缓冲液的配制方法.docx

1、缓冲液的配制方法核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法50XTAE Buffer (pH 8.5)组份浓度 2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中Tris242 gNa2EDTA2H2O37.2 g2向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解3.加入57.1 ml的乙酸，充分搅拌。4.加去离子水将溶液定容至I L后，室温保存。10XTBE Buffer (pH8.3)组份浓度 890 mM Tris-硼酸，20 mM EDTA配制量 1 L配制方法I.称量下列试剂，置于I L烧杯中。Tris108 gNa2EDTA2H2O7

2、.44 g硼酸55 g2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。10MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer组份浓度 200 rnM MOPS，20 mM NaOAc, 10 mM EDTA 配制量 1 L配制方法 1.称41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。2.加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解3.使用2 N NaOH调节pH值至7.0。4.再向溶液中加入下列试剂。1 M NaOAc(DEPC 处理)20 ml0.5 M EDTA(pH8.0)(DEPC 处理)20 ml5.用DEPC处理水将溶液定容至1 L6.用0.45

3、 m滤膜过滤除去杂质。7.室温避光保存。注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用溴乙锭 (10 mg/ml)组份浓度配制量配制方法10 mg/ml溴乙锭100 ml1.称量1 g溴乙锭，加入到100 ml容器中。2.加入去离子水100 ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/mlo注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作Agarose 凝胶配制方法 1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液（通常是0.5来BE或1 XTAE）。2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶 中。3. 加入一定量的

4、电泳缓冲液（总液体量不宜超过锥形瓶的 50%容 量）。注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中 加热熔化琼脂糖。加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。 小心摇动锥形瓶。使琼脂糖充分均匀熔化。此操作重复数次，直 至琼脂糖完全熔化。必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长， 每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。熔化琼脂糖时，必须 保证琼脂糖充分完全熔化，否则，会造成电泳图像模糊不清。5.使溶液冷却至60 C左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液 （终浓 度0.5 g/ml）。并

5、充分混匀。注：溴乙锭是一种致癌物质。使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好 手套。6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶 厚度 一般在35 min之间。7.在室温下使胶凝固（大约30 min1 h），然后放置于电泳槽中进行 电泳。注：凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在 4C下保存， 一 般可保存25天。琼脂糖凝胶浓度与线形 DNA的最佳分辨范围琼脂糖浓度最佳线形DNA分辨范围（bp）0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,0006 xLoading Buffer(DN

6、A 电泳用)组份浓度 30 mMEDTA36%(V/V)Glycerol0.05%(W/V)Xvle ne Cya no IFF0.05%(W/V)Bromophe nol Blue配制量 500 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于500 ml烧杯中EDTA4.4gBromophe nol Blue250 mgXyle ne Cya nol FF250 mg2向烧杯中加入约200 ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解。3.加入180 ml的甘油(Glycerol)后，使用2 N NaOH调节pH值至7.04用去离子水定容至500 ml后，室温保存。10 Loading Buffer (RNA

7、电泳用) 组份浓度10 mMEDTA50%(V/V)Glycerol0.25%(W/V)Xyle ne Cya no IFF0.25%(W/V)Bromophe nol Blue配制置 10 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于10 ml离心管中0.5 M EDTA(pH8.0)200 UBromophe nol Blue25 mgXyle ne Cya nol FF25 mg2.向离心管中加入约4 ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解3加入5 ml的甘油(Glycerol)后，充分混匀。4.用 DEPC处理水定容至10 ml后，室温保存。四、核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法20X

8、SSC组份浓度 3.0 M NaCl，0.3 M Na3citrate2H2O(柠檬酸钠) 配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于I L烧杯中。NaCl175.3 gNa3citrate2H2O88.2 g2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3滴加14 N HCl，调节pH值至7.0后，加去离子水将溶液定容至1 L。4.咼温咼压火菌后，室温保存。20SSPE Buffer组份浓度 3.0 M NaCl，0.2 M NaH2PO4，0.02 M EDTA 配制量 1.L配制方法 1.称量下列试剂，置于I L烧杯中。NaCl175.3 gNaH2PC4 H2O27.6

9、gNa2EDTA2H2O7.4 g2向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3.加 NaOH 调节 pH 值至 7.4（约 6.5 ml 的 10 N NaOH）。4.加去离子水将溶液定容至I L。5.咼温咼压火菌后，室温保存。50 X Denhardt 溶液组份浓1%(W/V)Ficoll 400（菲可400/水溶性聚蔗糖400）；1%(W/V)Pol yviny Ipyrrolido ne（聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮）1%(W/V)BSA配制量 500 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于500 ml烧杯中Flcoll 4005 gPoLy vlny Ipyrrolido ne5

10、gBSA5 g2.加去离子水约400 ml,充分搅拌溶解3.加去离子水将溶液定容至500 ml。4.用0.45 m滤膜过滤后，分装成每份25 ml5.-20 C 保存。0.5 M 磷酸盐 Buffer组份浓度 0.5 M Na2HPO4。配制量 I L配制方法 1.称量134 g NQHPO47H2O置于I L烧杯中。2.加入约800 ml的去离子水充分搅拌溶解。3加入85%的H3PO4（浓磷酸）调节溶液pH值至7.24.加去离子水定容至1 L。5.咼温咼压火菌后，室温保存。Salmon DNA （鲑鱼精 DNA）组份浓度 10 mg/ml Salm on DNA配制量 约100 ml配制方法

11、 1.称取鲑鱼精DNA 2 g置于500 ml烧杯中，加入约200 ml的TE Buffer。2用磁力搅拌器室温搅拌24 h，溶解后加入4 ml的5 M NaCl，使 其终浓度为0.1 M。3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。4.回收水相溶液后，使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约 20次,以 切断DNA。5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。6离心回收DNA后，溶解于100 ml的去离子水中。测定溶液的OD260 值。7.计算溶液的DNA浓度后，稀释DNA溶液至10 mg/ml。8.煮沸10min后，分装成小份（1 ml/份）。-20 C保存。9.使用前在沸水浴中加热5min后，迅速冰浴冷却

12、。DNA变性缓冲液组份浓度 1.5 M NaCl，0.5 M NaOH 配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于I L烧杯中NaCl87.7 gNaOH20 g2向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。预杂交液/杂交液 （DNA杂交用）组份浓6XSSC(或 SSPE) J5XDenhardt s0.5%(W/V)SDS100 /mlSalm on DNA配制置 100 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于200 ml烧杯中20XSSC(或 SSPE)30 ml50 X Denhardt s10 ml10% SDS5 ml10 mg/

13、ml Salm on DNA1 mldH2O54 ml2.充分混匀后，使用0.45 m滤膜滤去杂质后使用预杂交液/杂交液（RNA杂交用）6XSSC(或 SSPE)5XDen hardt s0.5%(W/V)SDS100 g/mlSalm on DNA50%(V/V)Formamlde配制量 100 mL配制方法 1.称量下列试剂，置于200 ml烧杯中20XSSC或 SSPE)30 ml50 x Denhardt s10 ml10% SDS5 ml10 mg/ml Salm on DNA1 mlFormamide (甲酰胺)50 mldH2O4 ml2.充分混匀后，使用0.45 m滤膜滤去杂质

14、后使用膜转移缓冲液(Western杂交用)组份浓度 39 mM Glycine, 48 mM Tris , 0.037%(W/V)SDS , 20%(V/V)甲醇 配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于I L烧杯中。Glyc ine2.9 gTris5.8 gSDS0.37 g2.向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3.加去离子水将溶液定溶至800 ml后，加入200 ml的甲醇4.室温保存。TBST Buffer(Western 杂交膜清洗液)组份浓度 20 mM Tris-HCl，150 mM NaCI，0.05%(V/V)Tween 20 配制量 1 L配制方法

15、1.称量下列试剂，置于I L烧杯中。NaCl8.8 g1 M Tris-HCI(pH8.0)20 ml2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解3.加入0.5 ml Tween 20后充分混匀。4.加去离子水将溶液定容至l L后，4G呆存。封闭缓冲液(Western杂交用)组份浓度 5%(W/V)脱脂奶粉/TBST Buffer配制量 100 ml配制方法 1.称5 g脱脂奶粉加入到100 ml TBST Buffer中，充分搅拌溶解 2.4C保存待用(本封闭液应该现配现用)。五、实验室常用培养基的配制方法Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg/ml)组份浓度 100 m

16、g/ml Ampicillin配制量 50 ml配制方法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至 50 ml3.用0.22 m过滤膜过滤除菌。4.小份分装（1 ml/份）后，-20G呆存。IPTG（异丙基叩-D-硫代半乳糖苷）（24 mg/ml）组份浓度 24 mg/mL IPTG配制量 50 mL配制方法 1.称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至 50 ml3用0 22 m过滤膜过滤除菌。4小份分装（1 ml，份）后,-20 C保存。X-Gal （20 mg/ml）

17、组份浓度 20 mg/ml X-Gal配制量 50 ml配制方法 1.称量I g X-Gal置于50 ml离心管中。2.加入40 ml DMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后，定容至50 ml3.小份分装（1 ml/份）后，-20C避光保存。I D拉差甘LB培养基组份浓度 1%（W/V）Tryptone（胰蛋白胨），0.5%（W/V）Yeast Extract（酵母提取物），1%（W/V）NaCI配制量 1 L配制方法 1称取下列试剂，置于l L烧杯中。Trypt one10 gYeast Extract5 gNaCl10 g2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3.滴力卩5 N N

18、aOH（约0.2 m1），调节pH值至7.0。4.加去离子水将培养基定容至1 L o5咼温咼压火菌后，4。C保存。LB/Amp培养基 组份浓度1%(W/V)Trypt one0.5%(W/V)Yeast Extract1%(W/V)NaCl0.1 mg/mlAmpicilli n配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中Trypt one10 gYeast Extract5 gNaCl10 g2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3.滴加 5 N NaOH（约 0.2 mL）。调节 pH 值至 7.0。4.加去离子水将培养基疋谷至1 L o5.咼温咼压火困后，冷却至室

19、温。6.加入 1 ml Ampicillin(100 mg/ml)后均匀混合。74C保存。TO捋崇甘TB培养基1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17mMKH2PO472mMK2HPOa配制量 1.L配制方法 1配制磷酸盐缓；中液(0.17 M KH2PO4, 0.72 M K2HPd)100 ml。 溶解2.31 g KH2PO4和l2.54 g K2HPO4于90 ml的去离子水中，搅拌溶解 后，加去离子水定容至100 ml,咼温咼压火菌2.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Trypt one12 gYeast Ex

20、tract24 gGlycerol4 m3.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。4.加去离子水将培养基定容至1 L后，咼温咼压火菌。5.待溶液冷却至60C以下时，；加入100 ml的上述灭菌磷酸盐缓冲 液。6.4C保存。TB/Amp培养基组份浓度1.2%(W/V)Trypt one2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17 mMKH2PO472 mMK2HPO40.1 mg/mlAmpicilli n配制量 1 L配制方法 1.配制磷酸盐缓冲液(0.17 M KH2PO4，0.72 M K2HPO4)100 ml。溶解2.31 g KH2PO4,

21、和 12.54g K2HPO4于90 ml的去离子水中，搅拌溶解后，加去离子水定容至 100 ml，咼温咼压火菌。2.称取下列试剂，置于l L烧杯中Trypt one12 gYeast Extract24 gGlycerol4 ml3.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。4.加去离子水将培养基定容至I L后，咼温咼压火菌。5.待溶液冷却至60C以下时， 加入100 ml的上述灭菌磷酸盐缓冲 液。6.均匀混合后4G呆存。SOB培养基组份浓度2%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract0.05%(W/V)NaCI2.5mMKCI10 mMMgCl2配制量 1

22、L配制方法 1.配制9 250 mM KCI溶液。在90 ml的去离子水中溶解I.86 g KCI后，定容至100 ml。2.配制2 M MgCl2溶液。在90 ml去离子水中溶解19 g MgCl2后，定容至100 ml,高温高 压灭菌。3.称取下列试剂，置于l L烧杯中Trypt one20 gYeast Extract5 gNaCI0.5 g4.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。6.滴加5 N NaOH溶液（约0.2 m1），调节pH值至7.0。7.加入去离子水将培养基定容至l Lo8.高温高压灭菌后，4G保存。9.使

23、用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。SOC培养基组份浓度2%(W/V)Trypt one0.5%(W/V)Yeast Extract0.05%(W/V)NaCI2.5 mMKCI10 mMMgCl220 mMGlucose配制量 100 mL配制方法 1.配制9 l M Glucose溶液。将18 g Glucose溶于90 ml去离子水中，充分溶解后定容至100 ml。 用0.22 即滤膜过滤除菌。2.向I 00 ml SOB培养基中加入除菌的1 M Glucose溶液2 ml，均匀混合34C保存2 &T培养基组份浓度 1.6%(WV)Tryptone, 1%(W/V)Y east

24、 Extract 0.5%(W/V)NaCI 配制量 1 L配制方法 1称取下列试剂，置于l L烧杯中。Trypt one16 gYeast Extract10 gNaCl5 g2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解3.滴加5 N NaOH，调节pH值至7.0。4.加去离子水将培养基定谷至1 L o5.咼温咼压火菌后，4C保存。 bx broth组份浓度 2%(W/V)Tryptone ， 0.5%(W/V)Y east Extract ， o5%(W/V)MgSO4 7H2O配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Trypt one20 gYeast Extrac

25、t5 gMgSO4 7H2O5 g2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解3.滴加1 N KOH。调节pH值至7.5o4.加去离子水将培养基定谷至1 L o5.咼温咼压火菌后，4C保存。NZCYM培养基 组份浓度0.5%(WV)Yeast Extract0.1%(WV)Casamino Acid (酪蛋白氨基酸)1%(WV)NZ胺0.5%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO4 7Ho配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂。置于l L烧杯中Yeast Extract5 gCasam ino Acid1 gNZ胺10 gNaCl5 gMgSO4 7Ho2 g2.加入约800 ml的去离

26、子水，充分搅拌溶解。3.滴力卩5 N NaOH（约0.2 ml），调节pH值至7.0。4.加去离子水将培养基定谷至1 L o5.咼温咼压火菌后，4C保存。NZYM培养基组份浓度0.5%(WV)Yeast Extract1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO4 7Ho配制方法NZYM培养基除不含Casamino Acid外，其他成份与 NZCYM培养 基相同。NZM培养基组份浓度1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO4 7Ho配制方法 NZM培养基除不含Yeast Extract酵母提取物）外，其他成份与NZYM 培养基相同。一般固体培养基

27、的配制配制方法 1.按照液体培养基配方准备好液体培养基，在高温高压灭菌前，加 入下列 试剂中的一种。Agar（琼脂；铺制平板用）15 g/LAgar（琼脂；配制顶层琼脂用）7 g/LAgarose（琼脂糖；铺制平板用）15 g/LAgarose（琼脂糖；配制顶层琼脂用）7 g/L2.高温高压灭菌后，戴上手套取出培养基，摇动容器使琼脂或琼脂 糖充分混匀（此时培养基温度很高，小心烫伤）。3.待培养基冷却至5060C时，加入热不稳定物质（如抗生素等）， 摇动容器充分混匀。4.铺制平板（3035 ml 培养基 /90 mm培养皿）。LB/Amp/X-Gal/LPTG 平板培 养基 组份浓度1%(W/V

28、)Trypt one0.5%(W/V)Yeast Extract1%(W/V)NaCl0.1 mg/mlAmpicilli n0.024mg/mlIPTG0.04 mg/mlX-GaL1.5%(W/V)Agar配制量 1 L配制方法 1称取下列试剂，置于I L烧杯中Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl10 g2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。3.滴力卩5 N NaOH(约0.2 mL)，调节pH值至7.0。4.加去离子水将培养基定容至1 L后，加入15 g Agar。5.高温高压灭菌后，冷却至60C左右。6.加入 1 ml Ampicillin(100 mg/ml)、1 ml IPTG(24 mg/ml)、2 ml X-Gal(20 mg/mL)后均匀混合。7. 铺制平板(3035 ml /90 mm培养皿)。8.4C避光保存。TB/Amp/X-Gal/LPTG 平板培 养基 组份浓度1.2%(W/V)Trypt one2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17 mMKH2PO472 mMK2HPO40.1 mg/mlAmpicilli n0.024 mg/mlIPTG0.04