单分子测序助力医学研究.docx

1、单分子测序助力医学研究单分子测序助力脆性X综合征的研究创新技巧 美国加州大学戴维斯分校（UC Davis）医学院及Pacific Biosciences公司的研究人员利用单分子实时测序技术，对脆性X综合征的关键基因FMR1中的CGG片段扩增进行了测序。他们在第15届脆性X和早发性认知缺损国际研讨会上公布了他们的研究成果。 脆性X综合征（又称Martin-Bell综合征）是一种遗传性综合征。它导致一系列特征性症状，包括生理、智力、情绪、以及行为上的异常。症状的轻重各有不同。该疾病伴随着X染色体上一段三核苷酸序列（CGG）的扩增。这种扩增导致了一种称为FMR1的蛋白质无法在病人体内表达，而该蛋白质

2、是神经正常发育所必需的。脆性X智力低下（FMR1）基因位于X染色体上，其5非翻译区（5UTR）包含了CGG三核苷酸的重复序列。大部分人的CGG片段重复5-44次。CGG片段的扩增与认知力和生殖功能受损相关。如果一个人含有45-54个重复序列，则被认为是“灰色地带”，而55-200个重复序列被称为前突变，200个以上重复序列则被称为全突变。生物通 中度CGG重复序列扩增（55-200个CGG重复）可导致脆性X相关性震颤/共济失调综合征（FXTAS），一种以意向性震颤、步态共济失调和其他症状为特征的迟发性神经变性疾病1。而高度CGG重复序列扩增（200个CGG重复）可引起转录沉默和FMR1编码蛋白

3、（FMRP）的功能丧失，从而导致脆性X染色体综合征1。 由于目前的测序方法都依赖于大量相同拷贝的读取，因而大量扩增的CGG重复（100）只能生成不连贯的信号（图1）。这阻碍了研究人员获得单碱基分辨率的测序数据。 图1：随着重复扩增数量的增多，生成大量相同的拷贝变得越来越困难。这阻碍了对大部分疾病范围(100次重复)内重复扩增序列的准确测序。 于是，研究人员利用Pacific Biosciences公司的单分子实时（SMRT）测序技术，试图从大量扩增的CGG重复序列中产生高质量的测序数据（图2）。他们首先利用PCR从人类基因组DNA中扩增出带不同CGG重复的FMR1序列，制备出待测文库。随后加上

4、发夹测序接头，生成闭合的环状测序模板。之后利用Pacific Biosciences RS对样品进行测序。最后采用BLASR算法将长读取装配成环状共有序列（CCS），而目标序列的覆盖度至少为3倍。 结果表明，环状共有序列的读取产生了生理相关范围的重复扩增。而对长的重复等位基因的测序能力似乎仅受读长限制。原始读长超过10 kb，使得环状共有序列覆盖了超过750个CGG重复片段。图3：一段CGG重复片段范围内的环状共有序列读取图。接近155个重复的峰是SMRT cell被动上样偏向（passive loading bias）与较小插入片段优势的综合结果。示例：环状共有序列读取包含372个CGG重复

5、。 研究人员认为，通过这种方法，如今能够以单碱基分辨率完整鉴定所有与疾病相关的等位基因，从而有利于疾病的准确诊断。 参考文献1. Oostra, B.A. and R. Willemsen, FMR1: a gene with three faces. Biochim Biophys Acta, 2009. 1790(6): p. 467-77. 2. Eid, J., et al., Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 2009. 323(5910): p. 133-8.Cell：单分子测序揭

6、示惊人的基因组重排科学家们发现，生活在池塘里的单细胞生物Oxytricha trifallax有一种非凡的能力，它们能在交配时将DNA打碎并快速重排这些片段。这项研究发表在上一期的Cell杂志上。Oxytricha的基因重排是一个非常精密的过程，“这是大自然早期一种的复杂化尝试，”文章的资深作者，Princeton 大学教授Laura Landweber说。从实用性的角度看，人们可以将Oxytricha当成模式生物，研究高等动物的染色体重排。在癌症早期，染色体会经历混乱的重排事件，而Oxytricha可以一步步地展现这一过程。这项研究中的Oxytricha基因组是通过PacBio单分子测序完成

7、的，Pacific Biosciences公司开发的这一技术可以实现超长的测序读取。Landweber介绍道，Oxytricha与其它微生物截然不同，Oxytricha细胞大约是人类细胞的十倍大，而且拥有两个细胞核。体细胞核含有5%的遗传信息，有转录活性，负责调节细胞的内部活动。而生殖系细胞核保存着要传递给下一代的全部遗传信息，没有转录活性。研究显示， Oxytricha在发育过程中，能通过大规模的程序化DNA重排，将生殖系细胞核转变为体细胞核。事实上，Oxytricha交配只是为了交换DNA。在营养充足的时候，Oxytricha主要采取无性繁殖，不断地有新细胞出芽。在营养匮乏的时候，两个Ox

8、ytricha发生融合并分享遗传信息（交配），拆散并重排生殖系细胞核的基因和DNA，共同构建拥有一套新染色体的体细胞核。这一过程能让Oxytricha焕发青春活力，也提高了遗传物质的多样性， Landweber说。在Oxytricha的交配过程中，生殖系细胞核选出大约225,000个小DNA片段，来构建新染色体。Landweber实验室之前的工作表明（2012年的一篇Cell文章和2008年的一篇Nature文章），上一代Oxytricha的数百万非编码RNA引导着上述过程，它们以正确的顺序标记和分选DNA片段。此外，Oxytricha庞大的基因组也令人印象深刻，Landweber说。2013

9、年她的团队发现，这种生物的体细胞核含有大约16,000染色体，这些染色体大多只含有一个基因。Oxytricha的独特遗传学机制为DNA提供了很好的保护，有利于将强健的遗传物质传递下去。正因如此，这种生物才能够广泛分布在世界各地。推荐原文：The Architecture of a Scrambled Genome Reveals Massive Levels of Genomic Rearrangement during DevelopmentPacbio RS II 测序平台一，原理1. 用4种荧光分别标记4种dNTP2. 在测序芯片的底部做出许多用与入射光波长相应的小孔，特定的孔径保证了入

10、射光在小孔中只以走很短的矩离。只够照到正好与酶在相互作用的荧光dNTP底物3. 把聚合酶锚定在测序芯片的底部4. 让DNA链与酶结合，进行测序5. 测序时，荧光dNTP与酶+DNA模板型成复合物，短暂结合6. 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，荧光被检测到7. 酶反应过程，一方面使链延伸，同时使dNTP上的荧光基团脱落8. 聚合反应持续进行，测序同时持继进行二，优点：1.测长很长，主力的测长可以达到8kb，见下图2.可以直接测出碱基修饰，当聚合酶遇到模板上甲基化的A、C等碱基时，聚合的速度明显变慢，并且光谱特征发生改变。这使直接测甲基化变得很容易，见下图：3.对GC含量的偏向性小，可以轻松读到

11、高GC的区段，下图中的紫色曲线就是PacBio的覆盖度。从本质上说，是因为建库中没有PCR过程，所以也就没有因为PCR而引入的GC bias4.测序速度快，上机时，1秒钟测3个碱基。3个小时可以完成一个run。上机前的建库，1天完成，与Illumina或Ion Torrent的建库时间基本持平。所以，整体上，1天建库，1天上机，1天数据分析，3天可以走完一个完整流程三，应用：1， 动植物复杂基因组测序 (1)杂合基因组：杂合基因组主要指杂合率高于0.5%的二倍体基因组，如大部分水产类和昆虫等；(2)高重复基因组：主要指重复序列比例高于50%的二倍体基因组，大部分林木；(3)超大基因组：基因组大

12、小大于3G，甚至是10G以上的物种，如两栖类，部分林木；(4)多倍体基因组：如四倍体、六倍体植物等。2， 真菌基因组完成图 (1) 适用于所有真菌菌株； (2) 尤其适合超高GC/超低GC真菌; (3) 其它用传统方法测序比较困难真菌； (4) 真菌基因组草图或精细图补洞。3， 细菌基因组完成图(1) 普通细菌快速完成图构建； (2) 尤其适合超高GC/超低GC细菌; (3) 其它用传统方法测序比较困难细菌菌株通过采用第三代测序技术，直接进行细菌基因组的完成图绘制。4， BAC克隆完成图通过PacBio RS平台进行单分子实时测序，可以快速得到超长读长。再加大测序深度，PacBio序列可以产生

13、非常均一覆盖度，在大部分目标区域内，可以接近100%的覆盖度。这种方式对于有超高GC含量、超低碱基复杂度等BAC克隆非常具有优势。根据PacBio公司提供的Poster,由1Pacific Biosciences公司和University of Washington, Seattle对人类基因组一个约1.6Mb的片段，总共8个BAC克隆进行了PacBio测序，对比了Illmina测序，总体上得到了非常好的效果。5， 从头组装（DE Novo Assembly）PacBio RS平台是目前唯一能完成完整基因组组装，结构测定和基因分型的微生物测序平台。该平台可以用PacBio数据独立完成微生物基因组的完整拼接，也可以将PacBio长读长数据和二代测序短读长数据进行混合拼接完成基因组。6，甲基化检定SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲，依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时，脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶【1】。【1】参考资料：