贾一鸣.docx

1、贾一鸣1前 言 大豆是重要的经济作物，大豆含的营养素比较全面，并且含量丰富，与等量的猪肉相比，蛋白质多1倍、钙多33倍、铁多26倍、而价格比猪肉便宜很多。大豆作为我国乃至全世界重要的作物，国内外已经开展了大量的基础生物学研究和分子辅助育种研究，目前大豆DNA提取方法很多，SDS法、CTAB法，但这些方法操作步骤多、程序复杂、耗时较长、提取物中含有蛋白、糖、脂、色素和其它干扰物，对实验结果造成影响，而且实验中用的一些试剂会污染环境。植物DNA的分离是生物工程中的基本操作，对此已有大量报道。1992Guillemaut等发展了高盐低pH值法提取植物DNA的技术，邹玉萍等（1994）利用此法提取几种

2、濒危植物总DNA，取得了较好的效果。此方法快捷、简便、经济而又无毒或毒性小，是提取DNA的可靠方法。 进行大豆基因方面的探索意义重大，DNA的提取效率，尤其是DNA的纯度严重影响实验结果。前人已经就植物基因组DNA的提取总结了一系列的方法和经验，如SDS(十二烷基硫酸钠)法、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法，但在DNA提取过程中，有机试剂(苯酚、氯仿等)处理次数过多，所得DNA分子大小不均一，片段偏小，纯度不高，得率也低，而且CTAB等试剂价格昂贵，增加了成本。1992年Guillemaut等发展了高盐低pH值法提取植物DNA的技术。邹喻苹等(1994) 利用此法提取几种濒危植物总DNA，取

3、得了较好的效果。电泳技术是一种先进的检测手段，与其它先进技术相配合，能创造出惊人的成果，可使人们用较少代价获得最优效益。比如它对解决当前人类所面临的食品、能源、环境和疾病等一系列迫切问题，都有积极作用，显示出强大的生命力。因此电泳技术正越来越多地为人们所重视，广泛应用于各个领域。本实验以大豆的根部为原料，利用高盐低ph值法的单因素实验和正交实验和琼脂糖凝胶电泳技术对不同水浴处理时间、不同抽提纯化处理条件，不同沉淀剂，不同SDS浓度下提取的大豆基因组DNA的纯度、浓度进行综合分析比较，从而确定高盐低pH值法提取植物基因组DNA的最佳水浴处理时间和抽提纯化条件，试图对高盐低 pH值法提取纯化过程中

4、的操作细节做进一步的探索和优化。2 材料与方法2.1 材料本实验采用大豆幼苗的根部作为DNA提取的原料。2.2 仪器及耗材电子天平、恒温水浴锅、磁力搅拌器、电炉子、-20冰箱、4冰箱、-80冰箱、高压灭菌锅、高速离心机(上海安亭科学仪器厂)、DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)、JY-SPDT型水平电泳槽、梳子(北京君意东方电泳设备有限公司)、T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)、离心管(1.5ml)、研钵、移液枪 (1000l、200l、100l、20l、10l、5l)、各类枪头及耗材等。2.3 试剂 2.3.1提取试剂(1)提取缓冲液：100mmol/L NaA

5、c、50mmol/L EDTA、500mmol/L NaCl、2.5%PVP、3%SDS、巯基乙醇，PH5.5.(2)TE缓冲液：100mmol/L TrisCl(pH8.0)、500mmol/L EDTA(pH8.0).(3) 苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿/异戊醇(24:1).(4) 2.5mol/KAc(pH4.8)2.3.2 电泳试剂10TBE缓冲液(PH8.3):Tris.cl 108g，硼酸55g，NaEDTA2HO 7.44g,定容至1000ml。核酸染料Gelview、6Loading Buffer、DL2,000TM DNA Marker、琼脂糖。2.4 方法2.

6、4.1 高盐低pH值法取0.05g大豆幼苗根部置于放有液态氮的研钵中研磨成粉(加入少量PVP)，分装于12支1.5mL的离心管中(加入少量PVP)。迅速加入预热至65的1mL的提取缓冲液100mmol/L NaAc、50mmol/L EDTA、500mmol/L NaCl、2.5% PVP、2%SDS、1%-巯基乙醇，pH5.5，于65的恒温水浴锅中震荡温育30min。10000r/min离心10min。吸取上清液加入2/3倍体积的2.5mol/L KAc(pH 4.8)， 0下放置30min， 10000r/min离心10min。吸取上清液移入另一支离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:

7、1)，反复颠倒混匀，10000r/min离心10min，反复抽提至中间无白色沉淀。取上清液加入0.6倍体积-20异丙醇，轻轻混匀置-20沉淀1h。8000r/min离心15min，所得沉淀用70%乙醇洗2次，待残留的乙醇挥发后，将DNA溶于40L TE缓冲液中(含RNaseA酶)，置-20冰箱中保存备用。 2.4.2 不同处理提取纯化DNA2.4.2.1不同温育时间为了比较不同水浴处理时间对提取的大豆DNA产率的影响，在高盐低pH值法其他条件一致的基础上改变水浴处理时间，设置了四个不同水浴处理时间：(1)30min；(2)1h；(3)2h；(4)2.5h；2.4.2.2 不同SDS浓度 为了比

8、较SDS浓度对大豆DNA产率的影响，在高盐低pH值法其他的条件一致的基础上改变提取缓冲液中的SDS浓度，设置了四个SDS梯度：(1)1%；(2)2%；(3)3%；(4) 4%；2.4.2.3 不同抽提纯化处理条件为了比较不同抽提试剂及抽提次数分别对提取的大豆基因组DNA质量的影响，在高盐低pH值法其它条件一致的基础上，设置了4种不同的抽提纯化处理条件：(1)不抽提；(2)加等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次；(3)加等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提2次；(4)加等体积氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次，再加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提1次。2.4.2.4 不同沉淀剂为了

9、比较不同沉淀剂对提取的大豆基因组DNA质量的影响，在高盐低pH值法其它条件一致的基础上，设置了4种不同的沉淀剂进行沉淀处理：（1）2倍体积无水乙醇 （2）0.6倍的异丙醇（3）2倍无水乙醇+1/10NaAc （4）0.6倍异丙醇+1/10NaAc2.4.3 琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量称取0.5g琼脂糖(胶浓度为1%)，加50ml 0.5TBE电极缓冲液，放入100ml锥形瓶中在电炉上加热至沸腾3次，之后冷却至4550，加入5L Gelview核酸染料，振荡混匀，倒入插好梳子的电泳槽中，自然冷却至凝固后，小心取出梳子，将制好的胶板放入电泳槽中，缓慢加入电极缓冲液，使缓冲液浸过胶板表面，按顺序往

10、点样孔中点入6L加有上样缓冲液的 DNA样品母液，再在单独的一个点样孔中点入6L DL2,000TM DNA Marker，把电泳槽盖好，在150V电压下电泳30min，在紫外分析仪下进行质量检测并拍照。3 结果与分析31 不同水浴处理时间对提取的DNA产率与质量的影响3.1.1 DNA的纯度和浓度检测结果将做不同温浴处理时间，从大豆幼苗根部中提取的基因组DNA的紫外浓度纯度检测数据列为表3-1。表3-1 不同温育时间提取大豆幼苗根部DNA的浓度和纯度Table3-1 Different temperature for the concentration and purity of DNA e

11、xtraction of soybean seedling root材 料 处理方法 260/280 260/230 浓度(ng/L) 0.5h 1.75 1.68 464.8大 豆 1 h 1.87 1.60 207.9根 部 2 h 1.90 2.17 496.92.5h 1.93 2.02 426.33.1.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12不同温浴处理时间从大豆根部提取的基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3-1：M为DL2,000TM DNA Marker；13泳道为温浴处理0.5h样品；46泳道为温浴处理1h样品；79泳道为水浴处

12、理2h样品；1012泳道为水浴处理2.5h样品。图3-1 不同温浴时间处理的大豆幼苗根部基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱Figure3-1 Different incubation time processing of soybean seedling roots of genomic DNA agarose gel electrophoresis3.2 不同抽提纯化处理条件对提取的DNA产率与质量的影响3.2.1 DNA的纯度和浓度检测结果将高盐低pH值法从大豆幼苗根部中提取的基因组DNA的浓度纯度检测数据列为表3-2：(1) 不抽提；(2)氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次；(3)氯仿/异戊醇

13、(24:1)抽提2次；(4)氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次，苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提1次。表3-2 不同抽提纯化方法提取的大豆幼苗根部DNA的浓度和纯度Table3-2 The concentration and purity of DNA extracted from roots of soybean seedlings with different extraction methods材 料 处理方法 260/280 260/230 浓度(ng/L) (1) 1.88 0.75 245.4大 豆 (2) 1.84 1.95 191.1根 部 (3) 1.91 1.84 1

14、10.0(4) 1.76 2.00 3031.13.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果不同抽提纯化处理条件从大豆幼苗根部中提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3-2所示：M为DL2,000TM DNA Marker；13泳道为不抽提样品；46泳道为氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次样品；79泳道为氯仿/异戊醇(24:1)抽提2次样品；1012泳道为氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次，苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提1次样品。M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12图3-2 不同抽提条件处理的大豆幼苗根部基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱Figure3-2 Agarose g

15、el electrophoresis pattern of genomic DNA extracted from roots of soybean seedlings with different extraction methods3.3不同SDS浓度对提取的DNA产率与质量的影响3.3.1 浓度和度检测结果将高盐低pH值法从大豆幼苗根部中提取的基因组DNA的浓度纯度检测数据列为表3-3：1） SDS浓度为1%；2）SDS浓度为2%；(3)SDS浓度为3%；4)SDS浓度为4%。表3-3 不同SDS浓度提取的大豆幼苗根部DNA的浓度和纯度Table3-3 The concentration

16、and purity of DNA extracted from roots of soybean seedlings with different SDS concentration材 料 处理方法 260/280 260/230 浓度(ng/L) (1) 1.82 2.06 253.5大 豆 (2) 1.97 2.13 324.2根 部 (3) 2.06 1.29 248.1(4) 1.76 4.14 101.83.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果不同SDS浓度从大豆幼苗根部中提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3-3所示：M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1

17、3 14 15 16 17 MM为DL2,000TM DNA Marker；24泳道SDS浓度为1%样品；68泳道为SDS浓度为2%样品；1012泳道为SDS浓度为3%样品；1416泳道为SDS浓度为4%样品。图3-3 不同SDS浓度提取的大豆幼苗根部基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱Figure3-3 Agarose gel electrophoresis pattern of genomic DNA extracted from roots of soybean seedlings with different SDS concentration3.4不同沉淀剂对提取的DNA产率与质量的影响3

18、.4.1 浓度和度检测结果将高盐低pH值法从大豆幼苗根部中提取的基因组DNA的浓度纯度检测数据列为表3-4：1） 沉淀剂为2*无水乙醇；2）沉淀剂为2*无水乙醇+1/10NaAC；(3)沉淀剂为0.6*异丙醇；4)沉淀剂为0.6*异丙醇+1/10NaAC。表3-4 不同沉淀剂提取的大豆幼苗根部DNA的浓度和纯度Table3-3 The concentration and purity of DNA extracted from roots of soybean seedlings with different Precipitating agent材 料 处理方法 260/280 260/23

19、0 浓度(ng/L) (1) 1.44 1.32 217.7大 豆 (2) 1.84 1.95 191.1根 部 (3) 1.82 2.10 377.9(4) 1.86 2.46 497.33.4.2 琼脂糖凝胶电泳检测结果不同沉淀剂从大豆幼苗根部中提取基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3-4所示：M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18M为DL2,000TM DNA Marker；24泳道沉淀剂为2*无水乙醇样品；68泳道为沉淀剂为2*无水乙醇+1/10NaAC样品；1012泳道为沉淀剂为0.6*异丙醇样品；1416泳道为沉淀剂为0.

20、6*异丙醇+1/10NaAC样品。图3-4 不同沉淀剂提取的大豆幼苗根部基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图谱Figure3-4Agarose gel electrophoresis pattern of genomic DNA extracted from roots of soybean seedlings with different Precipitating agent3.5高盐低pH值法不同处理条件对提取大豆根部DNA的浓度和纯度的影响3.5.1 选取SDS浓度不同、温裕时间不同、抽提处理不同等三个单因素的正交实验方案和测量的浓度和纯度的数据列为表3-5表3-5 高盐低pH值法不同处理条件

21、正交试验方案及结果分析Figure3-5 High salt and low pH method of orthogonal test program and the results of analysis of the different treatment conditions序号高盐低pH值处理条件260/280 260/280DNA浓度单位 ng/LSDS浓度不同温浴时间不同抽提处理不同1234567891%1%1%2%2%2%3%3%3%0.5h1h2h0.5h1h2h0.5h1h2h不处理抽提一次抽提两次抽提一次抽提两次不处理抽提两次不处理抽提一次1.891.941.931.881

22、.841.771.881.772.752.723.761.813.232.740.492.011.651.32149.880.297.4122.454.5122.796.325.21743.5.2琼脂糖凝胶电泳检测结果为了方便操作，把1、4、7编为一组，把2、5、8编为一组，把3、6、9编为一组，其琼脂糖凝胶电泳检测如图3-5，3-6，3-7所示： 如图3-5所示，M为DL2,000TM DNA Marker；2泳道号样品；泳道为4号样品；1泳道为号样品；M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M图3-5 序号1、4、7条件处理的从大豆幼苗根部提取的琼

23、脂糖凝胶电泳图谱Figure3-5 No. 1,4,7 conditional processing extracted from the roots of soybean seedlings DNA agarose gel electrophoresis如图所示，M为DL2,000TM DNA Marker；2泳道号样品；泳道为号样品；泳道为号样品；M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M图3- 序号1、4、7条件处理的从大豆幼苗根部提取的琼脂糖凝胶电泳图谱Figure3- No. . conditional processing extracte

24、d from the roots of soybean seedlings DNA agarose gel electrophoresis如图3-7所示，M为DL2,000TM DNA Marker；2泳道3号样品；泳道为6号样品；泳道为9号样品；M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M图3-7 序号3、6、9条件处理的从大豆幼苗根部提取的琼脂糖凝胶电泳图谱Figure3-7 No. 3.6.9 conditional processing extracted from the roots of soybean seedlings DNA agarose gel electrophoresis4 讨论