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1、细胞工程知识点陈永勤上课讲义第1章 植物组织培养简介1.细胞工程（Cell Engineering）：在体外对生物的细胞进行生长与分化的调控、遗传重组与改良，使其生产出人类所需要的产品。2.细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的理论基础；验证细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的动力。3.细胞分裂素与生长素的浓度比值决定着愈伤组织根或芽的形成。细胞分裂素/生长素的比值： 高：形成芽；低：形成根；相当：愈伤组织增殖，但不分化。4.植物组织培养在植物性状改良上的应用:.胚培养可克服远源杂交不孕的困难；.花药（花粉）培养可大大缩短育种年限；.原生质体融合技术可克服有性杂交不亲和，创造远源杂种、甚至新

2、的物种；.单细胞培养技术可用于突变体的筛选。第2章 植物组织培养的设施1.培养室所需要的设备：.培养架:培养架的设计既要考虑充分利用培养室的空间，也要考虑取放材料方便。 .加温/降温设备：空调.光照和控光设备。分为光培养室和暗培养室。光培养室常用日光灯照明，并安置控制光照时间的自动开关。2.瓶盖、瓶塞、或者封口膜的透气性能对材料的培养有显著影响，透气性能不好的，容器中湿度高（饱和），容易导致植物材料出现玻璃化（生理病态，植物材料呈水渍状，深绿色，刚脆，无继续培养的价值）第3章 植物组织培养基1.培养基的重要性: 1)植物材料生长的营养来源； 2)调节植物材料生长与分化的主要途径。2.培养基的组

3、成：.水：要求纯净。应用蒸馏水、去离子水，而不用自来水。.无机营养成分： 植物生长发育需要有16种必需元素：大量元素：C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S；微量元素：Fe, Cl, Cu, Mo, B, Zn, Mn。不同培养基的无机盐（特别是大量元素）的浓度差异很大。.有机营养： 有机营养（有机成分）：维生素和氨基酸的总称。 常用：肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1和甘氨酸等。 其它维生素：维生素M（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙等。 其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等.碳源：最常用的糖是蔗糖(sucrose)，但也有时用葡萄糖(glucose)、果糖

4、(fructose)或其它的糖(lactose, maltose)，有时几种糖混用。糖是营养物质，但不是越多越好。培养基中糖的用量大多在1060g/L，一般为2030 g/L。.植物生长物质：植物生长物质是植物激素和植物生长调节剂的总称。植物激素：植物合成的、微量就有显著生理效应的物质。植物生长调节剂：人工合成的、具有植物激素相似作用的物质。.凝固剂：在植物组织培养中，琼脂（agar）是最常用的凝固剂，用量为6-12g/L。另外还有phytagel, Gelrite, 4g/L。 .有机附加物：水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：用量为0.1-10g/L，一般为0.5-3 g

5、/L。椰子汁：100-200ml/L。.其它物质：防止与减缓植物材料褐化的物质：1）抗氧化剂：抗坏血酸（Vc）、L-半光氨酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等。2）吸附剂：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。 活性炭吸附无选择性；改善培养效果、促进生根。 PVP专一吸附酚类物质。3.植物激素在植物组织培养中的作用：生长素：(1) 促进细胞分裂、增殖，导致愈伤组织的形成(2,4-DNAAIAA, IBA)；(2) 控制器官的分化，诱导根的形成。（IBANAAIAA)细胞分裂素:促进细胞分裂、增殖，导致愈伤组织的形成；控制器官的分化，诱导芽的形成和增殖。 赤霉素:赤霉素最显著的作用是促进细胞的伸长，也有打破种子

6、休眠的作用。在植物组织培养中使用赤霉素主要是促进芽或茎的伸长。赤霉素对热不稳定，故不宜用高温法消毒。乙烯:乙烯促进果实成熟，加速植物衰老。植物组织培养极少使用乙烯（乙烯利），相反，而是尽量控制乙烯的产生。 脱落酸:脱落酸是促进植物衰老的激素，植物组织培养很少用。在胚状体（embryoid）的诱导和培养中常常使用脱落酸，促进胚状体的成熟。4.植物激素母液的配制:对于生长素类激素，也可用稀碱助溶；对于细胞分裂素类激素，可用稀酸助溶。激素母液也应在低温下保存。 5.高温消毒时应注意的问题：一定要先排气10 min，否则不能消毒不彻底；高温消毒后，培养基的pH值会下降0.20.5个pH单位；高温消毒过

7、程中，培养基中有些物质会被破坏或发生沉淀。如蔗糖会水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖变成葡萄糖酸等；有些物质甚至几乎完全被破坏，如赤霉素、玉米素等。物质破坏程度与消毒时间和压力有关。6.过滤灭菌法:由于过滤消毒不会破坏培养基的成分和改变培养基的pH值，所以在原生质体培养、单细胞培养时常用过滤消毒法对培养基进行灭菌。如果培养基中要使用一些热不稳定的物质，如ZT、GA3、核黄素等，则这些物质也要用过滤消毒法灭菌。第四章 外植体的表面消毒 外植体(Explant)用于建立无菌培养的起始植物材料。表面消毒(Surface sterilization)（用消毒剂）杀死外植体表面其它生物（主要是细菌和真菌）的过程

8、。1.外植体表面消毒的必要性：植物材料表面都带有细菌和真菌，如消毒不彻底，细菌和真菌会在培养基中迅速生长，占据空间、消耗营养、分泌毒素，使植物材料死亡。因此，接种前对外植体进行有效的表面消毒是建立无菌培养的关键。2.表面消毒的要求：（1）最大限度地杀死细菌和真菌（2）对外植体的毒害要尽可能的小3.常用消毒剂：消毒剂 消毒浓度 消毒时间 效果 优缺点 乙醇 70%-75% 10S-5 min，多1min内 较差 易清洗，但对材料伤害大。 氯化汞 0.1% -0.2%5-30 min 很好 毒性大，难清洗，清洗不够则对材料有残毒效应。 次氯酸钠 1% 有效氯5-30 min 较好 易清洗，对材料的

9、残毒效应小。 双氧水 3% 10-60 min 一般 易清洗，对材料的残毒效应小。 4.外植体的表面消毒消毒步骤：用自来水将材料冲洗干净。将材料上的水擦干，并剪成适当大小（长短）的小块（段）。在70%-75%的乙醇中10-60 S，然后迅速转入到其它消毒剂（氯化汞、次氯酸钠）中，消毒剂中可加入少量表面活性剂（Tween 20或80、家用洗涤剂等），以增加消毒效果。消毒结束后，将材料转入无菌水中漂洗2-8次；将材料的伤口部分切去后，再将其切成适当大小，及时接入到培养基中。5.材料内部污染的控制。表面消毒不能杀死内部的细菌，可尝试下列方法：用分生组织作为外植体；在培养基中加抗菌素（青霉素、卡那霉素

10、、四环素等）；尽量将材料切小，并且每接一个外植体就将接种工具消毒一次，避免交叉感染。第5章高等植物离体再生和无性繁殖有性繁殖（Sexual propagation）:通过两性细胞结合形成的种子进行繁衍后代的方法叫有性繁殖。因为繁殖体是种子，所以又称种子繁殖。无性繁殖（Asexual propagation）:通过植物体一部分（常是营养器官，如芽、根、茎、叶等）繁殖的方法，所以又称营养繁殖（vegetative propagation）。植物的无性繁殖有分株、扦插、压条和嫁接4种方法。植物离体再生(in vitro plantlet regeneration)：在离体条件下，植物外植体（根、茎、

11、叶、花等）形成完整植株。不定芽(adventitious bud): 从外植体不固定的位置形成的芽。体细胞胚胎发生(somatic embryogenesis)：指诱导植物体细胞形成体细胞胚（胚状体）的过程。1.无性繁殖的优缺点： 优点：所繁殖的植株与母株的性状一致； 缺点：繁殖速度有限，特别是当起始材料少时，不能快速推广优良植株；容易传播病害。2.植物离体再生的途径：顶芽与侧芽再生途径；不定芽再生途径；胚状体再生途径；拟原球茎再生途径。3.植物离体无性繁殖的过程：繁殖体的诱导（芽、胚性愈伤组织、Plb）繁殖体的增殖；植株再生（芽的生根、胚状体形成与萌发、 Plb分化植株）小苗移栽: 将再生植

12、株由组培室移栽到温室、田间。4.顶芽与侧芽再生途径步骤：选择适当的枝条、茎段，消毒；茎段培养（nodal culture）或茎尖培养（shoot tip culture)；1-2芽/段促进顶芽和侧芽生长，形成幼茎(shoot);幼茎生根、形成完整植株。（重复2和3，可以大量繁殖植物）5.顶芽和侧芽再生途径的特点：优点：顶芽和侧芽是植物生长发育过程中自然形成的，发生变异的比率很低。利用顶芽和侧芽途径繁殖植物时变异率最小，所繁殖出来的群体在性状上能最大限度地与母株保持一致。缺点：速度可能比较低，不能满足要求。6.顶芽和侧芽再生途径可能存在的问题：不是所有的植物都可以进行茎段培养。只有茎能伸长的植物

13、（菊花、马铃薯、葡萄、木本植物等）才可用法，节间短、莲座状的植物（如凤梨、非洲菊、白菜等）则不能用。繁殖效率比较低。（繁殖速率：侧芽生长率、生长速度和长度(节数)）侧芽萌动率高，但伸长不好，影响增殖效率和生根。7.不定芽再生途径过程：外植体的选择与消毒；不定芽的诱导（外植体既可以直接形成不定芽，也可以先形成愈伤组织，再由愈伤组织形成形成不定芽）；芽的增殖(茎段培养或不定芽)；不定芽的生根。8.影响不定芽形成的因素：植物种类和品种（基因）差异：植物外植体形成不定芽的能力：草本植物大于木本植物；双子叶植物大于单子叶植物。即使同一种植物，品种之间往往也有很大的差异。外植体的类型：同一株植物以不同的器

14、官（根、茎、叶、花、果实、胚）作为外植体，其形成不定芽的能力往往会有差异。外植体的生理状态：幼年期的外植体形成不定芽的能力大于成熟期的外植体，特别是木本植物。一株植物不同部位的成熟度与其到根部的距离呈正相关。9.不定芽途径的优点和缺点优点：（1）取材料方便，可以不毁坏母株；（2）芽的增殖速度快，繁殖效率高。（3）是培育转基因植物的重要途径。缺点：植株变异的几率较大。10.无根苗生根两种类型：皮部生根型和愈伤组织生根型。皮部生根型：根直接从无根苗基部茎的皮层处长出。愈伤组织生根型：无根苗基部先形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成根。11.影响无根苗生根的因素：植物的类型和品种：草本比木本易；幼年期外

15、植体形成的无根苗比成年期形成的无根苗容易；基本培养基成分：不同培养基的无机盐浓度差异较大，对生根的影响也比较大。一般较低的无机盐有利于生根；生长素：有些植物可以在无激素的培养基上生根，但大部分则要求使用一定浓度的生长素。在诱导生根方面，IBANAAIAA。12.胚状体途径植株再生的过程：选择合适的材料、诱导胚性愈伤组织（能够产生胚状体的愈伤组织）促进胚性愈伤组织形成正常的胚状体（球型胚、心型胚、鱼雷型胚、子叶胚、成熟胚）促进胚状体萌发成苗13.影响胚状体诱导的因素：植物种类：不同种类植物形成胚状体的能力差异很大。外植体种类外植体生理状态：幼年期外植体高于成年期外植体，尤其是用合子胚及种子萌发的

16、幼苗为外植体，容易诱导成功。植物激素： 少数植物可以在无激素的培养基上形成胚状体，如人参；大多数植物则需要在生长素、或细胞分裂素、或生长素和细胞分裂素共同作用的诱导下才能形成胚状体，但激素种类、组合、浓度因植物种类而异。培养基成分： 糖、NH4+、Ca2+浓度，氨基酸（特别是脯氨酸）、水解酪蛋白等物质有利于胚状体的诱导；麦芽糖有利于胚的成熟。14.原球茎（根状茎）途径是兰花快速繁殖的最快途径，其中原球茎（根状茎）诱导的是兰花快速繁殖的关键。原球茎（根状茎）的诱导难易因兰花的种类和外植体类型而异。以顶芽和侧芽为外植体容易成功，以叶片、根则较难。 15.组培苗的移栽：炼苗：在培养室内将瓶塞打开（一

17、半或完全）2-3天，让组培苗逐渐适应培养容器外面的环境，增加角质层和蜡质层厚度，增强抵抗室外环境（特别是湿度）变化的能力。洗苗：炼苗结束后，在清水中将附着在根上的琼脂洗净，否则移栽后根系容易生霉，造成烂根、死苗。移栽：组培苗要移栽入温室或温棚中。基质要求疏松、透水、透气性能好（如蛭石、珍珠岩、泥炭土等配成的基质），最好要消毒。保持较高的湿度；遮荫、降低光照；保持温度相对平稳。16.用植物组织培养技术生产无毒苗的步骤：感病植株的病毒鉴定；感病植株的热处理；分生组织的分离；病毒的检测：血清免疫、电镜观察、接种鉴定等；移栽后的隔离，保证原种无病毒。17.植物离体繁殖技术的应用：快速繁殖优良品种；无病

18、毒优良种苗生产；挽救和繁殖濒危植物；离体保存植物资源（离体种质库）；培育转基因植物。第6章 植物细胞培养植物细胞培养(Plant Cell Culture)：在培养基中培养彼此分离的细胞、使之生长、增殖或分化。固体培养(solid culture)：在固体培养基中培养细胞,也称静止培养。液体培养（liquid culture）：在运动的液体培养基中培养细胞。又称悬浮细胞培养（suspension cell culture）。继代培养（传代培养；subculture）：将培养物（芽、愈伤组织、细胞等）分成若干份，接种到新鲜培养基上继续增殖的过程。愈伤组织(callus)：一群无明显组织分化、有分

19、裂能力的细胞群（团）。分化(differentiation)：形态、结构和功能相同的细胞变成形态、结构和功能互不同的细胞的过程。脱分化(去分化；dedifferentiation)：已分化、成熟的细胞失去原有的状态、重新恢复分裂能力的过程。再分化 (redifferentiation)：愈伤组织形成其它组织或器官的过程。最低起始细胞密度（minimum initial cell density）：细胞能够生长、分裂的最低接种密度。 看护培养（nurse culture）：将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。 微室培养(Culture in

20、 microchamber)：利用玻璃或塑料制作的小室进行细胞培养的技术。植板率（plate efficiency）：每个平板中新形成的细胞团数与每个平板中接种的细胞数百分比。前体物质（precursor）：指某一代谢中间体的前一阶段的物质。诱导子（elicitor）：指能刺激细胞合成次生代谢产物的物质。条件培养液（conditioned medium）:已经培养过某种细胞的培养液（内含该细胞分泌的活性物质，包括少量生长因子）与一定比例新鲜培养液混合的培养液。毛状根（hariy root, 发根）：植物的器官、组织或细胞在发根农杆菌诱导下产生的细小、多分枝的不定根。生物转化(Biotransf

21、ormation)：利用酶或生物细胞（微生物、植物、动物）对外源化合物进行结构修饰。1.细胞培养的应用：（1）进行细胞生物学研究；（2）培育植物变异体： 有变异，才会有选择;（3）生产有用化合物。2.影响植板率的因素:(1)植物种类：生长快、容易培养的植物（如大多数草本植物），其植板率高；相反，则低。(2) 细胞的生理状况：用快速生长期的细胞接种，则植板率高。(3)接种细胞密度：接种密度高，有利于细胞分裂，提高植板率，如烟草细胞。(4) 培养基成分：用营养成分丰富的培养基或条件化培养基，植板率高。(5) 培养方式：采用看护培养（nurse culture）是可以提高植板率。3.植物细胞大规模培

22、养生产次生代谢物质研究的过程:(1).选择外植体、诱导愈伤组织；(2). 通过含量分析、选择高产细胞系；(3). 研究培养条件(达到高产、稳产）；(4). 建立悬浮细胞培养、优化培养条件(达到高产、稳产）；(5). 小试；优化培养条件(6). 中试;优化培养条件(7). 大规模培养(8). 工业化生产；产品分离、纯化。4.提高次生代谢产物的方法：(1)选择高产细胞系；(2)优化培养基 （次生代谢物的产量=细胞生长量细胞合成代谢物的能力）;(3)饲喂前体物质（precursor）;(4)使用诱导子（elicitor）;(5)改善培养条件;(6)改进培养方法;(7)固定化细胞培养。5.如何选择高产

23、细胞系：（1）不同植物、不同单株、不同外植体（2）对细胞系进行系统选择： 细胞系在培养工程中，细胞系会出现变异，通过持续选择，有可能不断提高细胞系的生产能力。（3）细胞诱变选择细胞系（4）细胞系遗传改良：利用基因工程技术超量表达限速酶基因、阻断或者改变基因表达，提高细胞系合成次生代谢产物能力。6.毛状根的诱导过程：外植体选择和表面消毒；根农杆菌的活化与培养；感染（5-30min)；共培养（在无激素、有乙酰丁香酮的培养基上培养2-5天）；毛状根形成（在无激素、有抗生素培养基）7.生物转化用途：增加该化合物的生物活性；生产化学合成的中间体。生物转化过程中所发生的化学反应主要有氧化、还原、羟基化、甲

24、基化、去甲基化、糖基化、酰基化、异构化等。2、有一株稀有菊花，茎上长有10片叶。现要用离体培养技术将其在1年（12个月）内繁殖出100万株生根的组培苗，请写出主要技术要点。 第二部：转入诱导愈伤培养基（生长素，细胞分裂素大致浓度相同，比如MS+BA 1mg/L+NAA 1mg/l ）第三步：将上述愈伤组织转入诱导芽培养基（MS+BA2mg/l+NAA0.1mg/l)第四步：转入生根培养基（1/2MS+BA0.1mg/l+NAA1mg/l)要想获得大量组培苗重复第二步或第三步（完）第7章 植物原生质体培养与体细胞杂交体细胞杂交（somatic hybridization）:不同植物原生质体(pr

25、otoplast)（体细胞）之间发生融合。1.原生质体培养的用途:(1)原生质体是研究细胞骨架、细胞壁的形成、细胞膜的结构、大分子物质进出细胞过程与机理等问题的良好实验体系;(2)原生质体是转基因的良好受体;(3)原生质体可以诱导融合。2.分离原生质体的步骤：(1)植物材料的选择:选择分裂能力强，甚至再生能力强的植物材料；(2)酶解处理:酶解液中一般含有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等三种酶，浓度为0.5-2.0%。为了保持原生质体的完整及其活力，必须使原生质体处于一个等渗环境中。将植物材料放入酶解液中、释放出原生质体。(材料与酶解液的比例：2-10g/100ml酶解液)(3)过滤：酶解结束后，

26、将酶解物通过孔径为20-80m的不锈钢筛网过滤，除去未被酶解的组织块和细胞团。(4)离心：滤液转到离心管中在50g下离心5min。(5)洗涤：离心结束后，弃去上清液，用培养基或者原生质体洗液重新悬浮沉淀的原生质体，再离心，倒出上清液。如此反复2-4次，就可以将残留的酶液去掉。(6)纯化：用含高浓度（21%）蔗糖的培养基进行离心、纯化，完整的原生质体漂浮在上清液的上部。(7)收集原生质体。3.影响原生质体培养效果的因素：（1）植物材料：用于分离原生质体的植物材料对原生质体后来培养的效果影响极大。不同的植物、同一植物不同的品种，其遗传组成存在差异，原生质体的培养效果也就必然有差异。一般来说，容易培

27、养的植物、外植体，其原生质体也容易培养，反之，亦然。草本比木本容易，幼嫩的材料比成熟的材料容易。 （2）培养基：基本培养基：不同植物原生质体要求有不同的基本培养基。原生质体培养基中的大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元素浓度低。另外较高Ca2+浓度的对原生质体分裂有利。有机成分：同培养细胞、愈伤组织相比，培养原生质体时要求培养基有更丰富的有机成分。大量的结果表明，培养基中添加谷氨酰胺有利于原生质体的分裂。激素：培养基中要加入一定浓度的细胞分裂素和生长素。条件化培养基：使用条件化培养基可以大大促进原生质体的分裂和细胞团的形成。养基中的渗透压：原生质体无细胞壁，所以培养基中必须使用渗透压调节剂（甘

28、露醇、山梨醇等），以维持原生质体的稳定。4.原生质体融合有哪些方法?(1)化学诱导法:化学诱导法是利用一些化学物质,最常用的是聚乙二醇法和高钙高pH法。通过消除原生质体表面的电荷，促进原生质体彼此靠近、接触，并能促进接触处的细胞膜发生融解，从而实现原生质体融合的。(2)物理方法:在电融合仪上进行的。通过高频（500K Hz-2MHz）电场脉冲处理原生质体，可以使接触处的原生质体发生膜穿孔，最终导致原生质体融合。5.植物体细胞杂交存在的问题:(1)再生困难：不同原生质体容易融合，但体细胞杂种难分 裂、分化和再生，更难得到同时表现2个植物性状的个体。(2)遗传物质丢失：不同原生质体之间存在严重排斥

29、(3)植株稳定性差。第8章 动物细胞培养贴壁生长：细胞需要紧贴培养容器内壁才能生长的现象=贴壁现象。贴附型细胞：依赖贴附才能生长的细胞。接触抑制：当贴附培养容器内壁生长的细胞增殖到彼此紧密接触时，细胞停止分裂、增殖。悬浮型细胞：在培养过程中不贴附于培养容器表面、成游离状的细胞。细胞系(cell line)：原代培养细胞经首次传代成功后所形成的细胞群。细胞株(Cell Strain)：从一个细胞系中由单细胞培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的、具有稳定特殊性质或标志的细胞群。 干细胞(Stem Cell)：一种未充分分化、尚不成熟的细胞，具有再生各种组织、器官和个体的潜在功能。1.动物细胞培养

30、合成培养基：含合成培养基、血清和抗生素。（1）合成培养基：主要成分是氨基酸(13种以上) 、维生素、碳水化合物、无机盐和其他成分（如生长因子、激素、贴壁因子等）（2）血清：非常重要，尤其是在细胞建立或细胞生长状态不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛后再换成无血清培养液。（3）抗生素：青霉素，链霉素-防止感染。2.血清在动物细胞培养中的作用：补充基础培养基中没有或量不足的营养成分，如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等；提供细胞生存和增殖所必需的生长调节因子和激素；含有一些可供贴壁细胞型细胞贴壁生长的成分：如贴附因子；提供载体蛋白：结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用，可结合维生素、脂质、金属离子等。中和有毒物质的毒性、保护细胞不受伤害；提供良好的缓冲系统；提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的伤害。3.动物细胞与植物细胞培养的比较：相同：培养离散的细胞动物细胞植物细胞培养结果细胞、组织细胞、组织、器官和个体培养周期大多生命周期较短，不能无限期培养可以长期培养培养基成分复杂，价格高，比较专一较简单、成分一般明确，培养条件37，pH 7.2-7.4， 5%二氧化碳25，