第二篇 血清总蛋白测定.docx

1、第二篇 血清总蛋白测定郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-01 版本/修订号：1/0主题内容血清总蛋白测定生效日期：2011-5-20第 1 页 共103页血清总蛋白测定(双缩脲法)1.实验原理：凡分子中含有两个甲酰氨基( -CONH2- )的化合物都能与碱性铜溶液作用，形成紫色复合物，这一反应称双缩脲反应 。蛋白质分子中有许多肽键( -CONH-），都能起此反应，而且各种血浆蛋白显色程度基本相同.紫色复合物在 540 nm 有吸收峰，并与蛋白含量成正比，通过与同样处理的标准蛋白比较可求出血清总蛋白含量。因此，在严格控制条件下，双缩脲反应可作为血浆蛋白总量测定的理想方法，

2、从测定的吸光度值计算出蛋白质含量。吸光度的大小与试剂的组分、pH值、反应温度有关。 蛋白质 + 铜离子 NaOH 紫红色络合物2.标本采集及存放：无特殊要求，最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。离心后采集血清或肝素抗凝的血浆。血清标本2025保存可稳定6天；48保存可稳定4周；-20保存至少可稳定1年。3.实验试剂及仪器：3.1 试剂：使用北京利德曼总蛋白试剂盒。试剂组成如下 成 份 含 量 酒石酸钾钠 32mmol/L 硫酸铜 12mmol/L 碘化钾 30mmol/L NaoH 600mmol/L 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2

3、.2 分析参数：主波长540nm分析方法终点法副波长700nm反应方向向上反应温度37S : R5：3004.质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。5. 计算方法：样本总蛋白含量C0 At-标本管的吸光度变化； As-标准管的吸光度变化； C0-标准液的浓度；6. 参考值范围：健康成人走动后血清总蛋白浓度为 6483 g/L ，健康成人静卧时，血清总蛋白浓度为 6078 g/L。7. 临床意义:血清总蛋白有生理性波动，直

4、立体位由于体液分布的原因，血液相对浓缩，而长久卧床者血液较直立体位相对稀释。因此长久卧床者血清 总蛋白比直立活动时约低35g/L；新生儿血清总蛋白可比成人低58g/L；60岁以上老人约比成人低2g/L。（1）总蛋白浓度增高：血清中水分减少，使总蛋白浓度相对增高。凡体内水分的排出大于水分的摄入时，均可引起血浆浓缩，尤其是急性失水时(如岖吐、腹泻、 高热等)变化更为显著，血清总蛋白浓度有时可达100 150g/L， 又如休克时，由于毛细血管通透性的变化，血浆也可发生浓缩。慢性肾上腺皮质功能减退患者，由于钠的丢失而致继发性水分丢失，血浆也可出现浓缩现象。 血清蛋白质合成增加。大多发生在多发性骨髓瘤患

5、者，此时主要是球蛋白的增加，其量可超过 50g/L，总蛋白则可超过100g/L。 （2）血清总蛋白浓度降低：血浆中水分增加，血浆被稀释。如因各种原因引起的水钠潴留。营养不良和消耗增加。长期食物中蛋白含量不足或慢性肠道疾病所引起的吸收不良.使体内缺乏合成蛋白质的原料，或因长期患消耗性疾病，如严重结核病、甲状腺功能亢进和恶性肿瘤等，均可造成血清总蛋白浓度降低。合成障碍，主要是肝功能障碍。肝脏功能严重损害时，蛋白质的合成减少，以白蛋白的下降最为显著。蛋白质丢失。严重烫伤时，大量血浆渗出，或大出血时，大量血液的丢失;肾病综合征时，尿液中长期丢失蛋白质;溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质.这些

6、均可使血清总蛋白浓度降低。8.附注：干扰因素：胆红素40mg/dl，血红蛋白200mg/dl, 抗坏血酸50mg/dl,乳糜1.6%时对检测结果没有影响。酚酞、溴磺酞钠在碱性溶液中呈色，影响双缩脲的测定结果，右旋糖酐可使测定管混浊亦影响结果，理论上这些干扰均可吸光度太高，可影响测定的准确性。方法局限性：本试剂线性上限为100g/L，如样品测定值超过上限时，应将样品用0.9氯化钠溶液作1:1稀释，重新测定，结果乘以2。危急值报告：无危急值。注意事项: 血清蛋白质的含量一般用 g/L 表示，因为各种蛋白质的分子量不同，不能用mmol/L表示。脂类高的血清,呈色后混浊不清,可用乙醚抽提后再比色。当采

7、用50g/L的浓度标准液时，吸光度的变化范围在0.100.35。9参考文献 ：9.1 叶应妩、王毓三、申子瑜等.全国临床检验操作规程【第三版】东南大学出版社，20069.2 梁淑新、施俊英. 临床检验操作技术系列丛书生物化学检验分册，军事医学出版社，2006郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-02 版本/修订号：1/0主题内容血清白蛋白测定生效日期：2011-5-20第 5页 共103页血清白蛋白测定(溴甲酚绿法)1.实验原理：白蛋白是血清中清蛋白，几乎都由肝细胞合成,它是血清中的主要蛋白质组分。白蛋白作为一个结合和转运分子在机体营养状况中起着重大作用。它的另一个作用是维

8、持渗透压，血浆胶体渗透压的75%是依靠白蛋白维持的。 血清白蛋白的测定常用于病人状态的非特异监视。在营养不良，特别是恶性营养不良的病人中可看到很低水平的血浆白蛋白。另外，血液稀释，或由于营养不良、肝脏疾病使合成白蛋白能力下降，或由于肾病综合征、蛋白丢失性肠道疾病等可引起大量白蛋白丢失的疾病均可导致低白蛋白。高白蛋白症则常见于脱水或血液浓缩。血清中的白蛋白与溴甲酚绿在pH=4.2的条件下结合生成绿色复合物，溶液由黄色变为绿色，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比，通过在 630 nm 处测定其吸光度，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。 白蛋白 + 溴甲酚绿 PH=4.2 绿色复合物2.

9、标本采集及存放 ：无特殊要求，最好用禁食的标本以减少乳糜血的干扰。离心后采集血清或血浆。血清4可贮6 天，在 2025 也可保存6天。3.试验试剂及仪器：3.1 试剂：使用北京利德曼白蛋白检测试剂盒。试剂组成如下 成 份 含 量 琥珀酸缓冲液 PH=4.2 溴甲酚绿 0.25mmol/L 表面活性剂及稳定剂 0.1% 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2分析参数：主波长6300nm分析方法终点法副波长700nm反应方向向上反应温度37S : R3：3004. 质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质

10、控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。 5计算方法： 样本白蛋白含量C0 At-标本管的吸光度变化； As-标准管的吸光度变化； C0-标准液的浓度；6. 参考值范围：414 岁儿童，血清白蛋白浓度为 3854g/L，健康成人血清白蛋白浓度为3448g/L。7. 临床意义:血清白蛋白在肝脏合成。血清白蛋白浓度增高常见于严重失水、血浆浓缩所致，并非蛋白质绝对量的增加。临床上尚未发现单纯白蛋白浓度增高的疾病，而以白蛋白浓度降低为多见.白蛋白浓度降低的原因与总蛋白浓度降低的原因相同乙但有时总蛋白的浓度

11、接近正常，而白蛋白的浓度降低，同时又伴有球蛋白浓度的增高。急性白蛋白浓度降低主要由于急性大量出血或严重烫伤时血浆大量丢失。慢性白蛋白浓度降低主要由于肝脏合成白蛋白功能障碍、腹水形成时白蛋白的丢失和肾病时尿液中的丢失，严重时白蛋白浓度可低于10g/L。白蛋白浓度低于25g/L 时，由于胶体渗透压的下降，常可见到水肿等现象。妊娠，尤其是妊娠晚期，由于体内对蛋白质的需要量增加，同时又伴有血浆容量增高，血清白蛋白可明显下降，但分娩后可迅速恢复正常。文献报道，还有极少数先天性白蛋白缺乏症病例，由于白蛋白合成障碍，血清中几乎没有白蛋白，但患者不出现浮肿。8.附注：干扰因素：胆红素40mg/dl，血红蛋白5

12、00mg/dl, 抗坏血酸50mg/dl,乳糜1.60%时对检测结果没有影响。方法局限性：本试剂线性上限为60g/L，如样品测定值超过上限时，应将样品用0.9氯化钠溶液作1:1稀释，重新测定，结果乘以2。危急值报告：无危急值。注意事项:该试剂除与白蛋白反应外，还可以与血清中许多蛋白如铜兰蛋白、C反应蛋白、-球蛋白、结合珠蛋白也可呈色，呈慢反应，实际上当血清与试剂混合之后就开始反应，持续一个小时之后反应完成，故在反应最初的30秒之内读取吸光度，可减少非特异性反应。当60g/L白蛋白标准与 BCG 结合后.溶液光径1.0cm ，在630nm 测定的吸光度应为0.8110.035. 如达不到此值，表

13、示灵敏度较低。此法测定正常血清标本的批间变异系数为6.3%左右。国内试剂大多为溴甲酚绿法，有些进口原装试剂则用的溴甲酚紫(BCP)方法，BCP法的优点是受球蛋白和其他血浆蛋白干 扰较小，但和 BCG 法相比，灵敏度较低。此外，溴甲酚紫与非人源性白蛋白结合力相当弱，不适用于测定动物标本中的白蛋白，而质控血清往往是动物血清，故其应用不如 BCG 法普遍。血清球蛋白含量及白球比值：在临床生化检验中，一般不需要单独测定球蛋白的含量，而是在测定总蛋白和白蛋白含量之后，用总蛋白减去白蛋白的含量即为球蛋白的含量。目前全自动生化分析仪能同时测定白蛋白和总蛋白的含量，并计算出白球比值，A/G比值的参考范围为1.

14、52.5.球蛋白浓度增高。临床上常以球蛋白增高为主.球蛋白增高的原因，除水分丢失的间接原因外，主要有下列因素:感染性疾病:如结核病、痢疾、黑热病、血吸虫病、麻风病等;自身免疫性疾病:如系统性红斑猥疮、硬皮病、风湿热、类风湿性关节炎、肝硬化等;多发性骨髓瘤:球蛋白可增至2050 g/L 。 球蛋白浓度降低主要是合成减少. 正常婴儿出生后至3岁内，由于肝脏租免疫系统尚未发育完全，球蛋白浓度较低，此属于生理性低球蛋白血症。肾上腺皮质激素和其他免疫抑制剂有抑制免疫机能的作用，会导致球蛋白的合成减少.低球蛋白血症或无球蛋白血症，患者血清中蛋白极度下降或缺如。先天性患者，仅见于男性婴儿，而后天获得性的.可

15、发生于男、女两性。此类患者缺乏体液免疫功能，很易发生难以控制的感染.9.参考文献 ：9.1 叶应妩、王毓三、申子瑜等.全国临床检验操作规程【第三版】东南大学出版社，20069.2 梁淑新、施俊英. 临床检验操作技术系列丛书生物化学检验分册，军事医学出版社，2006郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-03 版本/修订号：1/0主题内容血清总胆红素(TBIL)测定生效日期：2011-5-20第 9页 共103页血清总胆红素(TBIL)测定(钒酸盐氧化法)1.实验原理：总胆红素(是血红蛋白、肌红蛋白、过氧化物酶、细胞色素等含铁卟琳的化合物在体内代谢的产物。血清中有两类胆红素，即

16、未结合胆红素和合胆红素。未结合胆红素又称游离胆红素或间接胆红素。间接胆红素在生理 pH 条件下是难溶于水的脂溶性物质，可透过细胞膜，对细胞有毒害作用，不能通肾脏随尿排出体外。结合胆红素即胆红素葡萄糖醛酸酯，又称直接胆红素，直接胆红素是水溶性的，不易透过细胞膜，可通过肾脏随尿排出。总胆红素是直接胆红素与间接胆红素的和。釩酸盐氧化法原理如下： 总胆红素 釩酸盐 胆绿素 胆红素的减少引起在波长450nm处吸光度下降，吸光度的变化与总胆红素含量成正比。2.标本采集：采用空腹无溶血血清，要尽快分离测定。2 -8避光保存，血清中胆红素可稳定3天。冰冻保存3个月，胆红素水平未见明显变化。3.实验试剂及仪器：

17、3.1 试剂：使用北极利德曼检测试剂盒。试剂组成如下 成 份含 量 R1:柠檬酸缓冲液 100mmol/L 反应促进剂 1mmol/L 表面活性剂 2mmol/L R2:磷酸盐缓冲液 10mmol/L 偏钒酸钠 4mmol/L 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2 分析参数：主波长450nm分析方法终点法副波长546nm反应方向向下反应温度37S:R1:R214:280:704. 质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规

18、程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。 5. 计算方法：血清胆红素的含量(mol/L)C0 At-标本管的吸光度变化； As-标准管的吸光度变化； C0-标准液的浓度；6. 参考值范围：婴 儿： 出生24小时内150mol/L 出生第2天 22-193mol/L 出生第3天 12-217mol/L 出生第46天 1.7-216mol/L 儿 童： 一个月 3.4-17mol/L 成年人： 3.4-17.2mol/L7.临床意义判断有无黄疸、黄疸程度及演变变过程：当STB 17.1 mol/L但342mol/L时为重度黄疸。在病程中检测可以判断疗效和指导治疗。 根据黄疸程度推

19、断黄疸病因溶血性黄疸通常342mol/L 。 根据总胆红素、结合及非结合胆红素增高程度判断黄疸类型若STB增高伴非结合胆红素明显增高提示为溶血性黄疸，总胆红素增高伴结合胆红素明显升高为胆汁淤积性黄疸，三者均增高为肝细胞性黄疸。8.附注：干扰因素：血红蛋白100mg/dl, 抗坏血酸50mg/dl,乳糜1.60%时对检测结果没有影响。方法局限性：本试剂线性上限为680mol/L，如样品测定值超过上限时，应将样品用0.9氯化钠溶液作倍比稀释，重新测定，结果乘以稀释倍数。危急值报告：当新生儿血清标本测定结果总胆红素340mol/L时，在经过复查等确认手段处理后应及时向临床主管医生汇报。注意事项: 当

20、采用100mol/L的浓度标准液时，吸光度的变化范围在0.050.20试剂空白吸光度应0.10，否则应视为过期不能在使用。本法测定血清胆红素，在1037条件下不受温度的变化影响，呈色在2小时内非常的稳定。胆红素对光敏感，标准及标本均应尽量避光。钒酸盐法试剂稳定、保存期长，可室温保存，操作简单，特别适合全自动生化分析仪。1993年日本学者对该法，目前国内用户众多，文献均认为该法和传统方法（改良J-G法）有良好的相关性。线性和特异性达到较理想的水平。9.参考文献 ：9.1 叶应妩、王毓三、申子瑜等.全国临床检验操作规程【第三版】东南大学出版社，20069.2 梁淑新、施俊英. 临床检验操作技术系列

21、丛书生物化学检验分册，军事医学出版社，2006郧县中医院检验科 生化室作业指导书文件编号：检验科-SH-03 版本/修订号：1/0主题内容血清直接胆红素(TBIL)测定生效日期：2011-5-20第 13页 共103页血清直接胆红素（D-BIL）测定(钒酸盐法)1.实验原理：在正常生理状态下，间接胆红素以胆红素-血浆蛋白复合物的形式经血液运输，这一方面增大了胆红素的水溶性，有利于运输;同时又使血红素固定在大分子蛋白质上，可阻止血红素进入细胞内，避免了胆红素对细胞的毒害作用。但是如果血液中间接胆红素浓度过高，或血浆清蛋白浓度明显降低时，可导致间接胆红素游离增多，从而增加了间接胆红素透人细胞内的危

22、险.另外，某些 阴离子对清蛋白与胆红素的结合具有竞争作用。如游离脂肪酸、甲状腺素、磺胶类药物、水杨酸等在血浆中的推度升高时，都可使间接胆红素和血浆蛋白质的结合减少。间接血红素进入肝细胞后，与肝细胞内的载体蛋白 Y 或 z 结合形成血红素 -y 或胆红素 -z ，并以此形式运往滑面内质网，在葡萄糖醛酸基转移酶作用下，胆红素与二磷酸尿苷葡萄糖醛酸反应生成结合胆红素，即直接胆红素。直接胆红素再经肝内胆道系统和胆总管随胆汁一起排入肠道进一步代谢，最后以胆素形式，随尿及粪便排出体外。 在PH值为3.0左右、表面活性剂和间接胆红素抑制剂的条件下，样品中的直接胆红素被氧化剂釩酸盐氧化为胆绿素。胆红素的黄色特

23、异性吸光度下降，通过测定釩酸盐氧化前后吸光度的变化，计算出样品中直接胆红素的含量。 胆红素 钒酸盐 胆绿素2.标本采集及保存：采用空腹无溶血血清，要尽快分离测定。2 -8避光保存，血清中胆红素可稳定3天。冰冻保存3个月，胆红素水平未见明显变化。3.实验试剂：3.1 试剂：使用北极利德曼检测试剂盒。试剂组成如下 成 份含 量 R1:柠檬酸缓冲液 100mmol/L 反应促进剂 1mmol/L 表面活性剂 2mmol/L R2:磷酸盐缓冲液 10mmol/L 偏钒酸钠 4mmol/L 3.2仪器及参数：3.2.1使用凯美雅生化分析仪，具体的操作详见生化分析仪作业指导书.3.2.2 分析参数：主波长

24、450nm分析方法终点法副波长546nm反应方向向下反应温度37S:R1:R214:280:704. 质量控制：在测定每一批标本前先做正常值和异常值来两个水平的质控品，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控（质控规则见生化室室内质控操作规程）。在控后方可进行标本测定，若失控，查明原因并采取措施。 5. 计算方法：血清胆红素的含量(mol/L)C0 At-标本管的吸光度变化； As-标准管的吸光度变化； C0-标准液的浓度；6. 参考值范围：6.8mol/L7. 临床意义:根据直接胆红素与总胆红素比值，有助于鉴别黄疸类型，如DBIl/TBIL 50% 为梗阻性黄疸。直接胆红素测定可能有助于某些肝胆疾病的早期诊断。肝炎的黄疸前期、无黄疸型肝炎、失代偿期肝硬化、肝癌等，30% -50% 患者表现为直接胆红素增加，而总胆红素正常（见下表）正常人及常见黄疸的胆红素素代谢检查结果 血清胆红素尿内胆色素DBILTBILD/T尿胆红素尿胆原正常人06.83.417.10.20.4阴性0.844.2梗阻性黄疸明显增加轻度增加0.5强阳性减少或缺少溶血性黄疸轻度增加明显增加1.2U/ml R2:起动液 NADH 0.18mmol/L a-酮戊二酸 12mmol/L 3.2