1 DNA指纹图的建立及发展重点.docx

1、1 DNA指纹图的建立及发展重点1 DNA指纹图的建立及发展近百年来的研究认为, 任何遗传分析都是以遗传标志为基础的, 而任何一个遗传标志的价值 又在于其变异 性 (即多态性 的大小。有关遗传多态性的研究对促进人类学、遗传学、免疫 学以及法医学的发展, 以及对阐明某些疾病的发病机理乃至协助诊断等方面都起了十分重 要的作用。 但以往的研究都是利用各种外部表现型、生理缺陷型、 同工酶、多态蛋白等作为 遗传标志,用间接分析来推论相应的遗传基因。70年代末, 限制性内切酶和重组体 DNA 技术的出现以及分子生物学的飞速发展, 使人们对 遗传标志的研究转向 DNA 分子本身。由于各种遗传信息都蕴藏在 D

2、NA 分子上,生物个体 间的差异在本质上是 DNA 分子的差异,因此 DNA 被认为是最可靠的遗传标志。某些 DNA 序列的差异可通过限制性酶切片段长度的改变来反映,此即限制性片段长度多态性 (restriction fragment length polymorphisms,RFLP,其产生是由于点突变、 DNA 重排、插入 或缺失引起的 1。随着对 RFLP 研究的深入,人们发现了基因组中最有变异性的一类序 列 高变异 DNA 序列,使 DNA 遗传标志的发展和应用得到了一次飞跃。1980年, Wyman 和 White 描述了第一个多等位性的具有高度多态性的人类 DNA 标志。不 久,在

3、胰岛素基因 (Insulingene的 5 端区域、致癌基因 (C-Haras I Oncogene的 3 端分别发 现了相同的高度可变的标志 (hypervariable marker。在 -球蛋白 (-globin 基因群周围还发 现了其它三个标志 2。 1982年, Bell 等 3证实:这些高度多态性区域串联着重复的 短序列单位, 重复单位数目的差异导致了这种高度的可变性, 由于这些结构特征, 人们称这 些区域为小卫星 (minisatellite或高度可变区域 (hypervariable或可变数目的串联重复 (variable number of tandem repeats。19

4、85年, Jeffreys 等 4 用肌红蛋白基因第一内含子中的串联重复序列 (重复单位含 33bp 作探针,从人的基因文库中筛选出 8个含有串联重复序列 (小卫星 的重组克隆。序列分析表 明,这 8个小卫星重复单位的长度和序列不完全相同,但都有相同的核心序列 (core sequence 即 GGCCAGGA/GGG。他们先后用两个多核心小卫星 (poly coreminisate-llite33.6和 33.15探针进行 southern 杂交,在低严谨条件下杂交得到了包含 10多条带的 杂交图谱,不同个体杂交图谱上带的位置就象人的指纹一样千差万别, Jeffrey 称之为 DNA 指纹

5、(DNA fingerprint 5,又名遗传指纹 (genetic fingerprint。RFLP DNA指纹分析技术由于方法繁杂、周期长、实验条件高等缺陷而无法大范围推广。 1990年, Williams 等 6首次报道了 AP-PCR 技术, Welsh 和 McCelland 7亦独立地 进行了这方面的工作,从而使 DNA 指纹技术应用更加广泛。 AP-PCR 技术是采用随意设计 的 1个或 2个引物,对模板 DNA 进行 PCR 扩增,一般先是在低严格条件,即在高 Mg2+浓度 (大于传统 PCR Mg2+浓度 1.5mmol/L、较低退火温度 (3650 下进行 16个循 环的

6、PCR 扩增,随后在严格条件下进行 PCR 扩增,产物经 2%琼脂糖凝胶电泳或 6%变性 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,可得到 DNA 指纹图谱。其基本原理是:在低严格复性条件下, 引物与模板 DNA 非完全互补序列形成错配, 错配引物在 DNA 聚合酶作用下沿模板链延伸, 合成新链,当在一定距离内模板 DNA 另一单链也发生引物错配时,即可对两错配引物间的 DNA 进行扩增。但是此种错配并非随机发生,引物和模板间,特别是在引物 3 端必须存在 一定的互补序列, 即可产生不同的扩增片段或组合, 通过 DNA 指纹图谱, 可得到配对 DNA 样品中的差异片段,用于克隆、测序、染色体定位和基因片段的生物

7、学功能研究。我国杨建厂等 8 利用 PCR 的原理成功地建立了一种全新的 DNA 指纹检测技术,称之为随机引物 PCR 人 DNA 指纹检测技术 (arbitrarily primed PCR human DNA fingerprinting,APHDP ,此外还开发出处理 DNA 指纹数据应用软件,应用于个 人识别、遗传素质与疾病的相关特征研究等。2 DNA指纹技术所用的探针自 DNA 指纹技术建立以来,这一技术迅速在动植物的进化关系、亲缘关系分析以及法医学 方面得到广泛应用。也正是由于 DNA 指纹技术在核酸分析中显示出了强大的生命力,因而 许多学者围绕此技术所用的探针作了大量的工作,除

8、Jeffrey 等 5的探针外,用人工化 学合成或从生物组织中提取后再扩增的办法生产出了一批高水平的探针。迄今,在 DNA 指 纹技术中所用的探针大概有 probe33.15、 33.6 5 、 bacteriophage MB 9 、 pig repetitire clone p83、 PGB 725、 poly(GT containing 18.1、 (GTG5/(CAC5 10, 11 、 (CAC/TA4及 (GT12等。同时,在探针的标志上也有了很大的发展,根据它们的结构可大致分为小卫 星探针和简单重复序列探针,简单重复序列包括微卫星探针 (microsatellite probe和

9、寡聚核 苷酸探针。小卫星探针的核心序列为 33bp ,常定位在人常染色体前的末端 (proterminal区 域,微卫星探针则在 1020bp 之间,而寡聚核苷酸探针在 10bp 以下,普遍散布在人类整 条染色体上,或者在基因间区域或者位于内含子内。1988年,我国伍新尧等 12根据 DNA 指纹是人基因组中重复序列的 RFLP 的原 理和人与鼠的髓鞘碱性蛋白 (MBP基因 cDNA 同源序列性高于 90%的事实, 选用鼠 MBP cDNA3端的一段序列 (非表达区高度重序列, 与人基因组中该类重复序列几 乎完全同源 ,长度为 0.81kb 的片段作探针,检测用 Hae酶解的人 DNA 限制性

10、 片段 (RF,在人群中可分出 22条谱带,受检 的 30例无血缘关系的个体之间没 有两个人的谱带是完全相同的, 显示这一方法的高度个体特异性, 这是国内首次 用自已的力量找到 DNA 指纹的探针。3 DNA指纹的应用 3.1 法医学方面 同以往的血型测定法相比, DNA 指纹技术在法医学领 域上具有无可比拟的优越性。 已成为鉴定犯罪、 亲子鉴定和确定个体间亲缘关系的工具 5, 13。随后,国内学者李伯龄 14、姜先华 15、伍新尧等 12也先后对此项技术 进行了研究,并应用于实际案件的鉴定中,解决了过去无法解决的疑难案例,如微量血痕、 部分腐败的碎尸块的个人认定等。3.2 在动植物科学中的应

11、用3.2.1 生物种群学研究 利用 DNA 指纹图可以估算连锁不平衡, 比较等位基因的频率, 还能 估计不同个体之间的重组率,在种群学研究上有助于建立某一个体在种群中的地位和关系, 特别是对真菌的种群研究, 有很多真菌可以通过有性和无性的方式繁殖, 但是何时以何种方 式繁殖, 程度如何, 并不清楚, 而利用 DNA 指纹图就能区分以有性和无性方式产生的后代, 并能确定某一区域真菌的自然分布 1, 16。3.2.2 测定物种之间的遗传距离、物种分类鉴定 Jeffreys 等 5认为在一个群体的不同成 员间拷贝数的串联重复序列 (VNTR由于多态性程度高,在遗传分析中尤其适合作为多态性 标志, 简

12、单重复的不稳定性可导致 VNTR 长度的迅速变化, 根据家族中或育种群体中 VNTR 的分离重组频率,可以测定出遗传距离,可用统计学公式确定个体间的亲缘关系:D=2Nab/(Na+Nb, D 值越大, 亲缘关系越近, 遗传距离就越小; D 值越小, 亲缘关系越远, 遗传距离就越大。为此,运用 DNA 指纹技术可检测不同物种、同种及同种不同个体的亲缘关系, 用于物种分类鉴定,也可用于杂交后代亲本决定, 杂交后代群体分开,检测近等基因 系 (或同类系 种的多态性,并对检测基因进行定位。 Welsh 等 7对布氏疏螺旋体菌株的 DNA 指纹进行分析, 发现这种 lyme 病的病原菌实际上是由三个不同

13、的种群组成。 罗超权等 12 运用 AP-PCR 鉴定弓形虫虫株, 在国内开创了运用 DNA 指纹技术作生物分类的先例。 3.3 在流行病学方面的运用 由于 DNA 指纹具有以下几个特点:能反映基因组的变异性; 具有高度的变异性;具有简单的稳定的遗传性; DNA 指纹谱具有体细胞稳定性。所 以, 它同一般的流行病学方法相比较而言, 具有无比的优越性, 使其成为流行病调查的一种 有效工具。 Jan DA等 17, Denise Chevrel-Dellagi等 18运用 IS6110序列作探针对 结核病分支杆菌株进行 DNA 指纹分析,调查国际间结核病的种型、分析流行情况,改进了 控制结核病的方

14、法。 而 ZhenHua Yang等 19 从 67个病人中分离出结核病分支杆菌株进 行 DNA 指纹分析, 发现分离到 PTBN12型时易查明流行环节, 从而为快速进行疾病控制提 供了一个有力证据。在我国,童笑梅等 20采用随机扩增多态 DNA 指纹图技术对医院内 感染的 14例新生儿进行病原流行病学分析,发现患儿体内携带的与医务人员鼻中携带的华 纳葡萄球菌菌株的 DNA 指纹图完全一致,从而证明此次感染的病原菌为华纳葡萄球菌,传 染源是携带病菌的医务人员。 郭永建等 21 在 6个月内对 121名产科新生儿中的 30名检 出的 31株铜绿假单胞菌进行 RAPD 指纹图谱分析和血清学分型,

15、结果表明, 铜绿假单胞菌 在产科新生儿中暴发流行, 0 6/R 1型为暴发流行性菌株, 对医院感染病原菌分型、 精确 确定传染源、阻断传播途径、控制和预防医院感染具有重要的指导意义。3.4 疾病诊断及治疗 鉴于 DNA 指纹所具有的上述特点,故 DNA 指纹广泛应用于一些疾病 的诊断及治疗。 Morral 22等发现 CF 基因 9号外显子侧翼含有一小卫星区,且此等位基 因 2.6带常与 F508连锁,相伴率为 50.6%、 41.6%, F508是最主要的致病突变,可疑 患者电泳图只要发现 2.6等位基因,就可对此病进行初步诊断。现已在 Wilson 病、外周神 经纤维瘤、成人多束肾、多巴性

16、肌紧张、 Frecbreich 共济失调、 Kallmunm 综合征性连锁、 视网膜病等基因内或旁侧发现有高度的小卫星区域, 从而可进行基因诊断。 Okamoto R 23 用 DNA 指纹法预测慢性粒 cell 性白血病骨髓移植术后复发,取得了成功。3.5 肿瘤的研究 肿瘤是多因素、多阶段的变化过程,病因复杂、变化多样,但 归根到底还是在 DNA 的变化上。 一般说来, 癌组织、 转移灶与正常组织或外周血 细胞 DNA 指纹有差别, 常见的是某条带或几条带的缺失, 某一条或某几条带密度 降低,或者癌组织中出现新的带。 Thein 等 24用 33.6和 33.15为探针研究 患者 DNA 指

17、纹谱变化, 发现胃肠肿瘤患者癌组织 DNA 指纹谱全有改变, 并认为体 细胞突 变还有种属特异性。刘霜等 25应用 RAPD(随机扩增多态性 DNA 分析 技术对 6例肝癌患者的癌组织与非癌组织进行分析,发现所有肝癌组织基因组 DNA 的 RAPD 指纹图谱均存在差异,其中 3例配对肝癌基因组中均存在一相同的 0.9Kb 的随机扩增片段。杨建厂等 8用 APHDFF 技术对 28例确诊为鼻咽癌病 人血 DNA 指纹图的检测, 发现有 3条 DNA 片段出现的频率明显低于健康人群。 王 黛等 26用 LE11.8、 MYO 和 Mb 探针,经 Southern 杂交法检测 12例儿童急性 粒 c

18、ell 白血病患者的外周血或骨髓细胞的基因重排,结果发现初始或复发与完 全缓解时的 DNA 指纹图相比, 谱带有增加或减少, 从而认为急性粒细胞白血病患 儿的白血病细胞存在基因重排。什么是 DNA 指纹人体包含有 100万亿个细胞, 它们组成各种器官和组织。 染色体是遗传物质, 存在于细胞核 内。每个人体细胞内含有 23对染色体,它们大小各异。遗传信息贮存于染色体内的 DNA 分子中,也就是说,基因的化学本质是有遗传效应的 DNA 片段。每个 DNA 分子含有很多 个基因, 基因的复制就是通过 DNA 的复制来完成的。 DNA 通常以双螺旋型的双链存在, 它的基本组成单元是四个碱基,即腺嘌呤

19、(A、鸟嘌呤 (G、胞嘧啶 (C和胸腺嘧啶 (T。 DNA 双链通过氢键按 A T 、 G C 的互补配对方式绞结在一起。 上述四种碱基在 DNA 长链中的 不同排列组合, 构成了一系列密码, 在受精卵到个体形成的整个过程中起到调控作用, 从而 使得人类个体之间的特征千变万化,互相区别。人类基因组 DNA 中贮存着可供正常生存和遗传的信息,这些信息以基因、密码的形成排列 组合在 DNA 分子之中,其中能够制造蛋白质的基因约有 8万个。 DNA 由以碱基、核糖和 磷酸构成的核苷酸长链组成,核苷酸排列方式叫序列,即一级结构。 DNA 序列中存在三种 类型:单拷贝序列、中等程度重复序列和高度重复序列

20、。重复序列就是一种序列在 DNA 分 子中重复出现几百次、几千次、几万次甚至百万次,它们约占 DNA 总序列的 34%。每个 重复序列在 300个核苷酸长度之内,由于高度重复序列经超离心后,以卫星带出现在主要 DNA 带的邻近处, 所以也被称为 “ 卫星 DNA” 。 卫星 DNA 中的重复序列单元则称为 “ 小卫星 DNA” 。“ 小卫星 DNA” 具有高度的可变性,不同个体彼此不同。但 “ 小卫星 DNA” 中有一小段序列则 在所有个体中都一样,称为 “ 核心序列 ” 。 如果把核心序列串联起来作为分子探针, 与不同个 体的 DNA 进行分子杂交,就会呈现出各自特有的杂交图谱,它们与人的指

21、纹一样,具有专 一性和特征性,因人而异,因此被称作 “DNA 指纹 ”(DNA fingerprint 。二、 DNA 指纹的特点概括起来说, DNA 指纹具有以下三大特点:1、多位点性 高分辨率的 DNA 指纹图通常由 1530 条带组成,看上去就像挂号信上的条 码签一样。 DNA 指纹区中的绝大多数区带是独立遗传的。因此,一个 DNA 指纹探针能同 时检测基因组中数十个位点的变异性。2、简单的遗传方式 DNA 指纹图中的区带是可以遗传的,这不同于人的指纹。 DNA 指纹区 带遵循简单的孟德尔遗传方式。后代图中的每一条带都可以在双亲之一的图中找到,只有 0.004的可能性,使子女中的一条带不

22、能在其父母中的图中找到 (基因自发突变的结果 。同 一个体无病变的不同组织产生的 DNA 指纹图完全相同,并能在培养的细胞株中维持下去。 需要说明的是,同卵双胞胎的 DNA 指纹图完全相同。3、高度变异性 不同的个体或群体有不同的 DNA 指纹图。一般选用任何一种识别四个碱基 的内切酶, 这种变异性就能表现出来。 英国遗传学家杰弗里斯对白种人研究表明, 两个随机个体具有完全相同的 DNA 指纹图的概率, 为三千亿分之一 (即 310-11 。 两个同胞个体具有 相同图谱的概率也仅仅为二百万分之一 (即 210-6 。三、 DNA 指纹术的工作原理一般要通过以下几点来完成:1、 将送检的各种生物

23、学检样, 如毛发、 血痕、 精斑、 人体组织或白骨等, 把其中所含的 DNA 提取出来。2、选用与探针配对的限制性核酸内切酶,在长链 DNA 位置上加以切割,使分子量很大的 DNA 长链切短成许多长度不同的小片段。3、在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中,对酶解完全后的 DNA 片段进行电泳,各酶切片段就 会按其长度大小在电场中进行分离。4、先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链 DNA 片段变性为单链片段,然后将凝胶板夹在 尼龙膜中,使这些单链 DNA 片段印溃 (blot-ting,转移并永久性地固定在尼龙膜上。5、让放射性 DNA 探针与尼龙膜上的单链 DNA 片段进行分子杂交。6、 用放射性胶片与

24、尼龙薄膜叠放, 尼龙膜上的放射性探针便会发出 X 射线使胶片曝光, 从 而使杂交有探针的长度不同的 DNA 片段位置显影在胶片上。这样的特征 DNA 片段条状图 谱,便是所谓的 DNA 指纹。四、 DNA 指纹术的应用由于 DNA 指纹提供了丰富的个体特异性遗传标记, 因而在法医学鉴定中具有重要意义。 其 主要应用有以下几个方面:1、在刑事案件中的应用 在法医学上,如果确定某人是嫌疑犯,则可提取其血样或毛发的 DNA ,做出 DNA 指纹,然后由犯罪现场残留的血、精液、唾液、痰液、毛发、骨骼或其他 肉体成分提取的 DNA 指纹相对照。若两者一样,则称其指纹相配,证明该嫌疑犯就是作案 的罪犯,反

25、之则否。通常进行上述指纹相配的签定叫 “ 配型 ” 工作。在 DNA 指纹术见诸报道的第二年,即 1986年的秋天,英国累斯特远郊的警察拘捕了一名 涉嫌先后奸杀两名少女的嫌疑犯。 警方向杰弗里斯教授提供了从两名受害人身上采集到的精 斑和阴道拭子。 经过 DNA 指纹术分析后, 杰弗里斯提出的鉴定报告是两名受害人处的精斑 均来自同一人,但决非是已被拘捕的青年的。此后,警方用去了 50万英磅的办案经费,借 助 DNA 指纹术将真正的罪犯抓捕归案。2、在亲子鉴定中的应用 自从杰弗里斯等人于 1985年首次对一起移民纠纷中的母子关系作 出肯定鉴定以来,用 DNA 指纹术进行亲子鉴定已有近 10年的历史

26、了。代表性的报道有:在一起无名尸的鉴定过程中,专家们将提取到的腐尸残血中的 DNA ,和假定受害人双亲的DNA 进行 DNA 指纹鉴定后，成功地对这具无名尸的人身作出了鉴定。在常规血清学检验 不能对亲子关系作出肯定结论的情况下，采用 DNA 指纹术便可轻易地作出结论。 3、 空难事故受难者残骸鉴定 通常在空难受害者残骸的鉴定过程中， 单纯依靠法医学和常规 法血清学检验，是很难对所有遇难人员的残骸加以区分的。因此，在常规手段行不通时，再 采用 DNA 指纹术实为一种最佳选择。 4、人种、性别鉴定 英国内政部中央研究局研究表明，DNA 指纹术可在相当大程度上用于 人种鉴定，并测出白种人和非洲黑人的

27、 DNA 多态片段及它在特定范围内的出现频率，具有 种属代表性。有人对长达 20 年的陈旧血迹中的降解 DNA 进行了性别鉴定，并在人、兽的 区分鉴定中取得成功。 5、其它方面的应用 鉴别双胞胎是异卵双生还是同卵双生，只需比较一下两者的 DNA 指纹 图即可。 DNA 指纹术也可用于器官移植的配型试验，以便筛选出最佳供体。 肿瘤细胞 DNA 指纹，因其染色体丢失或异常的扩增而与正常体细胞不同。因此，肿瘤 DNA 指纹的改变可用作肿瘤发生和发展的标志。 在盗杀和偷捕野生动物的案件中，用不同的 DNA 指纹术，对遗弃在野外的残余动物组织、 市场上出售的动物组织， 以及盗猎者冰箱中的动物组织进行分析

28、， 可对被盗杀的动物进行鉴 定。 DNA 指纹术的应用领域很广泛，尤其在司法鉴定中有着独特而权威的应用。 五、DNA 指纹术论战风暴 自从 1985 年英国遗传学家杰费里斯发现 DNA 指纹以来， DNA 指纹术已被广泛应用于解决 那些根据表型遗传标记无法解决的医学、人类学、社会学和法律学问题。最令人刮目相看的 是它风靡法医学界，并正开始改变法医学的面貌。 由于 DNA 指纹术直接用于法医学，涉及对罪犯的判别和刑罚这样性命悠关的大事，所以法 院法官对此不敢贸然采用赞同或否定的态度。他们对 DNA 指纹术的可靠程度不够了解，有 较多顾虑。 其实，这是科学界对该技术争议不决的一种反映。在欧美科学界

29、(主要在生物医学界，争论 双方都有有影响的科学家参加。支持者认为，DNA 指纹完全可以推广应用于法医学而不会 发生任何偏差，力主大胆应用。怀疑者提出一些目前尚难准确回答的疑问。归纳起来有以下 几个问题分歧较大： 1、关于 DNA 指纹配型的机率。 2、从事 DNA 指纹鉴定的实验质量控制。 过去各家对相配机率(即多少人中可以出现一对相配 DNA 指纹的估计，缺乏统一标准和足 够准确的数据，所以估计数字相差甚殊，由五百万分之一到 1014 分之一不等。有一段时间 不少人估计，大约 50 亿人口中有两个人的 DNA 指纹完全相同，故认为在当今世界总人口 50 亿的情况下，应用 DNA 指纹鉴定罪犯

30、是可靠的。一些权威的群体遗传学家认为，DNA 指纹术研究者计算出来的频率离实际值太远， 没有考虑人口亚结构的存在。 人口亚结构即人 的亚种，不同种或同亚种的人群之间发生相同 DNA 指纹的频率可能不一样。同时由于人口 亚结构的存在，也可能增加了人群中相同 DNA 指纹的频率。至于它们的频率究竟有多大， 目前仍不得而知。此外，DNA 指纹还涉及社会和伦理问题。 由于对 DNA 指纹术存在严重分歧，美国国家科学院于 1989 年为此成立了一个专门委员会， 负责审查有关 DNA 指纹术在法医学中的应用，及由此而产生的社会伦理问题。该委员会内 部也发生争论，并形成两个极端。以著名群体遗传学家兰德为首的

31、一派被称作保守派，对 DNA 指纹术在法医学中的应用持谨慎态度。另一派以分子遗传学家卡斯科为首，被称作实 用派。委员会成立初期，保守派占优势，掌握了起草关于 DNA 指纹术应用的(英国科学 院报告 。可以想象，报告草案一定是相当保守的。实用派大为不满，把这份属于保密资料 的内容透露给联邦调查局犯罪实验室的官员和美国科学杂志。在联邦调查局的干预下， 此报告多次进行修改。当报告比原计划推迟 7 个月，于 1992 年 4 月份产生后， 科学杂志 几乎在同时就向公众透露了这份报告的主要内容和某些细节。 科学 杂志说， 由于围绕 DNA 指纹术争议太大， 科学院报告最终必定是一份折衷的报告。初步意见有

32、以下几点： 1、支持 DNA 指纹术用于法医学。 2、接受人口亚结构的观点。 3、肯定了基因数据的隐私性。 4、赞成对 DNA 指纹配型实验室进行强制鉴定。 5、关于分歧最大的、在人群中发生 DNA 指纹相配的频率，最终达成争论双方都接受的数 据几十万至几百万分之一。 由于科学院报告的产生，在欧美围绕 DNA 指纹的论战风暴趋于缓和。但对这份报告的 大多数批评者认为，DNA 指纹相配频率过于保守。换句话说，它对辩护律师有利。在法庭 上，有些辩护律师借口科技界对 DNA 指纹术存在争议。而为被告开脱罪证。 为了确保 DNA 指纹术的科学有效性，科学界采取了许多新措施。人们相信，DNA 指纹术 将在法医学中大放异彩。