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1、医学论文学校代码：10752学 号：201016104017宁夏医科大学毕 业 论 文枸杞多糖对去势雌性大鼠骨质疏松的预防作用LBP in castrated female rats osteoporosis prevention effect学院（系部）：基础医学院 专 业：生物技术 姓 名：马晓梅 指 导 教 师：苗珍花 职 称：教授 研究起止日期：2012.2-2014.5 交 稿 日 期：2014.5.21宁夏医科大学教务处制宁夏医科大学本科生毕业论文任务书毕业论文题目： 枸杞多对去势糖雌性大鼠骨质疏松的预防作用学生姓名： 马晓梅 专业： 生物技术 学号： 201016104017 内

2、容摘要: 骨质疏松症由多种因素所致，它的基本病理机理是骨代谢过程中骨吸收和骨形成的偶联出现缺陷，导致人体内的钙磷代谢不平衡，使骨密度逐渐减少而引起的临床症状。 骨密度测定对于各种原因所致骨质疏松症，灵敏度高，诊断率高,有助于协助诊断骨质疏松症。骨密度(BMD)的变化可以用骨密度仪来监测。一般选用正位脊柱和(或)双侧股骨，当病人的脊柱有明显的增生或变形时，双侧股骨扫描更有意义。 研究内容： SD去势雌性大鼠的分组与造模的方法；分组：假手术组、对照组及枸杞多糖预防高、低剂量组。2周后分组给药；给药十二周后取材（主要取椎骨、胫骨和股骨）。骨密度的测定（给药前测一次；给药期间分别测两次；取材后测一次）

3、。 发出日期 2012.2 完成期限 2014.5.21 指导教师 苗珍花副教授 学院负责人 2012 年 5 月 21日目录摘 要 1LBP in castrated female rats osteoporosis prevention effect.2中英文缩略词表 3前 言 4材料与方法 61材料： 61.2 主要设备 61.3 试剂 71.4实验用液体的配制 71.5 实验动物 82方法 92.1骨质疏松模型制备 92.2枸杞多糖给药干预 92.3 骨密度的测定 9结 果 101.大鼠体重的变化.112.枸杞多糖对骨密度的影响 10讨 论 131.模型的成功建立.142.有关骨密度测

4、定结果的讨论 153.枸杞多糖对去势雌性大鼠骨质疏松的影响 16结 论 .16参考文献 17综述 18综述参考文献 25致 谢 26枸杞多糖对去势雌性大鼠骨质疏松的预防作用摘 要目的 研究枸杞多糖(LBP)对去势雌性大鼠骨质疏松的作用。方法 选用4月龄成年雌性SD实验大鼠24只体重240260g，随机分为4组, 每组6只，选取1组大鼠打开腹腔切去少量腹腔脂肪组织, 作为假手术组，其余4组大鼠切除双侧卵巢建立骨质疏松动物模型。各组给药干预， 12周后行骨矿密度检查并观察骨的形态学改变。结果 与对照组相比，去势+枸杞多糖高剂量组、去势+枸杞多糖低剂量组均能增加去势雌性SD大鼠的骨密度值。结论 枸杞

5、多糖对去势雌性大鼠的骨质疏松有一定的干预作用关键词 SD大鼠；枸杞多糖；去势；骨密度 LBP in castrated female rats osteoporosis prevention effect ABSTRACTObjective Study the Lycium barbarum polysaccharides (LBP) on ovariectomized female rats osteoporosis. Methods April age adult female SDrats weight 240-260g, were randomly divided into 4 gro

6、ups, each group of6 only, select 1 groups of rats was cut open a small amount of abdominal fat tissue, as sham operation group, the other 4 rats to establish animal model of osteoporosis in resection of bilateral ovaries. In each group 12 week afterintervention, the morphological changes of bone min

7、eral density and bone ofinspection. Results Compared with the control group, ovariectomized + Lycium barbarum polysaccharide high dose group, OVX + Lycium barbarum polysaccharides dosages could increase the bone density of ovariectomizedfemale SD rat value. Conclusion Lycium barbarum polysaccharide

8、onosteoporosis in ovariectomized rats has certain intervention effectKey words：SDrats Lycium barbarum polysaccharides; ovariectomy; bone density中英文缩略词表 FSH 卵泡刺激素 CX43 缝隙连接蛋白 EG 乙二醇 PEG 聚乙二醇 PBS 磷酸缓冲液 h 小时 Min 分钟前 言 骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易发生骨折的一种全身代谢性骨骼疾病。据统计目前世界骨质疏松症患者人数超过两亿人，世界卫生组织WHO称

9、，骨质疏松（OP）的发病率已在世界常见病多发病中跃居第七位。根据第五次人口普查结果，预测目前我国骨质疏松患者（包括骨量减少）达8400万人。骨质疏松症患者不仅容易骨折而且难以修复，给患者带来疼痛，骨骼变形等多种问题。先今治疗骨质疏松症以西药为主，按其主要机制分为抑制骨吸收药物、促进骨形成药物和骨健康基本补充剂，临床试验证实确实在减轻骨质疏松症状方面有效，但是化学药物价格昂贵，且长期用药出现毒副作用。而治疗骨质疏松的中草药由于其本身具有的整体治疗效果及副作用小的优点正在得到国内外的广泛关注。同时与化学药物相比，中草药还具有资源丰富、价格便宜等优势，适合我国国情，目前中草药在治疗骨质疏松处在新兴进

10、展阶段。 治疗骨质疏松症的中药研究主要集中在传统医学中的补肾健骨药物上。如淫羊藿、续断、补骨脂、鹿茸、杜仲、接骨木、骨碎补等。枸杞子为茄科植物宁夏枸杞（Lycium Barbaruml)的干燥成熟果实，是我国传统的名贵中药材，含有枸杞多糖、多种氨基酸、微量元素、维生素、牛磺酸、生物碱、挥发油等化学成分。神农本草经中记载枸杞“久服坚筋骨，主治肝肾不足、精血虚损、.”，一直被用为强肾健骨之补药。枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides,LBP)为枸杞主要活性成分，它是酸性杂多糖与多肽或蛋白质构成的复合多糖，具有免疫调节、抗衰老、降血糖、抗疲劳、保护生殖系统、抗缺氧等

11、功能。另外LBP对性激素及其调节轴作用不明显。其作用机制可能为下丘脑-垂体-性腺轴及靶器官受体等多途径，增加靶器官的性激素受体表达和受体敏感性而发挥激素样效应。中医经常应用含有枸杞的方剂治疗“骨痿”这种病症，但用现代的医学实验方法来证明枸杞多糖对骨质疏松的作用并研究其作用机制的报道在国内外却很少见到亦未见在整体动物上对枸杞多糖防治骨质疏松及其作用机制的系统研究报道。骨质疏松研究中的重要手段是建立骨质疏松动物模型，目前的骨质疏松动物模型分为全身性骨质丢失和局部骨丢失模型。全身性骨质疏松模型主要有卵巢切除造模和药物造模两种方法，局部骨质丢失模型包括单侧肢体废退性模型和悬吊失重模型。目前骨质疏松动物

12、模型最常见的模型动物是封闭群的SD（Sprgaue Dwalye)大鼠和Wistar大鼠。在本实验中为了研究枸杞多糖对大鼠骨质疏松的作用，我们将成年雌性大鼠切除双侧卵巢建立骨质疏松模型，模型建立成功后分高、低组以灌胃的方式给予枸杞多糖并以清水为阳性对照。各项评价指标为：股骨干重测量、骨矿密度检查并观察骨的形态学改变，从而考察枸杞多糖对骨质疏松性大鼠骨代谢的作用并初步寻求其可能的作用途径，探讨其可能的作用机制。 材料与方法1材料：1.1 药物 枸杞多糖由宁夏启元药业有限公司提供，纯度99.99%，批号20H223655,。1.2 实验动物四月龄健康雌性sprague-dawley（SD）大鼠，均

13、为合格的一级动物，由宁夏医科大学实验动物中心提供，体重240-260g。1.3 试剂枸杞多糖、水合氯醛、多聚甲醛、PBS1.4主要实验器械1.4.1 主要仪器设备：X-RAY分析仪 （规格：carestream FX PRO) 购买于美国Lunar有限公司。1.4.2 实验用器具主要有：饲养框、水瓶、持针钳、缝合针（2号）、缝合线（3号）、无齿镊子、有齿镊子、眼科剪、直尖剪、直圆剪、注射器（5ml)、刀片、软木固定板、棉花球、油性笔、输液器、输液架、灌注针头等。1.5 实验用液体的配制1.5.1 10%水合氯醛： 表 1 100ml水合氯醛溶液成分表 成分 用量 水合氯醛 10g 蒸馏水 10

14、0ml 1.5.2 0.1M PBS溶液(PH=7.4)按配 2000ml 量计算，各成分用量如表 1： 表 2 2000ml PBS溶液成分表 成分 用量 0.1NaH2PO4.2H2O 5.93g Na2HPO4.12H2O 58.02g NaCl 18.00g 蒸馏水 2000ml P1.5.3 0.02M PBS溶液（PH=7.0）表 3 3000ml PBS溶液成分表 成分 用量 NaH2PO4.2H2O 1.56g Na2HPO4.12H2O 21.20g NaCl 25.50g 蒸馏水 3000ml 1.5.4 4%多聚甲醛的配制表 4 1000ml 4%多聚甲醛成分表 成分 用

15、量 Na2HPO412H2O 2.72g NaH2PO42H2O 0.28g NaCl 8g 多聚甲醛PFA 40g NaOH 调 PH 值用配法：先称取Na2HPO412H2O加适当去离子水搅拌再加入多聚甲醛PFA， 60加热溶解，最后加入NaH2PO42H2O,加去离子水至1000ml，用NaOH调PH至7.4，过滤后保存4备用。2方法2.1动物饲养 四月龄SD大鼠。饲养在宁夏医科大学解剖楼动物实验室，动物实验室内具有良好的饲养环境，温度维持在 22左右，湿度以普通条件为主，各组大鼠分笼饲养，自由饮用自来水，自由摄取标准大鼠饲料（钙1.01%，磷0.78%）2.2 动物分组 24只4月龄S

16、D雌性大鼠（体重240-260g）随机分成模型组和假手术组，模型组18只，假手术组6只。模型组大鼠进行双侧卵巢切除术，并随机再分成枸杞多糖高剂量组、枸杞多糖低剂量组、对照组，各组均为6只，各组饲养2周后开始给药干预。假手术组大鼠进行腹部切开但不切除卵巢，作为正常对照组。2.3 动物模型的制备 以双侧卵巢切除法复制骨质疏松模型。大鼠称重，0.1%水合氯醛1-1.5ml/100g腹腔注射麻醉后，固定，术区剃毛，碘伏消毒，取大鼠下腹部正中，沿腹白线纵行切口约1cm，打开腹腔，查找卵巢，卵巢是呈粉红色颗粒状组织，多被其周围脂肪组织所掩盖，提起后用丝线结扎其周围相连组织，将其切除，切除两侧卵巢后，分层缝

17、合，从第二天起连续注射3天10万单位青霉素预防感染，75%酒精清洗消毒切口。假手术组开腹后切除少量脂肪保留卵巢，其他处理同前。2.4 给药方法 各组手术2周后经灌胃给药物的方式均于开始给予相应的药物。给药时间持续12周，具体给药方法及剂量详见下表1。药物剂量按人鼠体表面积剂量换算给予等效剂量，假手术组和模型组给予清水。 表1 各组给药成分及剂量表 组别 给药成分 剂量假手术组 清水 10ml/kg.d对照组 清水 10ml/kg.d 去势+枸杞多糖高剂量组 4%枸杞多糖 10mg/kg.d去势+枸杞多糖低剂量组 2%枸杞多糖 10mg/kg.d2.5 一般状况的观察 在造模前，所有所选取作为本

18、实验的4月龄SD雌性大鼠均健康，生存力正常，精神饱满，饮食正常，毛色均呈白色，体重都在240.0g-260.0g之间。三、统计学方法 全部数据采用SPSS for Windows 11.5统计学软件包整理分析，计量资料以均数+标准差(+s)表示。两组间样本均数的比较采用成组（Independent-Samples)T检验；组间两两比较采用LSD检验。P0.05具有统计学差异。 结 果1 术后各组大鼠均无明显异常行为，精神好，活动灵活，食欲无明显变化，无一例出现灌胃感染和伤口处感染。 表1 各组大鼠体重的变化均值统计表（g） 假手术 对照组 去势+枸杞多糖高剂量 去势+枸杞多糖低剂量 造模前：

19、201.40 197.25 193.60 194.50 造模后： 292.49 278.80 295.10 292.91 给药后： 341.79 304.29 344.41 345.80经过以上数据之间的比较可以看出： 将体重数据进行统计分析，结果显示各组动物的体重均无显著差异。可以看出，假手术组和对照组的体重差异没有给药组的差异大；高剂量给药组的体重普遍高于低剂量给药组。通过体重的体现可以看出，枸杞多糖对大鼠的体重确实有一定的干预作用。如下图可以看出： 在造模前，各组大鼠均毛色白亮，精神好，活动灵活，食欲均正常，无一例异常。在造模后，假手术组和对照组的毛色均正常，精神略好，食欲均有稍微的下降

20、；给药组均出现毛色干涩发黄，精神稍萎靡，食欲有下降。给药后，假手术组和对照组均无明显变化，给药组毛色有好转，精神也逐渐恢复了，食欲相对之前来说有略微的增加。 （图1，给药前） （图2，给药后） （图3，椎骨左） （图4，椎骨右） （图5，股骨左上） （图6，股骨右上） （图7，股骨左下） （图8，股骨右下） （图9，胫骨左上 （图10，胫骨右上） （图11，胫骨左下） （图12，胫骨右下） 讨 论 骨质疏松（Ostcoporosis,OP)是一种慢性系统性骨骼疾病，以骨强度下降，易于发生骨折为特征，作为老年性疾病，使很多人越来越深受其害。骨质疏松是Pommer在1885年提出的。如今，人们对骨

21、质疏松症的认识是随着历史的发展和技术上的进步逐渐得到深化。参照人类骨质疏松的诊断标准,当股骨中点骨皮质指数55%时,诊断为骨质疏松。骨质疏松模型的成功建立：去卵巢大鼠在组织学上表现为骨吸收的增加和成骨作用的抑制，与人绝经后骨质疏松症有着许多相似之处，卵巢切除以后，松质骨的骨量减少，骨强度下降是伴随骨转换增强而进行的，这种特性较好的模仿了人正常绝经时骨转换高增强型骨质疏松发生时骨丢失状态。此次实验中去势+自来水组大鼠骨密度、股骨干重量明显低于假手术组，证明本次实验骨质疏松动物模型建立成功。本研究采用了4月龄雌性大鼠切除双侧卵巢复制骨质疏松症模型，并给予枸杞的主要成分枸杞多糖干预。实验结果表明，枸

22、杞多糖可提高去势雌性SD大鼠骨质疏松模型的股骨干重、骨密度值，改善骨质的形态学结构，均具有统计学意义。 大鼠的自然寿命为2- 3年,成年雄性大鼠在30个月时骨骺端仍有持续 生长这种骨状态的不稳定性可能会干扰实 验结果,因此大多数学者认为雄 性大鼠不适合做 各 种成人骨骼研究的模型。而雌性大鼠在 6-9个月时就进入骨生长静止期,骨骺开 始封闭,10个月达峰值骨量,出现一个骨代谢相对稳定的阶段,与人类相似;切除卵巢的大鼠经给予合适的雌激素进行替代试验时并不增加骨转换和骨丢失, 这与绝经后妇女对雌激素替代法的反应相一致。在骨质疏松的实验中，所选择的动物可以在细胞结构方面存在或多或少的差异，但在骨的组

23、织行为上要与人有较好的一致性。骨质疏松动物模型是否复制成功需要客观的指标来判断。现有的判断指标主要有: 骨密度测量、骨组织形态计量学测定、生化指标的测量、骨生物力学指标检测等。其中， 骨量变化和骨组织显微结构变化是两项主要的指标。大鼠在医学研究中作为实验动物的历史已较长，尤其为成人骨骼研究提供了许多基本资料，用其椎体和及四肢骨代替人骨，通过强度分析，能够评价那些预防骨质疏松及骨折的药物作用效果，且费用相对较低、周期相对较短，尤其大鼠卵巢切除所造成的骨质疏松模型是一个优秀的模型，它正确的模拟了成年妇女激素缺乏的临床特性及对激素替代疗法的反应。大鼠松质骨的骨质疏松进程，对研究骨骼的生理学反应非常有

24、利。未交配的610个月龄的雌性大鼠是预防研究的最佳选择。而1011月龄的雌性大鼠对研究峰值骨量以后的骨丢失有重要价值。如果实验的目的是研究成年人骨病进程的特点，10月龄的雌性大鼠被切除卵巢造成的骨丢失是首选的动物模型，此时它已达骨峰值，且同成人女性骨质疏松有极相似的临床表现。一些人体常规检测的方法如生化标志物、组织形态学和骨密度测量术都可应用于大鼠。像其他的动物模型一样，大鼠没有脆性骨折发生，但通过对大鼠骨的力学实验能正确地评价骨的脆性。鉴于大鼠的低水平哈氏重建，不允许用其评价皮质骨的行为。雄性去睾丸及维甲酸诱导的大鼠骨质疏松模型也是研究原发性骨质疏松的成熟造模方法。实验结果显示，去势+枸杞多

25、糖高、低剂量组大鼠在骨矿密度测量值相对于去势+自来水组大鼠都有明显的统计学意义，形态学比较观察，去势+枸杞多糖高、低剂量组大鼠较去势+自来水组大鼠骨小梁完整，连续性好，骨板层结构致密，排列有序，骨纹较多，吸收陷窝少。说明高、低剂量枸杞多糖对去势雌性大鼠骨质疏松均有治疗作用。去势+枸杞多糖高、去势+枸杞多糖低剂量组在股骨干重、椎骨矿密度测量值无统计学意义；形态学上观察去势+枸杞多糖高剂量组大鼠较去势+枸杞多糖低剂量组骨小梁连续性好。有关骨密度测定方法的讨论： 双能X线吸收仪测量小实验动物的骨密度,不仅具有较高的精密度和准确度,而且直接反映骨量的变化。骨矿含量和骨密度均为反映骨量的指标, 但角度不

26、同, 骨密度是指单位面积的骨矿含量。本实验表明,大鼠在生长期和成年期骨量随月龄和体质量的增加而增加, 两指标均能反映出骨量增长的变化;但去卵巢后, 骨密度能反映出去卵巢组的骨量丢失,术后1月差异有显著性,而骨矿含量却不能。这是由于去卵巢后骨量丢失主要发生在以骨小梁为主的松质骨, 松质骨处于高转换状态,骨吸收大于骨形成导致骨丢失,而皮质骨代谢却不同,松质骨骨量的减少造成皮质骨受力明显增加, 加之体质量的增加,皮质骨发生适应性变化,骨内膜吸收增加,骨髓腔面积增大,骨外膜成骨增加,早期皮质骨骨量不减少, 甚至增加;又由于松质骨比皮质骨的表面积大得多,所以骨密度可准确地反映单位面积的骨骼变化( 主要是

27、松质骨),而骨矿含量只能反映大鼠整体的骨量变化,评价骨量丢失效能较差, 由于雌性大鼠整体骨密度与局部松质骨骨密度(如腰椎)具有较好的一致性,所以笔者认为骨密度是评价骨丢失的较好指标,这与其他学者认为骨矿含量是评价骨量较好指标观点不同。 据查文献和这段时间的实验历程，我认为骨质疏松症不仅是骨矿含量和骨密度的改变，还有随着人类年龄的增长，骨的脆性、抗压力、各个成分的含量等都有所改变。骨的脆性会增加，抗压力下降，各个成分的含量的失衡等都是骨质疏松症的重要特征。其中最为明显的事钙磷失衡，导致骨密度降低，自已而然骨折的发生率增加了。虽然两年前大二那年我就积极进入了实验室随导师开始做实验研究枸杞多糖对去势

28、雌性大鼠骨质疏松的干预作用。但两年来，由于各种原因，各种条件的限制，各种疑问的无法解答，造成了至今我们也没有完全成功的研究出其结果。我们所用的骨密度仪是购买于由美国的Lunar有限公司，但是有一个问题一直得不到解答，就是测骨密度时同一只鼠的同一骨上的各个部位的骨密度差异特别大。根据医学根据，这是不应该成立的。我们也查过很多资料，也向很多专家请教过，但都得不到一个满意的答案。所以我们没有统计出实验数据，也没有得出完全正确的实验结论。所以此课题还需要更进一步的研究，需要以后的同胞们的探索。据查文献所得，实验结果应该是显示去势枸杞多糖高、低剂量组大鼠在骨矿密度测量值相对于去势+生理盐水组大鼠都有明显

29、的显著性差异，形态学比较观察：去势枸杞多糖高、低剂量组大鼠较去势+生理盐水组大鼠骨小梁结构完整，连续性好，骨板层结构较致密，排列有序，骨纹较多，吸收陷窝少。说明高、低剂量枸杞多糖对去势雌性大鼠骨质疏松均有治疗作用。去势枸杞多糖高、去势枸杞多糖低剂量组在腰椎骨矿密度测量值没有显著性差异，形态学上观察：去势枸杞多糖高剂量组大鼠的较去势枸杞多糖低剂量组骨小梁连续性好。去势枸杞多糖高、去势枸杞多糖低剂量组在骨矿密度测量值均低于去势己烯雌酚组，形态学上比较观察：去势枸杞多糖高、低剂量组大鼠较去势+己烯雌酚组骨小梁较纤细，有吸收陷窝。说明高、低剂量枸杞多糖对去势雌性大鼠骨质疏松的治疗作用不及己烯雌酚。假手

30、术组的骨密度测量值高于其他各组，形态学观察：较其余组骨小梁饱满，着色深，骨小梁连无断裂，无吸收陷窝。说明去势后发生的骨质疏松可能难以用药物恢复。 枸杞多糖为枸杞主要活性成分，具有免疫调节、抗衰老、降血糖、抗疲劳、保护生殖系统、抗缺氧等功能。传统医学经常枸杞来作为强筋健骨主要药物。本实验为进一步开发枸杞子的药用价值提供了动物实验基础，并为利用宁夏丰富的药用植物资源，开发出安全高效、物美价廉的治疗骨质疏松症的新药奠基了一定的基础。 结 论 枸杞多糖对去势雌性大鼠骨质疏松具有预防作用。 参考文献1 Purdie DW.Consequences of long -tern hormone replacement the rapyJ .Br Med Bull,2000 ,56( 3) : 809 823 . 2 秦林林, 陈金标, 龚海洋,等。不同月龄雌性大鼠骨质疏松模型研究 J 。中日友好医院学报