酵母单杂交实验方法.docx

1、酵母单杂交实验方法酵母单朵交技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通 过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结 合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白 质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核昔酸序列而无需复杂的蛋白质 分离纯化操作，故在蛋口质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过 酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达 调控的悄况。【实验目的】了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事 项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。【实验原理】

2、酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋口（即转录因子）与DNA顺式作用元件 结合调控报告基因表达的原理来克隆编码U的转录因子的基因（CDNA）。该方法 也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示，将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter, Pmin）上游,Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库时，编码U的转录因子的CDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式 作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报告基因 的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。Matchmaker G

3、old Yeast One-Hybrid Library Screening System提供了一个简 单高效的构建cDNA文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用aureobasidin A抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单朵交筛选是从酵母双朵交筛选 发展而来，利用单杂交筛选可以对CDNA文库进行筛选直接获得与U的顺式作用元件相结合的蛋口质。The Matchmaker Gold One-Hybrid Library Screeningprocess 主要包括以下步骤:1将己知序列（bait）克隆到pAbAi载体。2 PBait-AbAi质粒转化YlHGold酵母菌株，使其与酵母基因

4、组发生重组，生成bait/reporter 酵母菌株。3检测YlHGold bait菌株AbM基因的本底表达水平。4合成cDNA并通过cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母进行细胞内同源组筛选cDNA文库。5筛选结果的验证和分析。【实验准备】1仪器设备微量取液器（ L； 20 L； 50 L； 100 L； 200 L； 1000 L）、PCR 仪、 低温离心机、台式离心机、CHROMA SPIN+TE-400纯化柱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属 浴、酒精浴、无菌接种环、10 cm培养皿、25 cm培养皿等。2实验材料YlHGol

5、d酵母株、TOP10大肠杆菌菌株、各种方法提取的RNA、pGADT7-Rec质粒和pBait-AbAi质粒等。3主要试剂(1)(2)Advantage 2 PCR 试剂盒、Easy Yeast Plasmid Isolation 试剂盒、MatchmakerInsert Check PCR Mix 1、Matchmaker Insert Check PCR Mix 2。各种基础培养基和营养缺陷培养基：minimal SD baser minimal SD agarbase, YPD medium, YPD agar medium, -Leu DO supplement. -Ura DO sup

6、plement,腺昔酸(adwninw), PEG8000, carring DNA, aureobasidin A,LB培养基，氨卞西林。NaCI 溶液()、sodium acetate (3mol/L)、50% PEG、lOXLiAc (1 mol/L)、 10XTE buffer. DTT (100 mmol/L). RNaseH、限制性内切酶。【实验方法】1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建）注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含U的顺式作用元件的一个或多个拷贝, 且插入到pAbAi载体AbA产报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含U的DNA三个以上的首尾连

7、接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核昔酸是最方便可靠的途径。1）设il并合成包含U的序列的两条反向平行的寡核昔酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个U的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。（2）用TE buffer溶解寡核昔酸至终浓度100 mol/L。将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核昔酸最大浓度为注：缓慢退火，有助于双链寡核昔酸的形成。(7)冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 C冰箱备用。 酶切1 L pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。注：回收前，可用琼

8、脂糖凝胶检测是否酶切完全。（11）在连接反应管中加入如下成分:总体积15 L注：如果有必要，可用1 L nuclease-free H20代替寡核昔酸作为阴性对照。（12）将反应体系室温放置连接3 h,转化Ecoli,采用常规方法检测阳性克隆。注：可用酶切或测序进行检测。2质粒转化酵母细胞，生成Bait-Reporter酵母菌株（图）图3 Bait-Reporter酵母菌株生成原理示意图(1)(2)用 BstB I 或者 Bbs I 酶切 2 L pBait-AbAh pMutantAbAi, p53-AbAi 质粒.使其在URAB基因处断开，纯化酶切产物。按 Matchmaker Ywst

9、Transformation System 2 的步骤用 1 I 酶切后的质粒转化YlHGold酵母。稀释每个转化体系至1/101/100、1/1000,分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。3 d后挑取5个单克隆，用Matchmaker Insert CheckPCR Mixl进行PCR检测阳性克隆，用YlHGold的单克隆做阴性对照。(5 在 PCR 管中加 25 IP CR-grade H2OO （6）用干净的枪头轻轻接触酵母单克隆，以获得非常少量的酵母细胞。将枪头伸进PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻止PCR反应的

10、进行。如果加入细胞后水变浑浊，证明加入了过多的酵母细胞。(7) 向每个管中加入25 I Matchmaker Insert Check PCR Mixr混匀，离心。每个PCR管中现已含有如下反应物:95C1 min98C10 s 55C30 sA 30 cycles68C2 min“（8）按下述程序进行PCR反应;注：引物与AbA基因以及URA3下游的YlHGold基因组结合，扩增片段长约kb。URA3图4 PCR检测PBait-AbAi的插入情况正确的PCR检测结果应是:（10）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和P53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura平板上划线培养。30 C孵育3d后，

11、将平板置于4 C保存，即为新构建的 YlHGoldBait/AbAi菌株和pSVAbAi对照菌株。（11）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离心收集菌体，用ImL预冷培养基（100 ml灭菌的YPDA与50 ml灭菌的75%甘油混合）重悬菌体，速冻后与-70 C保存。3检测诱饵菌株Ab基因的表达在不存在捕获物的情况下，山于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵 菌株报告基因的本底表达水平也不相同例如：p53AbAi对照的最低aureobasidinA抑制浓度为100 ng/mio注：酵母单朵交实验成功的前提是没有内源转录因子能够与U的序列结合或 者结合能力非常弱。因

12、此在进行文库筛选之询，检测所构建的诱饵菌株Ab基 因的表达宿况十分重要。所以需要进行实验以确定进行文库筛选时抑制诱饵菌株 报告基因本底表达所需的AbA浓度。分别挑取诱饵克隆和对照克隆，用 NaCi重悬细胞，调节A600至Ij （大约2000个细胞/100 Do（3）在下述培养基上分别涂布100 I重悬后的菌液，30 C培养23d。SDAUra预期结果如下所示:表1 AM，基因预期本底表达结果AbA/ (ng/mL) YlHGoldp53-AbAi克隆数YlHGold pBait-AbAi克隆数Bait dependent（4）在进行文库筛选时，使用AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使用比最低抑制

13、浓度稍高的AbA浓度（高约50-100 ng/mL）,以彻底抑制诱饵菌株的生长。注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表达，可以尝试提高AbA浓度至500-1000 ng/mLo然而，在不存在捕获物的悄况下，如果1000 ng/mL的AbA浓度仍无法抑制基因的表达，那么很可能存在能够识别并与U的序列结合的 内源调控因子，因而该U的序列无法用来进行酵母单杂交筛选。4文库cDNA的合成提取试材总RNA,进行反转录合成cDNAo合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec相同的酶切位点。(1)cDNA第一链的合成准备高质量的poly A和/或总RNA,用human placenta poly

14、 A+RNA作为阳性对 照。注：RNA的质量决定文库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的 RNAo在微量离心管中加入如下反应物:RNA 模板(0 g poly A 和/或20 g 总 RNA)1.01-2CDS III (oligo-dT) or CDS lll (random)弓| 物Deionized H2O (使总体积达到4.0 I)4.0总体积在另外一支管中加入对照cDNA反应物，即RNA使用1 I (1 g) control polyA+RNAo72 C孵育2 min。冰上放置2 min,轻轻混匀，立即加入步骤中的试剂。每一个反应加入如下试剂，轻轻混匀离心。5.0SMAR

15、T M-MIVRT总体积注：步骤中的试剂可在步骤之前加好置于冰上。此步是CDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2 mine如果用的是CDSI咗随机引物，25-30 C保温10 mine如果用的是CDS III引 物，省略此步，进行步骤。42 C保温lOmino加入1 I SMART III oligo,充分混合，42 C保温Ih。75 C保温10 min终止第一链的合成。降至室温，加入1 I RNase H (2U)。1137 C 保温 20 min。12 cDNA第一链合成产物应于-20 C保存，可用3个月。(2) long distance PCR (

16、LD-PCR)合成 cDNA 第二链根据合成cDNA第一链时使用的RNA量，下表给出了进行LD-PCR时最佳的 热循环数。使用的热循环数越少，非特异性PCR产物越少。表2RNA量与最佳热循环数总 RNA/ gLD-PCR反应混合物中加入如下物质(每个样品做2个100 I体系，对照做1个100 I体系):First-strand cDNA (from protocol A)7010Deionized H2O10 X advantage 2 PCR bufferSOXdNT Pmix5RACE引物3卞ACE引物10100Melting solutionSOX advantage 2 polymer

17、ase mix总体积2个循环95C30SX个循环95CIOs 、68C 6 min2个循环68C 5 min按照以下程序进行PCR反应:Y取7 I PCR产物用的琼脂糖凝胶检测，检测时使用1 kb DNA laddero(3) 使用 CHROMASPIN+TE-400 柱纯化 dscDNA为每一个要纯化的cDNA样品准备一个CHROMA SPIN+TE-400柱。将纯化柱翻转儿次，充分悬浮gel matrixo移去柱的顶盖和底盖，将柱放入2 ml收集管中。将柱放入离心机，7006离心5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。将柱放入新的收集管中，把CDNA加到gl matrix的中央，切

18、勿使样品沿柱的内壁流下。注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有小片段CDNA。(6)700 g离心5 min,纯化的cDNA收集到管中。将两个纯化的CDNA样品合并到一管，测量体积。加入V10体积3 mol/L醋酸钠()，混匀。加入倍体积无水乙醇。(10)-20 C 冰冻 Ih。(11)室温，14000 r/min 离心 20 min。小心弃去上清液，切勿碰到沉淀。(13)14000 r/min瞬时离心，去除残留上清液。(14)沉淀于空气中干燥10 min。注：一般干燥至无乙醇味，不可过度干燥，否则很难溶解。(15)用20 I灭菌去离子水溶解沉淀，此CDNA可用来进行同源巫组构建文库。纯化后

19、的cDNA用1%的琼脂糖电泳检测。5构建并筛选酵母单朵交文库(cDNA融合表达文库的构建及筛选)(1)构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测YlHGoidBait/AbAi菌株。注：AbA的浓度根据构建诱饵载体时转入酵母抑制本底表达时的浓度而定。(2) (3按 SMART technology 步骤合成 ds cDNA,其浓度为 2-5 g/20 L。(4)用Yeast Transformation System 2的方法转化酵母，在转化体系中加入如下物质：cDNA 文库转化 YlHGoldBait/AbAi菌株20 I SMART-amplified ds cDNA (2-5 g)6 I

20、p GADT7-Rec (Sma l-linearized) (3 g) YlHGold SVAbAi的转化5 I p53 fragment (125 g)2 IpGADT7Rec, (Smal-linearized) 1 g)将转化体系分别稀释至”10、1/100、1/1000. VlOOOO后，各取100 I涂100 mm平板。文库转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，对照p53转化涂SD/-Leu和SD/Leu/AbA200 平板。将剩余的所有文库转化混合物(约15 ml)涂在150 mm SD/-Leu/AbA平板上，每板涂150 L(7)35d后，通过统计SD/Lui00

21、mm平板上的克隆数U来计算筛选的克隆数。注：所筛选的克隆数至少应该达到1百万，否则会降低筛选到U的产物的可能性。筛选的克隆数=cfu/ml on SD/-Leu X dilution factor X resuspensionvolume (15ml)例如：resuspension volume=15 mlPlating volume=100 I250 colonies grew on the 3/100 dilution on SD/-Leu platesThe number of clones screened=250 cfu/ ml X100 X15 ml= million（8）预期结果

22、阳性对照试验：SDALeu和SD/Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。文库筛选试验：根据SD/Leu平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应大于1百万且SD/-Leu/AbA平板上的克隆数远远少于1百万，阳性克隆数U取决于诱饵序列。6阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的分离（1）阳性克隆重新划线培养，进行表型确认将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重新划线，产生新的单克隆。2-4 d后，选择能够正常生长的克隆进行后续分析。（2）酵母克隆PCR消除重复克隆用 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2 （）进行 PCR.对插入到 pGADT7 载体中的cDNA片段

23、进行扩增。PCR管中加入以下反应物：Matchmaker Insert Check PCR Mix25H2O/Yeast25总体积50按下述程序进行PCR反应:94C1 min98C10 s%68C3 minPCR产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。产物不是单一的条带很正常, 这表明在同一酵母细胞不存在一种捕获载体注：为了确认大小相近的条带是否是同一种插入片段，用Alul或Hae III或者其它常用的限制性内切酶消化PCR产物,产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如果大量的克隆含有同一插入片段，则另取50个克隆进行PCR分析。为了快速验证克隆，PCR产物可经过纯化后用T7引物测序。（3）阳性

24、cDNA质粒的分离获取酵母中文库质粒的分开。与转化的大肠杆菌不同，转化的酵母细胞可以含多种相关质粒，这就意味着 阳性克隆里不只含有能激活Ab报告基因的质粒，还可能含有一种或多种不表 达相互作用蛋白的CDNA质粒。如果不事先将非互作质粒分开出去而直接通过转 化大肠杆菌获取质粒，那么很有可能获取到非相互作用的质粒。为了增加获取阳 性克隆捕获质粒的儿率，可以将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重复涂布2-3 次，每次都挑取单一的克隆进行下一步涂布。从酵母中获取阳性CDNA质粒为了鉴定阳性互作相关的基因，用Easy Yeast Plasmid Isolation Kit ）从酵母中获取阳性质粒。

25、转化E coll并分离阳性cDNA质粒用常用的克隆菌株对阳性cDNA质粒进行克隆，用LB加100 g/ml ampicillin进行选择。（4）鉴别阳性和假阳性互作酵母单朵交筛选可能会检测到假阳性，用以下标准可以区分阳性和假阳性 阳性：正确的诱饵序列和捕获物都是激活报告基因所必需的。假阳性：在诱饵序列突变的悄况下，诱饵仍可以激活Ab报告基因。用下述程序在选择培养基上对阳性和假阳性相互作用进行确认：用 Yeastmaker Transformation System 2 的试剂和 small-scale 转化程序将 100 ng 获取的捕获质粒转化到YlHGoldBait/AbAi和YlHGol

26、dMutant/AbAi菌株中。注：阳性对照和阴性对照实验应该一起进行。I转化混合物1/10和1/100的稀在SDALeu和SD/-Leu/AbA培养基上涂100 释物。30 C恒温培养35d后，预期结果如表所示。表3阳性和假阳性相互作用验证结果A阳性样品选择培养基2mm清晰的克隆酵母菌SD/-Leu有YlHGold诱饵/AbAi+靶SD/-Leu/AbA有酵母菌SD/-Leu有YlHGold突变/AbAiH 靶SD/-Leu/AbA无（或者很小）B假阳性样品选择培养基2mm清晰的克隆酵母菌SD/-Leu有YlHGold诱饵/AbAi+靶SD/-Leu/AbA有酵母菌SD/-Leu有YlHGo

27、ld突变/AbAiH 靶SD/-Leu/AbA有（5）阳性克隆的测序分析一旦相互作用被验证为阳性，就可以测序鉴定捕获载体的插入CDNA片段,验证与GAL4 AD序列融合的开放阅读框（ORF）序列，并与GenBank、EMBL或其他数据库中的序列进行比较。【注意事项与建议】1进行一轮酵母单杂交筛选后，得到的阳性克隆可能非常少或者非常多，在这种悄况下，建议做如下处理。阳性克隆太少：检査所筛选的克隆数是否大于1 million通过阳性对照和阴性对照检査培养基是否正常 重新检测诱饵的最低AbA抑制浓度 试着增加U的序列的拷贝数，通常U的序列的拷贝数为3时，试验效果最好。阳性克隆太多：检查是否使用了最佳AbA抑制浓度；如果使用了 lOOng/mlAbA,使用200 ng/ml的AbA浓度重新筛选 通过阳性对照和阴性对照检查培养基营养缺陷是否正常 可能文库中存在大量能编码与诱饵序列结合蛋口的cDNAo可通过酵母PCR将其 克隆分类，每一类中的代表可用来进行阳性互作分析。2对阳性克隆进行测序之前需进行以下试验。用新鲜的选择性培养基对阳性克隆新划线培养，进行表型确认:酵母克隆PCR,对重复的克隆进行分类；阳性cDNA质粒的分离；（4）阳性和假阳性互作的辨别。