体外诱导人脐带血间充质干细胞为软骨细胞的初步研究.docx

1、体外诱导人脐带血间充质干细胞为软骨细胞的初步研究体外诱导人脐带血间充质干细胞为软骨细胞的初步研究【摘要】 目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)体外诱导人脐带血间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞分化的可能性。方法 由人脐静脉获得MSCs，纯化培养后用含100ng/ml IGF-1的培养基诱导，扫描电镜鉴定诱导后细胞。结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞，间充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态。IGF-1诱导16天后，MSCs开始呈现软骨细胞特点。结论 人脐带血MSCs可在体外经IGF-1诱导为软骨细胞。【关键词】 胎血 间质干细胞 软骨细胞 细胞分化

2、胰岛素样生长因子 Abstract: Objective To explore the feasibility of mesenchymal stem cells (MSCs) from human umbilical cord blood (HUCB) differentiating into chondrocytes in vitro. Methods MSCs isolated from HUCB with Percoll density gradient solution were culture-expanded because the cells attached and grew

3、 on dishes, then MSCs were induced with 100 ng/ml insulin-like growth factor (IGF ). The differentiated cells were identified by using scanning electron microscope (SEM). Results The HUCB-derived mononuclear cells, when set in culture, gave rise to adherent cells, which exhibited either a fibroblast

4、-like or mesenchymal-like phenotype. 16 days after IGF medium treatment, MSCs in monolayer cultures exhibited a chondrocytic phenotype. Conclusion MSCs can be cultured and differentiated into chondrocytes induced by IGF in vitro. Key words: fetal blood; mesenchymal stem cells; chondrocytes; cell dif

5、ferentiation; insulin-like growth factor I 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为一种多潜能干细胞，因其成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多问题在实验研究和临床应用中的限制，近年来已成为干细胞领域的研究热点。其不仅支持造血系统，还可向中胚层和外胚层来源的组织分化，在一定的实验条件控制下可分化为肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞等13。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能

6、替代骨髓MSCs，并可弥补其缺陷的MSCs来源，已越来越受到各国学者的关注。人脐带血是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞，主要包含造血干细胞和MSCs。脐带血中的MSCs可在体外培养，诱导分化后能成为神经细胞、心肌细胞等4,5。随着组织工程学研究的深入，对于相关功能细胞研究逐渐扩展到干细胞领域，MSCs对软骨组织修复有重要意义，本实验主要探索人脐带血MSCs的分离培养以及分析其向软骨细胞分化的可行性。 1 材料和方法材料主要试剂和仪器：Dulbecco改良培养基、胎牛血清均为HYCLONE公司产品；胰岛素样生长因子-1；Percoll分离液；其它试剂均为国产分析纯试

7、剂。CO2培养箱；AE31型倒置显微镜；Apollo 300型扫描电子显微镜。方法脐带血MSCs的分离培养从无妊娠并发症足月分娩的脐静脉穿刺抽取15ml脐带血，肝素抗凝，加等量磷酸缓冲液稀释，取50ml离心管，先加入15ml密度 g/ml的Percoll梯度分离液，小心加入稀释后的脐带血，2000r/min离心25min后，用吸管吸取分层界面的白色环形絮状物，洗涤离心2次，沉积细胞用含15胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为1106个/ml，接种于25T的培养瓶内，放置在37、5CO2、饱和湿度的培养箱中培养。孵育72h后更换培养基，去除

8、红细胞及其它未贴壁细胞，以后视细胞生长情况平均34天换液1次。脐带血MSCs传代培养MSCs 约于7周相互汇合达到培养瓶底7080的生长表面，此时进行传代培养。倒掉旧培养基，加入2ml 的胰酶消化，作用30s后弃掉大部分，留置少许于瓶中，适当用力振荡培养瓶，整瓶细胞放入培养箱中5min，在倒置显微镜下观察细胞解离程度，以细胞突起缩回，细胞间隙增大，细胞近乎圆形为度，加入含15胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，用吸管轻柔吹打瓶底，收集细胞，洗涤离心，接种于置有盖玻片的24孔培养板中。脐带血MSCs诱导培养取第2代细胞按密度为5104/ml接种于24孔培养板(孔内置无菌盖玻片)中，第2天换液，

9、其中半数培养孔用诱导软骨细胞培养基(15FCS的DMEM含终浓度为100ng/ml IGF-1)进行培养，3天换培养液1次，连续观察细胞生长情况，并于第16天获得细胞，通过扫描电子显微镜进行形态学检测。软骨细胞检测活细胞观察诱导后，每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，特别注意其形态的改变，记录可见变化特征及其出现时间，拍照。扫描电子显微镜观察诱导培养16天时，以磷酸缓冲液轻轻冲洗，戊二醛固定，酒精梯度脱水，室温干燥后表面喷镀金，扫描电子显微镜观察。【摘要】 目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)体外诱导人脐带血间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞分化的可能性。方法 由人脐静脉获得MSCs，

10、纯化培养后用含100ng/ml IGF-1的培养基诱导，扫描电镜鉴定诱导后细胞。结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞，间充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态。IGF-1诱导16天后，MSCs开始呈现软骨细胞特点。结论 人脐带血MSCs可在体外经IGF-1诱导为软骨细胞。【关键词】 胎血 间质干细胞 软骨细胞 细胞分化 胰岛素样生长因子 Abstract: Objective To explore the feasibility of mesenchymal stem cells (MSCs) from human umbilical cord blood (

11、HUCB) differentiating into chondrocytes in vitro. Methods MSCs isolated from HUCB with Percoll density gradient solution were culture-expanded because the cells attached and grew on dishes, then MSCs were induced with 100 ng/ml insulin-like growth factor (IGF ). The differentiated cells were identif

12、ied by using scanning electron microscope (SEM). Results The HUCB-derived mononuclear cells, when set in culture, gave rise to adherent cells, which exhibited either a fibroblast-like or mesenchymal-like phenotype. 16 days after IGF medium treatment, MSCs in monolayer cultures exhibited a chondrocyt

13、ic phenotype. Conclusion MSCs can be cultured and differentiated into chondrocytes induced by IGF in vitro. Key words: fetal blood; mesenchymal stem cells; chondrocytes; cell differentiation; insulin-like growth factor I 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为一种多潜能干细胞，因其成功避开了胚胎干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多问题在

14、实验研究和临床应用中的限制，近年来已成为干细胞领域的研究热点。其不仅支持造血系统，还可向中胚层和外胚层来源的组织分化，在一定的实验条件控制下可分化为肌细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞等13。目前，MSCs主要来源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故寻找一种能替代骨髓MSCs，并可弥补其缺陷的MSCs来源，已越来越受到各国学者的关注。人脐带血是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液，含有丰富的干细胞，主要包含造血干细胞和MSCs。脐带血中的MSCs可在体外培养，诱导分化后能成为神经细胞、心肌细

15、胞等4,5。随着组织工程学研究的深入，对于相关功能细胞研究逐渐扩展到干细胞领域，MSCs对软骨组织修复有重要意义，本实验主要探索人脐带血MSCs的分离培养以及分析其向软骨细胞分化的可行性。 1 材料和方法材料主要试剂和仪器：Dulbecco改良培养基、胎牛血清均为HYCLONE公司产品；胰岛素样生长因子-1；Percoll分离液；其它试剂均为国产分析纯试剂。CO2培养箱；AE31型倒置显微镜；Apollo 300型扫描电子显微镜。方法脐带血MSCs的分离培养从无妊娠并发症足月分娩的脐静脉穿刺抽取15ml脐带血，肝素抗凝，加等量磷酸缓冲液稀释，取50ml离心管，先加入15ml密度 g/ml的Pe

16、rcoll梯度分离液，小心加入稀释后的脐带血，2000r/min离心25min后，用吸管吸取分层界面的白色环形絮状物，洗涤离心2次，沉积细胞用含15胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的DMEM高糖培养基悬浮，调整细胞密度为1106个/ml，接种于25T的培养瓶内，放置在37、5CO2、饱和湿度的培养箱中培养。孵育72h后更换培养基，去除红细胞及其它未贴壁细胞，以后视细胞生长情况平均34天换液1次。脐带血MSCs传代培养MSCs 约于7周相互汇合达到培养瓶底7080的生长表面，此时进行传代培养。倒掉旧培养基，加入2ml 的胰酶消化，作用30s后弃掉大部分，留置少许于瓶中，适当用

17、力振荡培养瓶，整瓶细胞放入培养箱中5min，在倒置显微镜下观察细胞解离程度，以细胞突起缩回，细胞间隙增大，细胞近乎圆形为度，加入含15胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，用吸管轻柔吹打瓶底，收集细胞，洗涤离心，接种于置有盖玻片的24孔培养板中。脐带血MSCs诱导培养取第2代细胞按密度为5104/ml接种于24孔培养板(孔内置无菌盖玻片)中，第2天换液，其中半数培养孔用诱导软骨细胞培养基(15FCS的DMEM含终浓度为100ng/ml IGF-1)进行培养，3天换培养液1次，连续观察细胞生长情况，并于第16天获得细胞，通过扫描电子显微镜进行形态学检测。软骨细胞检测活细胞观察诱导后，每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况，特别注意其形态的改变，记录可见变化特征及其出现时间，拍照。扫描电子显微镜观察诱导培养16天时，以磷酸缓冲液轻轻冲洗，戊二醛固定，酒精梯度脱水，室温干燥后表面喷镀金，扫描电子显微镜观察。