钱国英,贾永红(浙江万里学院生物与环境学院,宁波315100摘要:借助气相色谱2质谱(G C2MS联用技术比较分析了角毛藻(Chaetocerosmuelleri、新月菱形藻(Nitzshia closterium和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornu2tum等3种硅藻在保留时间和质谱裂解方面的异同性规律。结果表明,强极性柱中各脂肪酸的分离顺序为低碳原子数到高碳原子数,碳原子数相同的组分分离顺序按低不饱和度到高不饱和度,弱极性柱中色谱出峰顺序也为低碳原子数到高碳

2、原子数,与强极性柱一致,但碳原子数相同的组分分离顺序则从低饱和度到高饱和度,与强极性柱恰好相反;不同脂肪酸的质谱裂解表明,饱和脂肪酸甲酯的基峰为mz74,单烯脂肪酸甲酯的基峰为mz55,双烯脂肪酸甲酯的基峰为mz67,而三烯以上脂肪酸甲酯的基峰则为mz79,本文认为基峰这一特点可用来确定不饱和度,以助于快速准确的对脂肪酸甲酯进行定性分析;本文还比较了T MSH和NaOH2CH3OH两种甲酯化方法的区别。在此基础上用面积归一化法测定了硅藻脂肪酸的含量,发现3种硅藻都含有饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸,其中23PUFAs主要为EPA。关键词:硅藻;G C2MS;脂肪酸多烯脂肪酸(PUF

3、As,特别是以二十碳五烯酸(EPA和二十二碳六烯酸(DH A为代表的23PU2 FAs系列,与营养保健和疾病预防等诸多生物功效有重要关系15。当前,23PUFAs主要来源于水生动物提取的油制品,但这些来源却面临诸多问题,于是迫切需要开发一种价格低廉、来源丰富、易于分离纯化的23PUFAs来源,海洋硅藻便是首选的重要的来源之一。近年来,对海洋硅藻中PU2 FAs的分析工作日益增多,建立快速、准确、可靠的分析方法,对硅藻中功能性脂肪酸的研究和开发具有极为重要的意义。目前脂肪酸的分析方法主要以气相色谱法为主611,该法只能依据峰的保留时间对各种脂肪酸进行定性分析,且需要昂贵的脂肪酸甲酯标准样品,应用

4、受到限制。G C2MS 法是利用气相色谱对混和物的高效分离能力和质谱对纯物质的准确鉴定能力而开发的分析技术,已较多的应用于测定动物与植物中的脂肪酸含量1216,用此法对微藻中脂肪酸含量测定的报导还不多见,特别是对脂肪酸的色谱保留时间规律与质谱特征研究的更少17。本文通过G C2MS法测定角毛藻(Chaetoceros muelleri、新月菱形藻(nitzshia closterium和三角褐指藻(phaeodactylum tricornutum的脂肪酸组成和含量,提出了硅藻脂肪酸甲酯保留时间规律和质谱特征,旨在建立准确可靠硅藻脂肪酸测定方法,为硅藻脂肪酸的开发利用打下技术基础。1实验部分1

5、.1仪器与试剂Finnigan T race DS Q气质联用仪,CP2Sil8C B MS 毛细管柱30mm0.25mm0.25m。色谱标准样品购自Sigma公司;其他均为市售分析纯试剂。1.2实验方法1.2.1硅藻的培养和收集角毛藻(Chaetoceros muelleri、新月菱形藻(nitzshia closterium和三角褐基金项目:国家外专局(CG2006330204项目资助作者简介:夏静芬(1976-,女,讲师,硕士指藻(phaeodactylum tricornutum 由本实验室提供。培养基采用F 2配方配制18 ,培养温度为25,光照时间为10h d ,光照强度为5000

6、lux ,以0.5m 3min 通气培养,1015天后收集。于800010000r min 离心收集,冷冻抽干,备用。1.2.2脂肪酸的提取及甲酯化称取1.0g 硅藻干粉,碾碎后用苯石油醚溶液浸提,再用NaOH 2CH 3OH 溶液甲酯化,用正己烷萃取,上清液上机分析。1.2.3气相色谱2质谱检测气相条件:PT V 进样口,温度270。色谱柱初始柱温140,保持1min ,然后以4.0min 的速度升温到215,保 持5min ,再以2.8min 的速度升温到240,保持5min 。以高纯He 为载气,流速1.0m L min ,分流比501,进样量为1L 。质谱条件:质谱离子源EI ,温度2

7、50,能量70V,灯丝电流100A ,转移线温度250,全程扫描,质量范围40300amu ,数据起始采集时间4.20min 。2结果与讨论2.13种硅藻脂肪酸甲酯的气相色谱2质谱图及脂肪酸相对含量图1、图2和图3分别为在选定的条件下所测得的3种硅藻各脂肪酸组分的气相色谱2质谱总离子流图。图中横坐标为组分的保留时间,纵坐标为各组分的离子强度相对比例,样品分析总时间为38.68min ,从各图中可以看出各组分分离效果较好。 图1角毛藻各脂肪酸甲酯的气相色谱2质谱总离子流图根据气相色谱质谱总离子图中各组分的离子碎片质量谱图,利用计算机谱库进行指认,并通过标准物质核对以确定其化学结构。由于脂肪酸甲酯

8、的响应值比较接近,所以采用峰面积归一化法计算各种脂肪酸的含量。定性定量结果见表1。图2新月菱形藻各脂肪酸甲酯的气相色谱2质谱总离子流图图3三角褐指藻各脂肪酸甲酯的气相色谱2质谱总离子流图表13种硅藻脂肪酸的组成及相对含量脂肪酸碳数和不饱和度百分含量%角毛藻新月菱型藻三角褐指藻C14040.20 6.8542.12C163n -48.728.60C162n -4 6.00C161n -716.2734.7617.25C16012.1432.7011.65C182n -6 1.630.76 1.32C181n -911.889.7911.11C180 2.65 1.98C205n -3(EPA 2

9、.59 2.64 2.31C2203.24其它 3.920.85 3.66饱和脂肪酸54.9945.2055.75单不饱和脂肪酸28.1544.5528.36多不饱和脂肪酸12.949.4012.2323PUFA11.312.6410.91从表1可以看出,从总体上来讲,3种硅藻都有较高含量的C140、C161n -7、C160、C181n -9,且C161n -7的含量高于C160和C181n -9;EPA 含量接近,约2.5%,均未检出DH A 。但3种硅藻脂肪酸组成又各有特点,其中角毛藻和三角褐指藻脂肪酸组成比较相似,C140的含量超过40%,且都具较高含量的C163n -4,并有C180

10、检出;而新月菱形藻C140的含量相对较低,且未检测到C163n -4和C180,但有C162n -4和C220检出。2.2脂肪酸甲酯保留时间的规律对不同类型的毛细管柱,脂肪酸甲酯保留时间的规律不同。用4种毛细管柱对3种硅藻脂肪酸进行了分离,其中SP2380(S UPPE LC O 公司毛细管柱、DB 2FFAP (Agilent J &W Scientific 公司毛细管柱和SP2330(S UPPE LC O 公司的保留规律一致,即对于不同碳原子数脂肪酸甲酯的分离顺序是从低碳原子数到高碳原子数;碳原子数相同的组分分离顺序按低不饱和度到高不饱和度。而对于本实验所选用的CP -Sil8C B M

11、S (Abel 公司分析柱,由图1图3的总离子流图可以看出,色谱出峰顺序为碳数少的脂肪酸甲酯先出峰,碳数多的脂肪酸甲酯后出峰,与前面3种柱子一致;但碳原子数相同的组分分离顺序则是饱和度低的先出峰,饱和度高的后出峰,与以上3种柱子恰好相反。这是“相似相溶”原理的体现,因为前3种毛细管柱极性较强,而后者色谱柱固定相的极性较弱。2.3脂肪酸甲酯的质谱特征由脂肪酸甲酯的质谱图可以看出,一般饱和脂肪酸甲酯在m z 74处出现最强离子峰,即基峰,其对应于饱和脂肪酸甲酯进行2H 转移,断裂的麦氏重排反应所产生的CH 3CO+CH 3片段。另外在m z 55,m z 87处也有较强离子峰。单烯脂肪酸甲酯在m

12、z 55处出现最强离子峰,可能对应于双键迁移进行(断裂产生的C 4H 7+片段,另外在m z 67,m z 69,m z 74处也往往有较强离子峰出现。双烯脂肪酸甲酯在m z 67处出现最强离子峰,可能对应于双键迁移进行(断裂产生的C 5H 7+片段,另外在m z 55,m z 81,m z 95处也常有较强离子峰。三烯以上脂肪酸甲酯在m z 79处出现最强离子峰,主要对应于双键迁移进行(断裂产生的C 6H 7+片段,另外在m z 55,m z 67处也有较强离子峰;而四烯以上脂肪酸甲酯还在m z 91处有较强离子峰,对应于C 7H 7+片段。以上规律与吴惠勤等的研究基本一致17,我们认为可由

13、基峰确定不饱和度,以助于快速准确的对脂肪酸甲酯进行定性分析。如图4为3种硅藻都含有的多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸(EPA 的质谱图,图中横坐标为核质比,纵坐标为不同质量数的离子强度,由于EPA 属于五烯酸,所以在m z 79处出现最强峰,另外在m z 55、m z 67、m z 91处出现较强离子峰。图4不饱和脂肪酸EPA 的质谱图2.4脂肪酸甲酯化方法的选择脂肪酸含羧基,极性较大,沸点也较高,直接进样分析困难,故在分析前要先对其进行甲酯衍生化,生成适于G C MS 分析的挥发性脂肪酸甲酯,以降低沸点和极性,提高分离的有效性。分别尝试了两种甲酯化方法,分别是T MSH (T rimethyl s

14、ul 2foniumhydroxide (酯化法19和NaOH 2CH 3OH 酯化法(本法,实验结果表明,两种甲酯化方法都能取得较好的结果,相对来说T MSH 法时间较短,但试剂较为昂贵,因此本实验选用NaOH 2CH 3OH 酯化法。3结论由上述可见,采用G C 2MS 法测定硅藻的脂肪酸组成,即使分析条件变化,出峰时间和顺序产生变化,利用质谱也可以准确判定各峰的性质,所研究的脂肪酸甲酯保留时间的规律和质谱特征可快速指认各脂肪酸。定量分析结果表明三种硅藻都含有饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸,其中23PUFAs 主要为EPA 。参考文献1Dupluse,F orestc.Bioc

15、hemical Phamacology,2002,64:8932Membrane sub fractions.Biochimica et Biophysica Acta,2002,1583:743C opeman L A,Parrish C C,Brown J A et al.Aquacul2ture,2002,210:2854Lombardi V R M,Cagiao A,Fernandez2nov oa L et al.Nu2trition Research,2001,21:14255梁英,麦康森,孙世春.海洋湖沼通报,1999,(2:706可成友,吴晓芳.中国卫生检验杂志,2005,15

16、(5:5287黄鸿洲,康燕玉,梁君荣等.植物生理学通讯,2007,43(2:3498陆开宏,林霞,钱云霞.中国水产科学,2000,7(1:209曹春晖,孙世春,麦康森等.青岛海洋大学学报,2000,30(7:42810李荷芳,周汉秋.海洋与湖沼,1999,30(1:3411蒋霞敏,郑亦周.水生生物学报,2003,27(5:24312付华,王钦,周志宇等.草地学报,1997,5(3:20513曹淑兰,关紫烽,蔡云萍.质谱学报,1999,20(1:7014舒妙安.浙江大学学报,2000,27(4:43315邓青,张小梅.云南民族学院学报(自然科学版,2003,12(1:3716付松,徐先顺,向奋飞.中国卫生检验杂志,2005,15(9:104217吴惠勤,黄晓兰,林晓珊等.分析化学,2007,35(7:99818G uillard R R L,Ryther J H.Can J M icrobiol,1962,8:22919A H E l2Hamdy,W W Christie.J Chromatogr,1993,630(9:438