子宫颈癌CervicalCarcinomaCC死亡率居女性恶性肿瘤.docx

1、子宫颈癌CervicalCarcinomaCC死亡率居女性恶性肿瘤焦磷酸定量化检测PAX1基因甲基化在宫颈癌诊断中的应用徐灵1，杨宝华1，王立峰1，屠红2，徐军1*，朱昊平31 上海市闵行区中心医院，上海，2011992 上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所，上海，2000323 上海市计划生育科学研究所，上海，200032*通讯作者, 邮箱：xujun1958上海市卫生局科研课题（2011152）摘要 目的 检测配对盒基因（ paired box gene）家族PAX1基因在不同程度病变的宫颈组织中的甲基化水平，评估其作为宫颈上皮细胞癌变的分子标志物的诊断价值。方法 使用焦磷酸测序

2、法检测抑癌基因的不同位置甲基化情况。比较正常组织和不同程度病变组织的甲基化水平的的差异，其中正常组织28例、低级别病变(CIN I) 32例、高级别病变(CIN 、) 34例、宫颈鳞癌27例。采用利用受试者工作特性曲线（ROC）确定不同程度病变组之间的判别临界值。按照阈值划分，进行不同程度宫颈病变组织中甲基化表达水平（甲基化程度（%）的平均值表示）差异定性分析。结果 正常宫颈组为（4.924.45）%，低级别病变组（LSIL）为（5.555.05）%，高级别病变组（HSIL）（10.2114.39）%，宫颈癌组（CSC）为（41.9723.02）%。对四组资料进行单因素方差分析，发现四个病变组

3、存在统计学差异(F=46.43，P0.001)。各组间ROC曲线下面积均较高提示有一定的诊断价值，其中以正常宫颈、低级别病变合并组和高级别病变、宫颈癌合并组之间，以及非宫颈癌组和宫颈癌组之间的甲基化水平ROC曲线拟合较好，其ROC曲线下面积分别为0.680、0.883，敏感度与特异度之和的最大值所对应的界定值分别为8.97%（敏感度57%，特异度90%）和20.55%（敏感度81%，特异度93%）。结论 焦磷酸测序法PAX1基因甲基化水平定量检测，较以往的定性分析有较大优势，对于宫颈癌早期临床诊断具有潜在应用价值。关键词 配对盒家族基因1；DNA甲基化；宫颈癌；焦磷酸测序法PAX1 Methy

4、lation Quantitative Measurement for Cervical CancerXu Ling1，Yang Baohua1, Wang Lifeng1，Tu Hong2，Xu Jun1*，Zhu Haoping31 Shanghai Minhang Central Hospital，Shanghai, China，2011992 Shanghai Cancer Institue，Shanghai, China，2000323 Shanghai Institute of Planned Parenthood Research，Shanghai, China，200032*C

5、orrespondence, Email：xujun1958Funded by: Shanghai Health Bureau Project (2011152)Abstract Objective To estimate a quantitative measure of the paired-boxed gene1 (PAX1) methylation in detection of cervical cancer. Methods We Comprise the degrees of methylation between normal and diseased tissue,there

6、 are 28 cases in the normal tissue group , 32 cases in the low-grade lesions (CIN I) group ,34 cases in the high-grade lesions group 27 cases in the cervical squamous cell carcinoma group.The percentage of PAX1 methylation was tested by pyrosequencing in different level of lesions. The efficacy of P

7、AX1 in diagnosis of cercical cancer was tested by ROC curve. Results The percentage of methylated reference in normal cervical tissues was （4.924.45）%; The percentage of methylated reference in low-level lesions was （5.555.05）% ; The percentage of methylated reference in high-level lesions was （10.2

8、114.39）%; The percentage of methylated reference in cervical cancer was （41.9723.02）%. All the groups were significantly different from each others（P0.05).The area under the ROC curves were relatively high which prompt its diagnostic value. The ROC curve fitted better between CT-LSIL merger group an

9、d CSC-HSIL merger group, non-CSC group and CSC. The area under the ROC curve was 0.680 and 0.883, cut-point values were respectively 8.97%（sensitivity 57%，specificity 90%）and 20.55%（sensitivity 81%，specificity 93%）. Conclusion Quatitative measurement of PAX1 by pyrosequencing in cervical caner scrap

10、ing is highly sensitive and it may have a potential value for diagnosis of cervical cancer in clinic.Key-words PAX1; DNA methylation; Cervvical cancer; Pyrosequencing宫颈癌（Cervical Carcinoma, CC）死亡率居女性恶性肿瘤之首，发病年龄呈现出年轻化的趋势1。如何在现有手段的基础上提高筛查检出率、把防治关口前移，是宫颈癌临床及公共卫生领域亟需解决的问题。抑癌基因的失活是导致宫颈癌发生的重要原因，而DNA甲基化如果出

11、现在抑癌基因的位点，可引起抑癌基因表达受阻，使DNA丧失某些维持特定遗传功能的结构位点2。成对区控制基因家族（Paired box，PAX）基因是一类与哺乳动物发育基因编码蛋白调控有关的核转录因子。PAX基因家族成员与多种器官的发生、组织分化和多种细胞功能的正常活动有关，其高甲基化被报道与宫颈癌发生相关。本研究采用焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术，定量检测PAX1基因在不同程度宫颈病变组织中的甲基化表达水平，探讨抑癌基因甲基化定量检测在宫颈癌及其癌前病变筛查中的临床应用价值。1 资料与方法1.1 对象和标本组织来源取2011年1月至2013年4月在上海市闵行区中心医院妇科宫颈专科

12、门诊就诊患者的宫颈组织，经液氮保存后进行抑癌基因甲基化定量检测，以组织进行病理学诊断作为金标准，将宫颈组织分为正常宫颈组（n=28）、低级别病变组（病理诊断CIN I,n=32）、高级别病变组（病理诊断CIN II-III,n=34）以及宫颈鳞癌组(n=27)。所有对象的宫颈组织均进行人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus, HPV）定量检测。所有对象均排除妊娠、其他部位的恶性肿瘤史或免疫系统疾病史。1.2 宫颈组织DNA提取、修饰和扩增获取的宫颈组织参照试剂盒Omniscript RT kit（德国Qiagen公司）的说明进行DNA提取。将抽提的DNA进行亚硫酸氢盐处理，所

13、有步骤参照Omniscript RT kit试剂盒说明书进行。采用PCR技术对目标片段进行扩增并对产物进行电泳。PCR所需引物F1：5-TATTTTGGGTTTGGGGTCGC -3；PCR引物R1：5-CCCGAAAACCGAAAACCG-3；测序引物Sl：5-TTTTTGTTTTAGAGA GGTTAGTAAT-3。 PCR反应条件为：95预变性5min；9430s，6430s，7240s，共40个循环；72延伸10min。完成后反应产物采用2的琼脂糖凝胶电泳。涉及引物均由上海生工生物工程公司合成。QMSP扩增仪为Mx PCR系统。反应条件为：95预变性10 min；9510s，6030s

14、，7230s，共50个循环。1.3 宫颈组织抑癌基因甲基化定量检测甲基化定量采用焦磷酸测序法。按照Bio-Rad公司测序仪中甲基化分析要求，配置所需混合液：0.1mol/L Tris Ac缓冲液(pH 7.7)，2 mmol/L EDTA，10mmol/L Mg(Ac)2，0.1% BSA，1 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，3mol/L 5磷酸化硫酸腺苷(adenosine5phosphosulfate，APS)，0.4g/L PVP，0.4mmol/L D 虫荧光素，210-4 U/L三磷酸腺苷硫酸化酶，210-3 U/L 三磷酸腺苷双磷酸酶，1810-3 U/L无外切酶活性的Klen

15、ow DNA聚合酶，14.6 mg/L荧光素酶，然后测量样本基因的甲基化程度3。以9个基因位点的甲基化程度（%）的平均值代表每份标本的甲基化程度，将甲基化程度在020的标本视为无甲基化组；甲基化程度在2050视为低甲基化组；而甲基化程度50视为高甲基化组。1.4 统计分析本研究采用SPSS20.0进行统计分析。计量资料以均数标准差 (s) 表示。计数资料比较采用检验。成组资料比较采用方差分析F检验，以P0.05 为差异有统计学意义。由于国内研究和绝大部分国外类似研究都是甲基化定性分析，本研究在通过ROC曲线计算出不同病变级别下PAX1基因甲基化表达率阈值后，还将对定量研究结果判断阈值转化为定性

16、结果，进行2检验，以使本研究结果具有横向间的可比性。2 结果1 2 2.1 宫颈组织PAX1基因甲基化定量检测方法的建立PAX1基因长度为632bp，设计焦磷酸测序检测，电泳显示扩增产物与预期片段大小一致。使用 甲基转移酶处理并经亚硫酸氢盐处理的基因组 作为模板，同样扩增获得扩增子。而使用未经亚硫酸氢盐处理的基因组 作为模板，无扩增产物。表明扩增条件特异。通过焦磷酸测序能够定量检测9个 位点的甲基化水平。焦磷酸测序结果如图所示，灰色区域为 位点。根据焦磷酸测序中胞嘧啶的数目与胞嘧啶和胸腺嘧啶之和的数目相比即可获得该位点甲基化百分比。每个 位点的甲基化百分比由仪器自动计算并显示于 位点顶部的蓝色

17、区域。使用焦磷酸测序法对不同脑区的甲基化水平进行检测。图1为单一标本各位点甲基化定量检测的示例。取9个位点甲基化定量值的均值作为单一标本的甲基化定量值。图1 单个标本各位点甲基化定量检测示例2.2 临床指标的分析本研究共纳入121例研究对象，其中经病理学诊断正常宫颈28例、低级别病变(病理诊断为CIN I) 32例、高级别病变(病理诊断为CIN -) 34例、宫颈鳞癌27例。四组对象间年龄均值和高危HPV阳性病例构成比的差异存在统计学意义，HPV定量检测值差异未见统计学意义。见表1。表1 各组间年龄均值、HPV定量均值和高危HPV阳性构成比的比较指标分组统计值P值正常宫颈(n=28)低级别病变

18、(n=32)高级别病变(n=34)鳞癌(n=27)年龄（均值标准差）36.187.7138.317.6439.7110.5444.418.79F=4.310.01HPV定量（均值标准差）89.8595.77480.23702.79630.28623.751650.804595.88F=1.470.23高危HPV阳性（例）10263125X2=79.430.012.3 各组间宫颈组织PAX1基因甲基化定量水平比较PAX1基因甲基化水平方面，正常宫颈组为（4.924.45）%，低级别病变组（LSIL）为（5.555.05）%，高级别病变组（HSIL）（10.2114.39）%，宫颈癌组（CSC）为

19、（41.9723.02）%。对四组资料进行单因素方差分析，发现四个病变组存在统计学差异(F=46.43，P0.05），其他各组之间均具有显著差（P0.01）。图2 各组间PAX1基因甲基化定量检测均值比较*注：*纵轴PAX1基因甲基化均值（均值标准差），横轴：各组别，其中CT=正常宫颈，LSIL=低级别病变，HSIL=高级别病变，CSC=鳞癌。2.4 各组间宫颈组织PAX1基因甲基化表达水平的诊断阈值分析宫颈组织PAX1基因甲基化定量检测诊断宫颈鳞癌（宫颈鳞癌组VS其他各组）的ROC曲线下面积（AUC）为0.883，显著大于机会参考线下面积（P0.01）。敏感度与特异度之和的最大值所对应的界定

20、值为20.55%（敏感度81%，特异度93%），ROC曲线详见图3。图3 宫颈鳞癌PAX1基因定量水平的ROC曲线（宫颈鳞癌组VS其他各组）若在“正常+低级别病变”和“高级别病变+鳞癌”之间进行鉴别诊断，ROC曲线下面积（AUC）为0.680，敏感度与特异度之和的最大值所对应界定值8.97%（敏感度57%，特异度90%）。该界定值已是敏感度和特异度的最优组合。ROC曲线详见图4。图4 低级别及以下病变和高级别及以上病变的PAX1基因定量水平的ROC曲线（“正常+低级别病变”VS“高级别病变+鳞癌”）3 讨论关于PAX1基因与宫颈癌之间的关系，国际上目前尚属起步阶段，对某些特定基因甲基化的研究以

21、及关于某种疾病特别是基因表达调控为病因的表观遗传学研究，可能发现疾病早期诊断、治疗以及疗效评测相关的生物标志物和检验技术和方法3。现有文献认为宫颈癌组织中存在PAX1基因甲基化异常高表达3-5。国内有关宫颈癌PAX1基因甲基化的报道很少，我们的前期研究发现PAX1基因在宫颈癌组织中甲基化率高达87.5，并且在正常宫颈、宫颈鳞状上皮低级别病变（Low-grade Squamous Intra-epithelial Lesion, LSIL）、宫颈鳞状上皮高级别病变（High-grade Squamous Intra-epithelial Lesion, HSIL）以及宫颈癌的不同病程级别之间有显

22、著差异6。但这些现有报道中所使用的抑癌基因甲基化检测手段都是定性检测，样本数量很少，临床应用价值不高。本研究采用焦磷酸测序技术定量检测PAX1基因在不同程度宫颈病变组织中的甲基化表达水平，样本总量达到了121例。结果表明抑癌基因甲基化定量检测在宫颈癌组织中有较强表达，具有敏感性和特异性均较高的有点，而在高级别病变的诊断中，这一技术则在特异性方面更为突出。焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置。利用焦磷酸测序技术可以同时检测多个甲基化位点，并获得甲基

23、化程度的精确定量值7。焦磷酸测序技术基于4种酶催化的酶联化学发光反应，焦磷酸集团（PPi）在反中最终转化为可见光的信号的峰值。检测甲基化位点的峰高比，即可反映DNA的甲基化水平。焦磷酸测序法则很好地解决了基因甲基化程度定量问题，既可以对甲基化程度进行定量测量，又具有很高的可重复性和极高的准确性，在成本上也比其他高通量测序技术便宜7。本研究中利用焦磷酸测序技术对PAX1基因的9个CPG位点的甲基化程度进行了定量检测，并取均值力求结果的稳定可靠，经单因素方差分析，证实PAX1基因甲基化定量值在宫颈鳞癌组织中显著升高，但在区别正常宫颈组织和低级别病变方面并没有显著的统计学意义。表明这一检测技术在鉴别

24、高级别病变和早期宫颈鳞癌方面具有较强的应用优势。由于国际上关于PAX1抑癌基因甲基化的研究绝大多数为定性检测，因此目前没有定量检测的诊断阈值。本研究根据获得的甲基化定量检测值数据，应用ROC曲线对诊断阈值进行了分析，结果发现：对于宫颈组织的PAX1基因甲基化定量检测，只有宫颈鳞癌与其余三组比较时曲线拟合度较好，且拥有比较满意的敏感度（89%）和特异度（84%）；若要在鉴别出高级别及其以上程度的病变，虽然定量数据比较存在统计学意义且具有较强的特异性（90%），但曲线的拟合度欠佳，灵敏度较低（57%）。因此，在宫颈组织中进行抑癌基因PAX1甲基化定量检测更适合鉴别高级别病变和早期宫颈鳞癌，对于鉴别

25、宫颈低级别与高级别病变，则可作为排除性诊断措施。目前，临床上用于筛检宫颈癌的方法，主要是通过获取宫颈脱落细胞进行细胞学检测或HPV检测7。单纯的细胞学检测灵敏度和特异度均欠佳，而HPV检测虽然具有较高的灵敏度，容易检测出患有宫颈癌的个体，但其特异度欠佳而假阳性率偏高，单独使用HPV检测作为筛检工具的筛检效能目前并不推荐。本研究采用焦磷酸测序法（Pyrosequencing）定量检测宫颈组织PAX1基因的甲基化，能够较好的区分癌变与非癌变，具有很大的临床应用价值，对于高级病变也有一定的区分能力，具有很好的发展空间。过去以宫颈组织为样本的定性研究，在灵敏度和阳性预测值方面存在着欠缺，以本研究小组前

26、期报道6为例，虽然PAX1基因在宫颈癌组织中甲基化率高达87.5，但在正常宫颈、低度和高度病变组织中也存在甲基化阳性表达，因而定性检测并不能作为一个有效的诊断方法。相比之下，本次研究采用的焦磷酸测序法（Pyrosequencing）定量检测很好地弥补了上述不足，不仅同样得出既往定性检测中“癌变组织中的PAX1基因甲基化水平远高于其他组”的结论，还提示定量检测技术在诊断宫颈鳞癌方面兼顾了敏感度和特异度，具有应用于临床的潜力8。总之，本研究的结果表明，利用焦磷酸测序法（Pyrosequencing）定量检测宫颈组织中PAX1基因的甲基化具有较高的灵敏度和特异度，尤其适用于宫颈高级别病变和早期鳞癌的

27、筛查，是在高危人群中筛选出早期宫颈癌的有效方法。【参考文献】1. Neville F H, Jonathan S B, Barbara L A, et al. Paractical gynecologic oncology. 4/E, United States: Arrangement with Lippincort Williams and Wilkins, 2005, 215-224.2. Kan YY，Liou YL，Wang HJ，et al PAX1 Methylation as a Potential Biomarker for Cervical Cancer Screening

28、Int J Gynecol Cancer，2014，24(5)：928-934.3. Huang TH, Lai HC, Liu HW. Quantitative analysis of methylation status of the PAX1 gene for detection of cervical cancer. Int J Gynecol Cancer. 2010, 20(4):513-519.4. Lim EH, Ng SL, Li JL, et al. Cervical dysplasia: assessing methylation status (Methylight)

29、of CCNA1, DAPK1, HS3ST2, PAX1 and TFPI2 to improve diagnostic accuracy. GynecolOncol. 2010, 119(2):225-231.5. Lai HC, Lin YW, Huang RL, et al. Quantitative DNA methylation analysis detects cervical intraepithelial neoplasms type 3 and worse. Cancer. 2010, 116(18):4266-42746. 徐军，王红琳，陆杲川，等. 宫颈癌组织CDH1和

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