高效液相色谱法同时测定丹参药材水溶性和脂溶性成分的含量翟学佳.docx

1、高效液相色谱法同时测定丹参药材水溶性和脂溶性成分的含量翟学佳药品质量控制高效液相色谱法同时测定丹参药材水溶性和脂溶性成分的含量*翟学佳1,徐锦凤2(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科,武汉430022;2.武汉市中心医院心电图室,430014摘要目的建立丹参药材水溶性成分中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B 和脂溶性成分中二氢丹参酮I 、隐丹参酮、丹参酮I 、丹参酮I I A 的含量测定方法。方法采用高效液相色谱法测定,色谱柱为汉邦C 18色谱柱(4.6m m250m m ,5m ;流动相A 为0.1%甲酸-水(V /V ,流动相B 为乙腈,线性洗脱梯度为010m i n ,B 相10%20

2、%,1027m i n ,B 相20%33%,2730m i n ,B 相33%70%,3050m i n ,B 相70%85%;柱温:20;流速:1m L m i n -1;进样量:10L ;检测波长:280n m 。结果丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B 、二氢丹参酮I 、隐丹参酮、丹参酮I 和丹参酮I I A在0.0372118.0000,0.01748.9000,0.141450.000,0.018856.8000,0.0497158.0000,0.021578.5000,0.0962308.0000m g L -1浓度范围内均呈良好线性关系(R 20.9992;各成分的平均加样回收率均在98

3、.5%101.5%,R S D 均1.98%(n =6;日内日间精密度良好,R S D 均2.16%。结论该方法简便、准确、重复性好,可用于丹参药材的含量测定。关键词丹参;丹参素;丹酚酸B ;二氢丹参酮I ;色谱法,高效液相中图分类号R 282.71;R 927.2文献标识码A 文章编号1004-0781(200910-1345-04S i m u l t a n e o u s D e t e r m i n a t i o n o f H y d r o p h i l i c a n dL i p o p h i l i c C o m p o u n d s i nR a d i x

4、S a l v i a eM i l t i o r r h i z a e b y H P L CZ H A I X u e -j i a 1,X U J i n -f e n g 2(1.D e p a r t m e n t o f P h a r m a c y ,U n i o nH o s p i t a l A f f i l i a t e dw i t hT o n g j i M e d i c a l C o l l e g e ,H u a z h o n g U n i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d T e c h n o

5、 l o g y ,W u h a n 430022,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f E C G ,C e n t r a l H o s p i t a l o f W u h a n C i t y ,W u h a n 430014C h i n a A B S T R A C T O b j e c t i v e T o e s t a b l i s h a m e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f t h e h y d r o p h i l i c o f d a n s h e

6、n s u ,p r o t o c a t e c h u i c a l d e h y d e ,s a l v i a n o l i c a c i dBa n dl i p o p h i l i cc o m p o u n d s o f d i h y d r o -t a n s h i n o n eI ,c r y p t o t a n s h i n o n e ,t a n s h i n o n e I a n dt a n s h i n o n e I I A i nR a d i x S a l v i a e M i l t i o r r h i z

7、a e .Me t h o d s C h r o m a t o g r a p h y w a s p e r f o r m e d o n a L i c h r o s p h e r -C 18c o l u m n (250m m 4.6m mi .d .;5m p a r t i c l e s i z e .T h e s e p a r a t i o n w a s a c h i e v e db y a l i n e a r g r a d i e n t e l u t i o n .M o b i l e p h a s e w a s t h e m i x

8、t u r e o f s o l v e n t A(1%a q u e o u s f o r m i c a c i d a n ds o l v e n t B(a c e t o n i t r i l e .T h e g r a d i e n t e l u t i o n w a s c o n d u c t e da s f o l l o w s :10%-20%Bi n 0-10m i n ,20%-33%Bi n 10-27m i n ,33%-70%Bi n 27-30m i n ,a n d 70%-85%Bi n 30-50m i n .T h e i n j

9、 e c t i o n v o l u m e o f 10La n d t h eU Vw a v e l e n g t h o f 280n mw e r e u s e d i n t h e a n a l y s i s .T h e f l o wr a t e w a s 1.0m L m i n -1a n d t h e c o l u m n o p e r a t e d a t 20.R e s u l t s Ag o o d l i n e a r i t y w a s ob t a i n e dw i t ht h ec o r r e l a t i o

10、 nc o e f f i c i e n t s o f t a n s h i n o l ,p r o t o c a t e c h u a lde h y d e ,s a l v i a n o l i ca c i dB ,d i h y d r o -t a n s h i n o n e I ,c r y p t o t a n s h i n o n e ,t a n s h i n o n eIa n dt a n s h i n o n eI I A r a n g e df r o m 0.0372-118.0000mg L -1,0.0174-8.9000m g L

11、 -1,0.141-450.000m g L -1,0.0188-56.8000m g L -1,0.0497-158.0000m g L -1,0.0215-78.5000m g L -1,0.0962-308.0000m g L -1(R 20.9992,r e s p e c t i v e l y .Th e a v e r a g e r e c o v e r y r a t e s o f t h e f o u ri n v e s t i g a t e d c o m p o u n d s w e r e i nt h e r a n g e o f 98.5%-101.

12、5%f o r a l l w i t h R S Db e l o w 1.98%(n =6.T h e i n t r a -d a y a n d i n t e r -d a y p r e c i s i o n o f t h e a s s a y w e r e n o m o r e t h a n 2.16%(n =6.C o n c l u s i o n T h e m e t h o di s a c c u r a t e a n dr e l i a b l e w i t h g o o dr e p r o d u c i b i l i t y ,a n d

13、 c a nb e u s e da s a d e t e r m i n a t i o n s t a n d a r d f o r R a d i x S a l v i a e M i l t i o r r h i z a e .K E YWO R D S R a d i x S a l v i a e M i l t i o r r h i z a e ;D a n s h e n s u ;S a l v i a n o l i c a c i dB ;D i h y d r o -t a n s h i n o n e I ;H P L C丹参系唇形科植物丹参(S a l

14、v i a m i l t i o r r h i z aB g e .的干燥根及根茎,味苦,性微寒,具有祛瘀镇痛、活血通经、清心除烦的作用,广泛用于冠心病、肝炎、月经紊收稿日期2008-11-26基金项目*国家重点基础研究发展计划(973计划项目(基金编号:2005C B 523402作者简介翟学佳(1983-,女,湖北武汉人,药师,硕士,从事药物质量标准研究。电话:027-*,E -m a i l :z h a i x u e j i a g m a i l .c o m 。乱、骨质疏松、慢性肾衰竭、血液循环以及其他心血管疾病的治疗13。丹参主要含有两类成分,水溶性的酚酸类化合物,如丹参素

15、、原儿茶醛以及丹酚酸B 等,脂溶性的二萜醌类化合物,如二氢丹参酮I 、隐丹参酮、丹参酮I 以及丹参酮I I A 等47。现代药理学研究表明,丹参中酚酸类和二萜醌类成分均具有显著的生物活性810。因此,可以通过测定这些化合物的含量来评价丹参的质量。笔者采用高效液相色谱(H P L C 法建立一种同时测定丹参中7种活性成分(丹参素、1345医药导报2009年10月第28卷第10期原儿茶醛、丹酚酸B 、二氢丹参酮I 、隐丹参酮、丹参酮I 和丹参酮I I A 的分析方法,并用于15个产地丹参药材中该成分的含量测定。1仪器与试药1.1仪器A g i l e n t 1100型高效液相色谱仪,包括四元梯度

16、泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱和紫外检测器;M E T T L E RA E 240电子天平(梅特勒-托利多上海有限公司;T G L -16C 台式离心机(上海安亭科学仪器厂。1.2试药丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B 、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I 、丹参酮I I A 均购于中国药品生物制品检定所;乙腈、甲醇(色谱纯,德国M E R C K 公司;甲酸、冰醋酸(色谱纯,美国T E D I A 公司;磷酸(分析纯;M i l l i -Q 超纯水(M i l l i p o r e 公司,美国。丹参药材均由浙江大学药学院贺庆副教授鉴定。2方法与结果2.1色谱条件色谱柱:汉邦C 18色谱柱(4.

17、6m m250m m ,5m ;流动相A 为0.1%甲酸-水(V /V ,流动相B 为乙腈,线性洗脱梯度为010m i n ,B 相10%20%,1027m i n ,B 相20%33%,2730m i n ,B 相33%70%,3050m i n ,B 相70%85%;柱温:20;流速:1m L m i n -1;进样量:10L ;检测波长:280n m 。2.2对照品溶液制备分别精密称取丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B 对照品适量,以1%醋酸-甲醇(V /V 溶解制得酚酸类对照品储备液;分别精密称取二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I 、丹参酮I I A 对照品适量,以甲醇溶解制得二萜醌类对照品储备液

18、。分别将以上各对照品储备液稀释配成0.037118.000,0.0178.900,0.14450.00,0.01856.000,0.049158.000,0.02178.500,0.096308.000g m L -1的7个不同浓度的对照品溶液。2.3供试品溶液制备将丹参药材粉碎成粗粉,精密称取约0.5g ,加入70%甲醇-水(V /V 40m L ,(203控温超声60m i n ,再以70%甲醇-水(V /V 定容至50m L ,摇匀,取上清液,10000r m i n -1离心10m i n (离心机半径57.84m m ,备用。2.4专属性考察取混合对照品溶液、丹参供试品溶液,按“2.

19、1”项色谱条件进样分析,采用D A D 检测器检测,波长扫描范围:190400n m 。7种丹参成分均通过与对照品的保留时间及光谱图对比进行确认,并经峰纯度检测。7种丹参成分峰纯度值均在阈值内,方法专属性良好。丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B 、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I 、丹参酮I I A 的保留时间分 别为6.0,10.7,24.9,37.5,40.7,41.6和46.0m i n 。图1丹参药材的H P L C 色谱图1.丹参素;2.原儿茶醛;3.丹酚酸B ;4.二氢丹参酮;5.隐丹参酮;6.丹参酮I ;7.丹参酮A2.5线性关系考察分别将不同浓度的对照品溶液进样分析,以各成分的峰面积为纵

20、坐标(Y ,浓度(X 为横坐标,分别计算各成分的线性回归方程及相关系数。检测限和定量限分别以信噪比为3和10计算,其结果见表1。2.6精密度实验2.6.1仪器精密度将丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B 、二氢丹参酮、隐丹参酮、丹参酮I 、丹参酮I I A 混和对照品溶液连续进样6次,计算各成分峰面积的R S D 值,结果表明所有成分峰面积的R S D 值均1.32%。2.6.2日内、日间精密度分别取同一批次的丹参药材粗粉6份,按供试品制备方法制备供试品溶液,进样分析,以外标法计算药材含量,计算日内精密度。连续6d 分别取同一批次的丹参药材粗粉,按供试品制备方法制备供试品溶液,按“2.1”色谱条件进行分

21、析,以外标法计算药材含量,计算日间精密度。结果日内精密度R S D1.79%,日间精密度R S D2.16%。2.7稳定性实验取丹参供试品溶液,分别于0,3,6,9,12,18和24h 进样分析,结果各成分的峰面积R S D 均2.84%,表明供试品溶液在24h 内保持稳定。2.8加样回收率实验取已知含量的丹参药材粗粉0.25g ,精密称定,加入一定量的7种对照品溶液,按供试品制备方法制备供试品溶液,按“2.1”色谱条件进行分析,以外标法计算含量,并计算加样回收率,结果见表2,各成分回收率均在98.5%101.5%,R S D1.98%。2.9含量测定将上述H P L C 分析方法用于全国15

22、个产地丹参药材7种成分的含量测定,结果见表3,不同产地的丹参药材中活性成分的含量存在明显的差异,而G A P 种植基地的丹参药材中活性成分的含量均一、稳定。因此推广药材规范化种植方法,有利于提高药材质量稳定性。3讨论3.1色谱柱的选择考察3个厂家相同规格的色谱1346H e r a l d o f M e d i c i n e V o l .28N o .10O c t o b e r 2009表1各种活性成分线性方程、检测限和定量限活性成分回归方程R2线性范围/(g m L -1检测限/(n g m L -1定量限/(n g m L -1丹参素Y =(6.3610.134X -(1.254

23、0.9670.99960.0372118.000014.30.137.20.2原儿茶醛Y =(47.0170.694X+(0.8910.1130.99990.01748.90006.90.117.40.1丹酚酸BY =(10.6230.195X-(6.6076.5100.99940.1410450.000048.70.4141.01.2二氢丹参酮I Y =(39.2340.503X +(11.4100.7990.99970.018856.80007.00.118.80.2隐丹参酮Y =(21.5000.216X +(21.0463.3900.99960.0497158.000017.60.14

24、9.70.5丹参酮Y =(12.1460.191X +(4.8751.2900.99980.021578.50008.10.121.50.2丹参酮AY =(37.2280.142X-(46.2178.9000.99920.0962308.000033.40.296.20.9表2丹参药材中7种中化合物的提取回收率实验结果编号活性成分已有量/m g 加入量/m g平均测得量/m g平均回收率/%R S D /%1丹参素0.1350.1370.274101.51.712原儿茶醛4.70010-35.67010-31.04010-2100.51.513丹酚酸B 15.50015.20030.50098

25、.71.134二氢丹参酮0.1640.1370.29998.51.935隐丹参酮0.5600.3990.961100.51.526丹参酮0.9020.6561.560100.31.677丹参酮A0.6830.4991.18099.61.98表3不同产地丹参药材7种活性成分的含量g g-1编号产地丹参素原儿茶醛丹酚酸B 二氢丹参酮隐丹参酮丹参酮丹参酮A 1山东三山沟4.771022.334.431046.941022.761032.711032.951032山东岳庄2.2410215.705.951041.071025.261021.211031.381033山东大张庄2.5710219.603

26、.021048.951022.491031.481031.491034山东平色8.1210240.103.371041.901023.801029.211028.791035山东蒙阴2.1710211.005.321046.501022.691032.891032.811036四川中江石泉二村1.191031.515.821047.111.841024.211021.371037四川中江石泉四村7.161023.892.801043.98102.001023.881021.081038四川荷花池8.321023.895.561041.211023.011023.521021.041039河南平

27、顶山1.8510329.305.901043.621029.181021.611031.7410310河南卢氏1.231031.732.441043.91109.34103.901024.9810211河南鲁山4.4210233.904.091044.201021.011031.381031.2710312广东清平5.491022.591.651041.111021.501023.411023.0710213云南菊花苑4.9510239.202.1310415.503.353.561024.0110214河北安国5.161021.085.071045.511023.131032.841033.

28、7810315生产基地(0202085.1110222.905.701046.201021.981032.991032.3010316生产基地(0202095.1710221.806.101045.941021.951033.001032.3010317生产基地(0202105.0910220.306.111045.891021.931033.011032.2910318生产基地(0202114.9710218.905.881045.861022.041033.241032.6010319生产基地(0202125.1210220.305.881045.841022.051033.301032.

29、6010320生产基地(0202135.2010222.406.291047.051022.351033.591032.7810321生产基地(0202145.3210220.006.351047.161022.441033.611032.8410322生产基地(0202155.3610220.706.161046.641022.291033.531032.8510323生产基地(0202165.0810222.606.161046.831022.261033.671032.8210324生产基地(0202175.4410220.505.961046.401022.131033.311032.

30、6810325生产基地(0202195.3510219.606.141046.461022.211033.451032.6110326生产基地(0202205.5710220.506.151046.461022.201033.371032.6310327生产基地(0202215.4810220.006.091046.571022.261033.491032.7310328生产基地(0202225.5910219.806.101046.581022.251033.481032.731031347医药导报2009年10月第28卷第10期柱:Y M C -P A C K -O D S ,Z O R B A X -S B -C 18和汉邦C 18色谱柱,规格均为(4.6m m250m m ,5m ,实验结果表明汉邦色谱柱最适合分离丹参中各类成分,峰形较对称,于是选择该色谱柱进行分析。3.2流动相体系的选择分别考察甲醇-水和乙腈-水体系,结果表明,乙腈-水体系洗脱能力较强,分离效率较高,分离速度较快,故选择乙腈-水体系进行分离。3.3酸种类的选择由于丹参药材中水溶性成分主要为酚酸类,酸化的流动相可以抑制酚酸类成分解离,减少色谱峰拖尾。分别在水相中加入0.5%甲酸,0.5%醋酸以及0.02%磷酸进