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1、草地土壤施加乙酸盐对和细菌真菌有关的土壤呼吸N2O排放和总N转化的影响草地土壤施加乙酸盐对和真菌、细菌相关的土壤呼吸，N2O排放量和总N转换影响R.J. Laughlin c,*,T.Rttingb,C.Mller c，*,C.J.Watsona, R.J. Stevensa摘要：在生长季节将有机碳以牛的粪便或肥料的形式施加到草地土壤中是一个正常的农业实践。增加有机碳的使用量预期可以改变在草原土壤的内部N循环和微生物群落，特别是真菌-细菌的比例。在这里，我们现在做一个15N的示踪研究，旨在探讨在增强的有机碳源的作用下真菌和细菌的氮素转化新结果。我们在土壤中施用在实验室培养的15N标记化肥，分为

2、添加醋酸和不添加醋酸两个处理。此外，我们使用特定的微生物抑制剂，选择性地抑制真菌或细菌。培养的数据通过15N跟踪基于蒙特卡罗抽样模型技术来计算氮素转化总速率。我们的研究结果表明，真菌是主要的温带草原土壤中进行氮素转化的生物体。增强土壤有机碳的供应，可以刺激矿化-同化的周转速率及异养硝化速率，这和真菌活性有很大的相关性，表明真菌可能在土壤中的增强的C供应中发挥一个越来越重要的作用。此外，我们表明，真菌是生产N2O的占主导地位的生物体。增强有机碳的供应会增加真菌活性，因此可能会增加土壤和环境中的N2O排放量。关键词：氮素初级转化过程；温带草地；微生物群落；真菌-细菌比；15N; N2O1.引言牛的

3、粪便给土壤提供了一个现成的碳（C）源，在作物的生长季节将其与矿质肥料一同施到农田土壤中（MAFF, 1998）。如爱尔兰这样以生产农业为主的国家，应用牛的粪便可能创造对于反硝化和氮氧化物（N2O）这是一个重要的温室气体产生的理想的条件。关于农田N2O排放量测定的研究表明，与单独施用矿物氮肥相比，矿物氮（N）化肥加有机肥导致更高的氮损失(Bouwman,1990; Granli and Bckman, 1994)。大田试验研究表明，在施用牛的粪便后的几天里，来自肥料的硝酸盐（NO3-）转化的N2O的排放量大大增加( McTaggart et al., 1997; Clayton et al.,

4、1997; Stevens and Laughlin, 2001, 2002 )。家畜粪便中含有挥发性脂肪酸VFA（乙酸，丙酸和酪酸等）是一种可以被反硝化细菌利用的C源(Paul et al., 1989)。然而，研究人员发现真菌也可以进行反硝化作用(Ruzicka et al., 2000 )，而且对N2O的产生和排放的贡献很大(Laughlin and Stevens, 2002 )。在粪便中脂肪酸的浓度大约是1-26gVFA kg-1有机质(Cooper and Cornforth, 1978;Paul and Beauchamp, 1989)。Paul and Beauchamp（19

5、89）的研究表明，牛的粪便中VFA-C占水溶性C的49.1%。在所有牛的粪便中，乙酸在VFA中占了最大的比重，其次是丙酸盐和丁酸盐。而且，在土壤( Paul and Beauchamp, 1989)、污泥(Blaszczyk et al., 1980)和农业废水( McCarty et al., 1969)中，反硝化细菌相对于多糖而言，乙酸作为C源的利用效率更高。本实验采用15N示踪技术与微生物抑制剂结合的方法。15N模型(Mller et al., 2007 )用于研究有机C的添加对于草地土壤初级转化速率的影响；乙酸作为牛的粪便中主要的VFA用于筛选反硝化细菌的易利用C源。2.材料和方法2.

6、1研究地点和试验设计我们的实验重点在永久性草地土壤中添加乙酸作为C源对细菌和真菌的反硝化过程和初级氮素转化速率的影响。真菌抑制剂为放线酮（环己酰亚胺），细菌抑制剂为链霉素，用于区分两种微生物群落。土壤取自北爱尔兰农业研究所，希尔斯伯勒，下来县的气候适宜的（0-10cm）草地土壤（pH6.3，有机C4.9%，风干土1.2gg-1）( Laughlin and Stevens,2002 )。过6mm筛，取60g（烘干土重）于用酸冲洗过的500ml的玻璃瓶中。在试验开始前土壤中含0.19 m mol NH4+-N g-1烘干土和0.55 m mol NO3-N g- 1烘干土重。用parafilm封

7、口膜封口，阻止水分流失但可以气体交换。在4下保存16h。抑制剂（放线酮和链霉素分别为3mgg-1）以12ml液体的形式添加到土壤中。15N处理时添加相同的2.5mlN（NH4+和NO3-的浓度分别为3.15umolNg-1）到土壤中。15N处理有三个，分别是NH415NO3, 15NH4NO3和15NH415NO3。标记15N的丰度是60 %原子百分超。乙酸以三水乙酸钠的形式加入到土壤中，加入2.5ml溶液，可以提供100umolCg-1烘干土（施用粪便后土壤中的醋酸浓度）。乙酸以三水乙酸钠的形式加入到土壤中，用NaOH调节乙酸溶液的pH为7，土壤容重为0.95gcm-3，用去离子水控制样品土

8、壤含水量为75%WFPS。在加入乙酸后的3,6,12,24,48,72,96和120h后采集气体，测定N2O,CO2的浓度以及N2O的15N丰度，采集气体之后测定土壤中NH4+ 、NO3-的浓度及15N的丰度，测定方法根据Stevens and Laughlin (1994) 和 Laughlin et al. (1997) 。2.2.土壤提取物 每个罐子的提取方法根据Stevens and Laughlin (1995)。每个罐子的土壤用2M KCl（土壤和KCl的比例为1:1）转移到振荡器里。用足量的2M的KOH调节pH为8以阻止亚硝酸盐和有机N混合物反应(Stevens and Laug

9、hlin, 1995)。在混合1min后，悬浊液离心5min，上层清液通过GF/D和GF/F玻璃纤维纸(Whatman Interna-tional Ltd., Maidstone, UK)。土壤提取物储存于4，于2天内测定NH4+ 、NO3-的浓度及15N的丰度。2.3.矿质N浓度和丰度的测定用KCl提取的NH4+ 、NO3-的浓度用间隔流动分析仪测定(Technicon Random Access Automated Chemistry System 800+, Bran and Luebbe,Norderstedt, Germany)。硝态氮的浓度在用Cd还原为亚硝态氮后用萘二胺方法测定

10、，铵态氮用靛酚蓝比色法测定。NH4+ 、NO3-的15N的丰度的测定方法是转化为N2O后用同位素比率质谱仪测定（IRMS）。从NO3-产生N2O是基于在酸性条件下NO2-和羟基氨被Cd还原为NO3-和N2O的反应(Stevens and Laughlin,1994)。铵态氮产生N2O包括被硫酸吸收的氨气的扩散阶段和NaOBr氧化(NH4)2SO4的氧化阶段，N2O就是这两个阶段的副产品(Laughlin et al.,1997)。以含有放线菌酮举例，在扩散阶段中用pH为8的磷酸缓冲液代替MgO在3天内可以阻止放线菌酮的水解( Kornfield and Jones,1948)产生自然丰度的氨气

11、，就不会稀释NH4+库的丰度。2.4.15N示踪分析工具15N转化模型（图1）被开发用于永久草地的初级N转化速率的研究(Mller et al., 2004 )。不同的模型有不同数量的氮素转化过程和和可测定的N库。被选择的最少氮素转化过程的数量需要足够的模拟数据来决定( Mller et al., 2007 )。最终模型包含6个N转化过程：M N rec，难利用有机氮的矿化为铵的过程；MNlab，易利用有机氮矿化为铵的过程；INH4，铵态氮同化为易利用有机N；ONH4，NH4+氧化为NO3-；ONrec，难利用有机氮氧化为NO3-（异养硝化过程）和INO3，NO3-同化为难利用有机N。所有氮素

12、转化过程的计算，除了MNlab为一级反应外，都是零级反应。初级反应速率的计算是通过同时的模拟不同氮素转化过程的动力学参数而得到。个别参数的设置决定了在添加C源和抑制剂处理后（共有6个处理）的整个实验过程。通过模型得到的数据会和NH4+、 NO3-以及他们各自的15N丰度和三个处理的丰度的观察值（平均值标准差）存在差异(Mller et al., 2004 )。参数的优化根据马尔科夫链蒙特卡洛随机采样方法（MCMC-MA）( Mller et al., 2007 )。2.5.需要用到的统计学方法在15N示踪模型中运用的最优化技术基于每一种模型参数的概率密度函数（PDF）定义的，这些参数包括计算的

13、平均值和标准差。另外，最优化技术允许实际上是零的、可以因此排除的参数( Mller et al., 2007 )。拿MNlab来说，它服从一级反应，平均速率通过集和整个实验不同时间段的总N转化率计算(Rtting and Mller, 2007)。由于这个15N跟踪模型的迭代高数与统计测试结果进行比较是不合适的( Yoccoz,1991)，因此，我们测试之间的显著差异模型的参数不同的C供应，通过调查，如果可信区间（CI）重叠。我们假设，如果没有重叠99% CI则P 0.01 ，如果没有重叠的95 % CI则P 0.05和如果没有90% CI重叠则P 0.1。对浓度和NH4+和NO3-的15N富

14、集与抑制剂处理之间的显著差异进行了方差分析（ANOVA Genstat 5 3.1版）( Lawes Agricultural Trust, 1993 )。当效果显着时，手段之间的最小显著差异（LSD）计算为P = 0.05。图1.在不同C供应和微生物抑制剂下的、用于气候适宜草地土壤的、计算N初级转化速率的15N转化模型3.结果3.1. 醋酸对真菌和细菌的呼吸作用的影响添加醋酸促进了在无抑制剂和链霉素处理后12h的呼吸作用，在48h达到最高，随后96小时后下降到初始值（图2a），而不加醋酸处理的呼吸作用保持在200-300n molCO2g-1h-1低水平（图2b）。链霉素处理相对无抑制剂处理

15、在48 h呼吸下降13%，而放线菌酮完全抑制二氧化碳产生表明，真菌对于醋酸呼吸作用占主导地位。图2. 醋酸对真菌和细菌的呼吸的影响：（a）加醋酸，（b）无醋酸另外。LSD是比较任何两个手段的最小显著的差异在P = 0.053.2. 醋酸对真菌和细菌产生N2O的作用没有醋酸的处理N2O排放量不显著异于零。醋酸增加N2O排放通量在无抑制剂处理的48h达到最大值2.2 nmol N2Og-1h-1（图3）。96小时后，排放通量下降到初始值。N2O排放量在高峰期时，链霉素抑制了50N2O的产生和放线菌酮抑制96N2O的产生。Arah的方程（1997）被用来计算来自标记NO3-库的的N2O的排放通量百分

16、数（dD）以及该库的15N原子百分数（aD）。只有NO3-库被标记时才能获得dD 和aD的有效值，此时，N2O排放显著。因此，只有不加抑制剂和链霉素的NH415NO3处理才能计算dD 和aD的数值。dD 的平均值为0.97，aD的平均值为0.50（15N的丰度为50%）。图3.醋酸对真菌和细菌的N2O产生的影响。LSD为任意两个手段之间的最小显著差异P=0.05。注意：无醋酸处理N2O排放量为零，无统计学不同，因此不显示3.3.醋酸对初级矿质N转化的作用表1. 微生物酶抑制剂和醋酸在不同标记的情况下，在时间尺度下对NH4+和NO3-库作用的差异（ * P 0.001; NS不显著的影响）在添加

17、醋酸和无抑制剂的情况下，在培养阶段（见表2）NH4+的体积从3.09下降到0.60umol N g-1。真菌活跃的地方醋酸对土壤NH4+浓度影响最大（例如：不加抑制剂和加链霉素的处理）。链霉素对NH4+的损失影响不大，NH4+库下降的体积大小相似与无抑制剂的处理（表2）。然而，添加放线菌酮后，在减少的NH4+库的体积比无抑制剂的处理小。所有的处理在培养期间，当NH4+库被标记时，NH4+的丰度显著下降（P 0.05）（见表1）。然而，在放线菌酮的添加NH4+库丰度的减少远低于无抑制剂和链霉素的处理。当只有NO3-被标记时，NH4+库的15N百分超（NH415NO3）增加零以上但是不显著（见表1

18、）。表2 .添加醋酸和微生物抑制剂对铵态氮和硝态氮浓度的影响(*P 0.001)在无抑制剂和链霉素处理的培养期间NO3-库的大小增加了25%（P 0.05）（见表2）。放线菌酮减缓硝酸盐积累速率，增加库的大小只有4%（见表2）。这种效果在加醋酸的处理中是最明显的。NH415NO3处理，在无抑制剂和链霉素处理下NO3-库丰度下降了20%（P0.05）（见表1）。然而，有放线菌酮的处理NO3-库稀释了只有5%。15NH415NO3标记处理NO3库的（表1）丰度在任何抑制剂都没有显著改变。在无抑制剂和链霉素的处理，当NH4+库被标记（15NH4NO3），NO3-库的丰度显著增加（P 0.05）（见表

19、1）。加醋酸的处理，放线菌酮完全抑制NH4+氧化，NO3-库保持在自然丰度。添加醋酸引起了大部分氮素转化速率的变化（见表3）。所有三个抑制剂处理时，没有C添加的硝酸盐的固定（INO3）和易利用有机氮的矿化率(MNlab)是零，但“+醋酸”处理显然异于零（除应用链霉素后的INO3）（表3）。不加抑制剂时添加有机C分别会增加INH4、ONrec和总矿化速率（MNrec+MNlab）4.2，1.8和3.6倍，但是会导致ONH4的下降（表3）。施用微生物抑制剂表明真菌和细菌真菌存在显著的不同。当真菌活动（加入链霉素抑制剂）时，添加C会增加INH4和ONrec，但是会降低ONH4，然而当只有细菌活动时，

20、这3个速率都会下降（表3）。矿化作用的变化有一个显著的改变。添加C不会影响细菌对总矿化作用的活性。然而，C的添加会使真菌对总矿化速率的活性（表3）增加3倍。表3. 永久性草地土壤（ugNg-1土d-1）在自然环境（“-Acetate”）和添加（“+ Acetate”）有机碳与微生物抑制剂（微生物的活性基团以斜体表示）相结合的初级氮转化素率。总的氮转化率是平均值标准偏差。(*P 0.01,*P 0.05,。P 0.1, ns = 没有意义)。a.放线菌酮处理b.链霉素处理4.讨论4.1.呼吸作用和N2O的排放通量特异性抑制剂的结果表明，真菌能够通过呼吸作用消耗醋酸。此外，测得的呼吸作用结果表明，

21、真菌在微生物的活动中占主要地位（图1），真菌是占主要的N2O生产者因为放线菌酮几乎完全抑制N2O排放（图2）。对比添加与不添加醋酸的处理发现，当底物C容易获得时，真菌活性显著。观察到有放线菌酮的处理的呼吸率在120h显著增加，这最有可能是幸存的微生物利用放线菌酮为C源的原因( Landi et al., 1993; Stamatiadis et al., 1990)。大多数真菌没有N2O还原酶(Shoun et al., 1992)，所以产生的氮气中N2O占主要地位。事实上，本实验没有探测到土壤中N2的排放（数据未显示）证实了真菌是主导氮气的产生。这一发现和先前在不同的生态系统的研究结果一致(

22、Laughlinand Stevens, 2002; Kinney et al., 2004; Crenshaw et al., 2008 )。几乎所有的N2O都来自于丰度为50 atom%15N的氮库，这与NH415NO3处理在48h后从NO3-库提取物测定的结果一致（表1）。因此，几乎所有的N2O都是NO3-库的反硝化作用的产物。我们的研究结果表明，真菌和轻微程度的细菌使用醋酸作为C源进行反硝化和反硝化真菌比反硝化细菌更有优势。Stevens等在1995年的室内研究发现，好氧微生物消化牲畜的粪便后包含挥发性脂肪酸的浓度比原生态的粪便低得多，他们还发现N2O和N2在消化后的牲畜粪便处理中没有

23、探测到，而在原生态粪便的处理中发现了( Stevenset al., 1995)。因此，经好氧微生物消化原状粪便可以减少草地土壤N2O的排放。4.2.N初级转化速率真菌在确定生态系统过程方面发挥了重要作用(Treseder and Allen, 2000; Johnson et al., 2003)，特别是温带草地的N循环过程(Laughlin and Stevens, 2002; Chapman et al., 2006 )。本研究和以前在草地上得到相同的结论：真菌主导氮素矿化过程(Laughlin et al.,2008)。然而，在本研究中，我们所提供的证据表明：添加一个有机的C源，真菌将

24、会在永久性草地土壤的N转化过程更占优势。和前人的研究成果一致，真菌主导了氮素矿化（MNlab+MNrec）以及NH4+的消耗过程(ONH4+INH4)（表3）。另外，分析表明NH4+的同化过程和NH4+的氧化过程对于添加有机C表现出了不同的反应。如果NH4+同化速率加快，则NH4+的氧化速率下降。Hungate等（2000）发现NH4+同化速率与NH4+的氧化速率程线性关系，而且NH4+的氧化速率对于NH4+同化速率的改变非常的敏感。不加抑制剂的条件下，不添加底物C时，难利用有机N的氧化过程产生的NO3-占总NO3-产生量( ONH4+ ONrec)的31%，而添加底物C时，难利用有机N的氧化

25、过程产生的NO3-占总NO3-产生量的78%。NH4+的氧化是生态系统N的可用性的关键过程(Schimel and Bennett, 2004 )，可能是一个生态系统N限制的指标。人们普遍认为，土壤氮素转化过程以细菌为主(Paul and Clark,1996)。然而，本实验以及最近的研究都表明：真菌是草地土壤中NH4+的氧化主要的微生物(Laughlin et al., 2008 )，是C周转最活跃的生物体(Denef et al., 2007)。另外，我们的研究结果：添加有机C会增加真菌但是不会增加和细菌有关的NH4+的同化过程（表3），表明真菌可能有成功的竞争有效铵的潜力。一些研究表明，

26、在某些陆地生态系统中古细菌是主要的NH4+氧化的微生物(Leininger et al., 2006 )，此研究中的抑制剂（链霉素和放线菌酮）不能抑制古细菌，所以不排除在某些N转化过程中有古细菌活动可能性。这也许可以解释为什么初级氮素转换和“细菌”和“真菌”有关并不总是加起来合并后的“细菌+真菌素率（表3）。真菌为主的土壤有低C的损失和较高的碳同化率(Beare et al., 1992)，使土壤中微生物群落向真菌转变，从而提高土壤C的存贮。其他研究已经表明，真菌衍生的土壤过程和真菌生物量的增加会提升大气二氧化碳的浓度，从而增强土壤中有机碳的输入( Beare et al., 1992; Kl

27、ironomos et al., 1996; Rillig et al., 1999; Hu et al., 2006 )。在这项研究中，我们用醋酸作为C源，因为它是在牛的粪便中占主导地位的VFA (Paul and Beauchamp, 1989)，和用粪便处理后的土壤中初级N转化过程提高有关。在先前的研究中，我们发现，粪便提高总NH4+的氧化作用20倍以上，我们推测，这一增长是由于有机碳的添加促进了NH4+的氧化作用(Mller et al., 2003 )。长期施用粪便的田间试验也得到了相同的结论（结果未发表），然而，在本研究中我们发现，在施用醋酸后NH4+的氧化作用的下降（ONH4，表

28、3）。所以，在粪便中除了乙酸还存在其它的因素能影响NH4+的氧化速率，为了解释这一结果，我们需要考虑所有的NH4+的消耗过程，特别是N的固定作用。在本研究中，应用醋酸刺激了全氮固定，增加了360 %（见表3），而在我们以前的工作中添加粪便只有增加了57%的N固定(Mller et al., 2003 )。这表明，醋酸成分比粪便更能促进N的固定作用，这也说明，在粪便中不是醋酸而是存在其它成分可以抑制N的固定作用或者促进NH4+的氧化作用。丁酸，是已知的在泥浆中另一个抑制微生物的活动的挥发性脂肪酸(Guzer et al., 2001)，因此，粪便的应用后可能一直负责抑制细菌固定，而真菌固定可能仍

29、占上风。然而，我们无法在此研究中确定确切的机制。其他浆料成分以及他们的综合影响需要更详细的研究，以确定粪便对土壤氮素转换的效果。这项研究表明，真菌在微生物活动中占主导地位，真菌，至少在这个永久的草原土壤中是氧化亚氮的主要生产生物体。结果表明，添加一个现成可用的C源，如牛的粪便将加强真菌氮素转化过程。其他浆料的详细成分及其联合作用对土壤氮转化动力学的影响还需要进一步研究。参考文献Arah, J.R.M., 1997. Apportioning nitrous oxide fluxes between nitrification and denitrification using gas-phas

30、e mass spectrometry. Soil Biol. Biochem. 29,12951299.Beare, M.H., Parmelee, R.W., Hendrix, P.F., Cheng, W., Coleman, D.C., Crossley Jr.,D.A., 1992. Microbial and faunal interactions and effects on litter nitrogen and decomposition in agroecosystems. Ecol. Monogr. 62, 569591.Blaszczyk, M., Mycielski,

31、 R., Jaworowska-Deptuch, H., Brzostek, K., 1980. Effects of various sources of organic carbon and high nitrite and nitrate concentrations on the selection of denitrifying bacteria. 1: Stationary cultures. Acta Microbiol. Pol.29, 397406.Bouwman, A.F., 1990. Exchange of greenhouse gases between terres

32、trial ecosystems and the atmosphere. In: Bouwman, A.F. (Ed.), Soils and the Greenhouse Effect. John Wiley & Sons, Chichester, pp. 100120.Chapman, S.K., Langley, J.A., Hart, S.C., Koch, G.W., 2006. Plants actively control nitrogen cycling: uncorking the microbial bottleneck. New Phytol. 169, 2734.Clayton, H., McTaggart, I.P., Parker, J., Swan, L., Smith, K.A., 1997. Nitrous oxide emissions from fertilised grassland: a 2-year study of the effects of N fertilizer form and environmental conditions. Biol. Fe