用Quantity One进行定量分析的方法.docx

1、用Quantity One进行定量分析的方法用Quantity One进行定量分析的方法 生物技术 2009-09-06, 21:17 叶林 Quantity One是Bio-Rad公司的凝胶电泳图像获取、处理以及定量分析软件。功能很强大，到底多么强大在这就不说了。用处很多，到底多么多在这也不说了，具体功能请参考Quantity One使用说明及相关教程。下面只是Quantity One用于DGGE结果定量分析的一般操作方法：有下面这么一张DGGE图像，需要分析一下左边第5条泳道的8个条带对应的DNA在样品中占的百分比各分别是多少。第一步：建立泳道点击菜单栏“Lane-Auto Frame L

2、anes”，一般情况下Quantity One会自动识别并建立泳道。但也有很多时候不能自动建立泳道，这就需要选择菜单栏“Lane- Frame Lanes”然后输入要建立泳道的数目，手动建立泳道。泳道建立后需要调整，在菜单栏“Lane-Edit Frame”中有拉伸、旋转、移动、添加/删除锚点等选项，通过这些选项可以对泳道进行调整，调整后大致如下：第二步：消除泳道背景点击菜单栏“Lane-Lane Background”跳出一个对话框，“All Lanes”中选择第二个，然后点一下第5条泳道，“Selected Lane”的下面会显示Selected Lan:#5(#5)，然后选择”Lane

3、On“ Rolling Disk Size中填一个1020之间的数(可以多尝试几个，看看效果)，最后点“Done”完成操作。第三步：建立条带点击菜单栏“Band-Detect Bands”打开一个对话框，调整Sensitivity和Lane Width的数值，使每个条带都被检测到，如果条带上面显示的是一条红线，可以在“Band-Band Attributes”的Style栏中选择Brackets，使之显示为括号形式。条带建立后图像显示如下：第四步：生成报告点击菜单栏“Report-Lane Report”然后点一下第五条泳道，在弹出的对话框的Measurements 一栏中选择Trace Qt

4、y (个人感觉选择这个比较合适，也可以选择其他的看看效果)，然后点Report，就看到了每个条带的Trace Qty值，这个值与DNA的浓度呈正比，根据这个值计算百分比即可。以上仅仅是Quantity One进行定量的简单流程，非常不具体，一些具体的参数设置及软件的其它功能请参考相关的使用说明或教程。另外，不确定上面的操作是否有不当之处，如有请多指教。需要特别说明的一点是：对于一个从复杂的环境样品中提取的DNA，经过PCR-DGGE，然后用Quantity One定量，通过分析每条条带的intensity来计算百分比，然后估计原始样品中各个物种（比如细菌）的百分比，这样的做法是非常不准确的，这

5、种数据发paper可能不会被接受，因为整个过程中存在很多Bias。同理，T-RFLP也存在类似问题。Quantity One施用教程大全（转贴）2010-11-11 09:531 - 内容简介 凝胶电泳是每个做份子有生命的物质学的同窗天天都要打交道的基本技术。电泳然后的信息处理与电泳本身同样重要。今朝有大量软件可以用于分析电泳结果，比较有名的比如BandScan、BandLeader、Sigma Gel等等。今日要向大家介绍的是来自Bio-Rad的1D凝胶定量软件Quantity One（Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件PDQuest）。这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的主页不

6、收费下载。今朝的最新版本是4.52版 2 - Quantity One的定量方法 Quantity One的分析功能顾名思义首要用来举行凝胶或培养皿的荧光定量分析。它的分析功能或说分析方式首要有4种：泳道/条带轨迹定量法；等高线直接定量法；菌落计数；份子量测定 - - - 这三种方法中施用最为利便也是最为广泛的应该是等高线定量法（Volumn Contour）。它经由过程半AUTO描绘电泳条带的等高线边沿来得到等高线区域内部平面或物体表面的大，再将该平面或物体表面的大乘以区域内平均光疏密程度值当到条带内部总的信号量。固然这种分析方法的蠹弊显而易见：无法同等得排除不同泳道的配景亮度；等高线的绘制

7、处于“半AUTO”状态，即需要人为判断作为等高线标准的电泳条带的边沿；最致命的是在几个电泳条带距离十分接近的时辰几乎无法绘制纯一条带的轮廓（常出现持续的几个条带等高线相连而无法分离出独自条带的轮廓）。 三种方法中个人感觉最为科学和严谨的应该是泳道/条带轨迹定量法（Trace Tracking）。这种方法施用起来步调较为繁琐，必需经由过程泳道识别-电泳条带识别两个持续的步调才气举行定量。然而这种方式的最大长处在于它可以纯粹丢弃人为主观因素举行全AUTO定量。他的定量方式为：首先根据不同电泳条带的光疏密程度值绘制光疏密程度曲线，然后计算光疏密程度曲线下平面或物体表面的大作为电泳条带的定量根据。大家

8、可能会问他能不能排除泳道配景？谜底是必定的，它能够最大程度的排除不同泳道之间的配景差异，让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎不异的开始跑线上举行相比较。这个配景排除功能是等高线法无法做到的（等高线法也有基本的配景排除措施，但是和泳道/条带轨迹定量法的配景排除不是一个等级的。等高线法只能排除同一泳道上的配景，而不能均等的排除不同泳道的配景）。另外泳道/条带轨迹定量法还可以联合Gauss Model Bands对紧密相连的电泳条带举行分析，而这种条带也是等高线法无法分析的。我们这次重点学习这个方法。 第三个分析功能是菌落计数（Colony Counting）。这个功能其实很实用，可以分析蓝白筛选的

9、结果。但是很奇怪My computer居然无法运行这个功能， 因此无法向大家介绍了。 另外Quantity One还可以经由过程回归曲线测定份子量。 下面让我们了解一下Quantity One经常使用的基本菜谱操作。 - - - 打开文件：由于Quantity One是Bio-Rad的硬件组成一套软件，因此Quantity One可以AUTO输入来自Bio-Rad公司的凝胶分析仪的数据。具体支持哪些硬件大家可以在“Edit-Preference-Imagers”里面设置。如果您的实验室没有接纳Bio-Rad的硬件设施也没瓜葛。您只要将电泳图片用ACDSee等程序转换为TIF图片格式就能够被Qu

10、antity One识别了。注重Quantity One只支持8位和16位灰度的TIF文件。 Quantity One彷佛有一个小bug，就是在按“Open”然后并没有立刻弹出资源管理器让你选择方针文件的位置。其实你只要将鼠标在荧幕右下方点击一下，资源管理器就会乖乖弹出来了. Quantity One只能分析白的颜色配景 玄色条带的电泳图。而我们正常环境下得到的一般都是玄色配景 白的颜色条带的电泳图。我们可以在“Image-Invert data中将图片颜色举行反转，然后即可以用Quantity One举行分析了. 文字注解：Quantity One提供基本的文字注解功能。您可以在您的电泳图片

11、上记载您的分析结果比如电泳条带的份子量、光疏密程度值、事物的量等等。这个功能可以经由过程“Edit-Text Overlay Tools”来使成为事实。在弹出的浮动工具栏入选择“ABC”或“”就能够举行文字输入和画标志线的操作。 光疏密程度工具：在“View-Plot Density”的下级菜谱中大家会见到几个和电泳条带光疏密程度值相干的预示选项。大家可以别离选择不同的选项感受一下它们之间的不同。选择方法是点击响应的下级菜谱比如“Plot Cross Section”，然后将变成带一个蓝色感慨号的鼠标移到您想懂得光疏密程度的位置，点击一下就会预示该处的光疏密程度相干信息。鄙人面这幅图片中我们可

12、以看见两条黄线交叉处的电泳条带的相干信息。上方的一串曲线是不同泳道之间在同一平行线上的光疏密程度比率曲线；左边是黄线交叉处地点泳道的几个电泳条带的光疏密程度漫衍环境。 3D Viewer：在“View-3D Viewer”菜谱中大家会看到一个有趣的功能叫做3D Viewer。这个玩意按照Bio-Rad的说法可以辅助鉴别几条紧密相连在一路的电泳条带的漫衍环境。大家只要选择了这个号令后鼠标就会一个“ ”型，然后将 型移动到您感兴趣的位置，拖动鼠标画出一个正方形区域，然后用鼠标双击，Quantity One就会将这块区域按照gauss漫衍规律渲染成一个三维模子，颇有意思。但个人感觉这个功能噱头多于实

13、用。 4 - Quantity One的基本配景排除功能 最起头的时辰我们就说过Quantity One的等高线定量模式也有一种比较基本的配景排除方法。这个方法同样也合用于泳道/条带定量模式。此刻我们就来学习这个方法。基本配景排除的功能位于“Image-Substract backgroud.”和“Image-Filter Wizard.”这两个菜谱。 - - Image-Filter Wizard：这个功能是对原始图片做一些开真个加工，主如果祛除一些图片上的“斑点”。这些斑点首要有两种类型：一种是深色的“胡椒面”型和淡色的“食盐”型，两种斑点都可以毫不犹豫地去除。从“Image-Filter

14、 Wizard.”菜谱调出向导菜谱后选择“pepper”和“salt”，下面两个选项可以按照程序默许的选项，然后“OK”就能够完成这第一步的降噪历程。 Image-Substract backgroud：这个功能是真正对图片配景举行清理的工具（区别于“Image-Filter Wizard.”的降噪模式）。只是这种清理是一种“全局”型的清理，即它以不异的参量对每条泳道举行配景清理。然而在清理方式上它照旧可以分成两种不同的方式： Backgroud Box：一种是以一个局部小平面或物体表面的大为标准配景，将整张电泳图片上所有比该区域光疏密程度值低的区域全部漂白。这种发型称为“Backgroud

15、Box”。操作时用鼠标选中对话框下部左侧的“Backgroud Box”按键，然后用鼠标在电泳图片上选择一块颜色近乎配景色，色泽比较匀称的区域，用鼠标拖动画出一个正方形。开释鼠标后程序就会当即对电泳图片举行降低配景的处理； Backgroud Stripe：相对于“Backgroud Box”来讲是一种更加智能化的处理方式。它出格合用于梯度凝胶，即凝胶浓度由上至下依次变化。由于梯度胶的光疏密程度值在一定距离内不断变化，因此如果接纳“Backgroud Box”的方法除配景就会发生偏差。Quantity One此时提供一种随着凝胶浓度变化而变化的除配景方式就是“Backgroud Stripe”

16、。和“Backgroud Box”近似，选择右下角的“Backgroud Stripe”按键，然后用鼠标沿着电泳泳道拖放形成一个狭长的剪影带（Stripe），这个剪影带内部的光疏密程度值顺着泳道逐渐升高或降低。Quantity One根据这个Stripe可以动态的对整张图片的配景举行剪影。比如泳道肇始处光疏密程度低，那末Quantity One在此处的剪影值也降低；随着Stripe向前延长，光疏密程度值逐渐升高，Quantity One也同样不断加大剪影的强度。这样一来就能够排除由于梯度胶带来的配景不相符的影响因素。 5 - Quantity One的电泳泳道分析功能-创建泳道 前面说过Qua

17、ntity One之所以强大是因为它具有的泳道/条带轨迹定量法。此刻我们就来学习一下如安在电泳图片上创建泳道（Lane）和怎样举行针对不同泳道的配景排除。 - - 创建泳道：首先打开我们要分析的电泳图片（以卵白质电泳为例）。然后选择“Lane-Auto Frame lanes”。这时候如果您的电泳图片比较标准的话，Quantity One就会AUTO识别出每条电泳泳道的位置，而且将各个泳道的路径用一条红线标画出来； 如果您对软件AUTO标志的泳道不甚对劲，您可以经由过程“Lane-Edit Frame”下级各个子菜谱提供的功能对泳道框架位置、大小等举行调节。调节方法就是经由过程鼠标的拖放来使成

18、为事实，大家可以本身体验一下； 如果您只消分析此中几个泳道的数据而不想其它泳道的标志滋扰您的眼看东西假想线，您可以经由过程“Lane-Single Lane-Remove Lane”删除您不需要的泳道的标志。 不是所有的电泳图片的泳道都能够被Quantity OneAUTO识别。在不能AUTO识别的环境下，Quantity One就会弹出对话框告诉您它不能识别泳道。这时候大家就需要手工绘制电泳泳道。方法和上边同样，同过“Lane-Single Lane-Creat Lane”来使成为事实。只要用鼠标在您的电泳图片上顺着待标志的泳道的中轴线拖放就能够绘制出该泳道的标志红线. 6 - Quanti

19、ty One的电泳泳道分析功能-排除配景 前面说过Quantity One之所以强大是因为它具有的泳道/条带轨迹定量法。此刻我们就来学习一下如安在电泳图片上创建泳道（Lane）和怎样举行针对不同泳道的配景排除。 - - 排除配景：首先请大家注重，这个排除配景和前面我们在“Image”菜谱中施用的“Substruct Backgroud”有所不同。后者排除配景的对象是全般电泳图片而非将各个电泳泳道的配景别离举行排除。此刻我们要学习的这个号令可以帮忙我们别离排除各个泳道（也能够将全部泳道用不异标准举行排除）的不同的光疏密程度配景。这个功能对我们以后的分析影响甚大，大家一定好好学习。 首先我们要将我

20、们的电泳图片举行前面谈到的泳道识别，不论是AUTO方式照旧手工识别。然后选择“Lane-Lane Backgroud.”号令。选择该号令后，鼠标即变成一个绿颜色的“ ”，将鼠标移到您筹算举行配景排除的泳道（比如下图中的第4泳道），点击左键一下，立刻就会弹出如下图所示的对话框。 此中“Optical Density”预示得是该泳道光疏密程度值的漫衍环境。大家会注重到这个漫衍曲线其实不是紧贴着纵轴，而是位于纵轴上方漫衍。造成这个“悬在空中现象”的缘故原由就是该泳道自身存在着一定的光疏密程度“配景”。这个配景的存在导致该泳道上各个电泳条带之间不能处于同一水平举行相比较；如果思量到相邻的其它泳道更是因

21、为不同配景的存在而无法相比较不同泳道上的不同电泳条带。怎样去除这个配景呢？我们继续看右面的“Lane Backgroud Substruction”对话框。这个对话框的上方“All Lanes”表示可以对所有泳道举行一次性处理；下方的“Selected Lane”表示仅针对这次选中的这个泳道举行处理（我们选中的是第4泳道）。我们用鼠标选择“Selected Lane”的“Lane On”选项。然后鄙人面的“Rolling Disk Size”里填上“5”，再按“回车”键。好！大家再来看看此刻“Optical Density”中出现了一条紧紧沿着光疏密程度曲线漫衍的深赭色曲线。这条曲线将泳道的配

22、景与电泳条带的光疏密程度漫衍十分精确的区分清楚隔来。 大家可能会好奇这搭的“Rolling Disk Size”指得是啥子意思？我们可以将Quantity One提供的去除配景功能想象成是一个骨碌的小球。如果这个小球的半径越小，那末它沿着光疏密程度曲线骨碌时滚过的路径就越发精致，具体反映在深赭色曲线的轨迹越发靠近玄带颜色的光疏密程度漫衍曲线的基线。因此从理论上来讲“Rolling Disk Size”的取值越小，它的去除配景效果越好。大家可以试着选择一个较大的值比如80，再来看看此时深赭色曲线的轨迹。固然也不能取过小的值。因为如果取值过小，大家可以想象这个十分微小的球就会滚入光疏密程度曲线内部

23、，造成有用阳性信号的损失。个人感觉520是一个比较好的取值范围. OK！我们再在“Lane Backgroud Substruction”对话框的最下方钩选“Show Lane Trace with Backgroud Substructed”，再来看看是否泳道上所有的配景都被消弭了？各个电泳条带是否纯粹联合到纵轴上在同一水平举行比较了？ 我们对其它泳道也能够依葫芦画瓢举行近是的配景排除工作。如果大家觉得可以施用同样的标准，即不异的“Rolling Disk Size”举行排除，那末我们可以在“Lane Backgroud Substruction”对话框入选择上方的“All Lanes On

24、(same level)”选项。然后在“Rolling Disk Size”中填上一个合适的值，点击“Done”按键确认就能够了。此时该电泳图片上所有的泳道都以不异的标准举行了配景去除。不信你可以本身将鼠标点击其它泳道（比如第8道或第1道），你会发明所有泳道的配景均已去除。 7 - Quantity One的电泳泳道分析功能-相比较泳道 刚才我们已经对电泳图片上的泳道举行了识别和配景去除。此刻我们可以利用Quantity One提供的泳道相比较功能对同一张凝胶相片上的不同泳道举行相比较，看看每条泳道上电泳条带的漫衍环境。 - - 泳道相比较：首先将打开的电泳相片举行前面谈到的泳道识别和去除配景

25、步调。然后选择“Lane-Compare Lanes”号令，鼠标变成“蓝色感慨号”然后将鼠标移动到您但愿举行相比较的泳道上（比如下图的第3泳道），左键点击，Quantity One就会立刻探出一张玄色配景的“Compare Lanes”对话框。在这个对话框中红色的曲线代表您选择的泳道的光疏密程度漫衍曲线。曲线的波峰部门表示位于泳道上的不同电泳条带；波峰的凹凸象征电泳条带光疏密程度值的大小；波峰的宽窄象征电泳条带的宽度；波峰由左至右表示各个电泳条带顺着泳道由后向前的漫衍。 大家请注重这个红色曲线。它不仅只提供给我们关于泳道上光疏密程度的漫衍环境，更重要的是鄙人一步我们对电泳条带举行定量的时辰，我

26、们将以每个波峰的曲线下平面或物体表面的大作为定量的标准. 我们还可以用鼠标点击其它我们感兴趣的泳道（比如下图中第六、9、14泳道），这时候再转到“Compare Lanes”对话框我们会发明Quantity One已经帮我们用不同颜色在同一张图片上绘制出了这4条泳道的相比较图。是不久短常PP？ 8 - Quantity One的电泳条带分析功能-创建条带 前面我们已经识别和分析了电泳图片的泳道，下面我们起头研究电泳条带的问题。首先在这搭明确两个名词翻译：“Lane”指电泳泳道；“Band”指电泳条带。鄙人类社会文化中一例施用这两个英文名词来表示这两个意思。 - - 电泳条带的识别：和前面研究L

27、ane同样，首先我们要对Lane上的Band举行识别。识别方式同样分为AUTO识别和人工识别。AUTO识别的时辰选择“Band-Detect Bands.”号令。这时候Quantity One会AUTO弹出一个“Detect Bands”的对话框（如下图）。 首届用Quantity One的朋友可能会发明您的Bands识别以后仅只是画出了一条红色的粗线，而在上边的演习图片中倒是上下括号的形式。其实大家可以在“Band-Band Attributes”选项中设置Bands的预示形式。鄙人方的“Style”选项卡入选择“Brackets”就会将原来的粗线改为括号形式了. 在上边的对话框中，我们可以

28、指定识别的参量。 如果要AUTO识别所有Lanes上的Bands就钩选Lands后面的“All”选项；如果仅只想AUTO识别某一条Lane上的Bands就钩选“One”，然后在后面的输入框中填上您想识别的泳道号码； 如果仅只想识别泳道上部门光疏密程度值最强的Bands，可以在“Bands”后面的选项入选择“Limit”，然后填上响应的数目（比如10）。Quantity One就会仅识别该泳道上光疏密程度最大的10条Bands； 如果您发明AUTO识别的Bands宽度太窄，圈定Band的红色括号内范围小于玄色的光疏密程度影。此时可以施用“Lane Width”号令来调整Bands识别的宽度。用鼠

29、标点击“Lane Width”后面的向上箭头就会发明红色括号逐渐变宽，最后要求其范围略为宽过其包绕的Band影迹； 如果您发明AUTO识别功能没有识别您想要的Band或误识别了您不想要的Band，您还可以施用上边的工具栏举行调整。将您的鼠标指向每个图标，Quantity One就会懂得弹出一个*的提示信息告诉您这个按键的功能。在此再也不继续阐述了。 9 - Quantity One的电泳条带分析功能-高斯建模与结果分析 此刻我们已经完成为了泳道识别、配景去除、条带识别的任务。接下来我们要对Bands举行一些处理，然后就能够举行最终的结果分析了。 - - 高斯建模：大家学过计数学知识后都懂得高斯（Gauss）漫衍是个啥子意思，在此我就未几作解释了。Quantity One认为一个理想状态的Band内部的光疏密程度漫衍应该也服从高斯曲线的特性，正如前面向大家展示的3D Viewer中的图片那样。在我们同样平常的电泳泳道中