毕业设计 大豆F2 5群体主茎节数的QTL定位.docx

1、毕业设计 大豆F2 5群体主茎节数的QTL定位青 岛 科 技 大 学毕 业 综 合 训 练 报 告（论 文）大豆F2:5群体主茎节数的QTL定位题 目 _指导教师_辅导教师_学生姓名_学生学号_1_院（部）_ 专业 _班_年 _月 _日摘 要大豆主茎节数是影响大豆产量的一个重要因素，也是一重要的农艺性状。试验利用来自溧水中子黄豆南农493-1 的 F2:5家系，对大豆的数量性状进行基因定位具有重要价值。本实验通过对构建的溧水中子黄豆（P1南农493-1（P2）杂交组合的244株正交F2群体，采用复合区间作图法（Composite interval mapping CIM），从而得到大豆豆荚数的

2、一个QTL定位。而QTL定位就是以分子标记技术为工具、以遗传连锁图谱为基础、利用分子标记与QTL之间的连锁关系确定控制数量性状的基因在基因组中的位置。进而为分子标记辅助育种提供了基础和依据。关键词：大豆；QTL；主茎节数 目 录引 言 11实验材料及方法 31.1 实验材料 31.1.1 品种简介 31.2 实验方法 31.2.1试剂配制 41.2.2 DNA提取方法 41.2.3 SSR分子标记 41.2.4 PCR的扩增及检测 51.2.5 电泳凝胶制备 51.2.6 PCR扩增产物的电泳检测 51.2.7 硝酸银渗透及显色 61.2.8 数据记录与统计分析 61.2.9 重要性状的调查

3、71.2.10 连锁群构建 72结果分析 82.1：大豆主茎节数试验数据 82.2大豆主茎节数QTL定位 13小结 15参 考 文 献 16致 谢 17大豆F2:5群体主茎节数的QTL定位Mapping QTL of nodes in main stem in soybean (Glycine max L. Merrill)姓 名 专 业 指导教师 引 言大豆Glycine max(L.) Merr.，原产于中国，为豆科大豆属一年生草本植物。大豆作为重要的粮食作物,为人类提供主要的植物蛋白和油分。大豆蛋白质在豆科作物中的蛋白质含量最高,并含有较多的必需氨基酸,尤其是赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸的含量

4、分别是玉米的9.25 和6倍（庄炳昌，2002） 。人们对食品级大豆的需求在国内外市场上逐渐上升（M. S. S. Rao ,B. G. Mullinix , M. Rangappa et al. 2002 , 94） 。同时也是饲料蛋白的重要来源（CLARKE E J，WISEMAN J，2000；FRIEDMAN M，BRANDON D L.，2001）。因此,大豆品质性状的遗传改良,已被国内外大豆育种工作者列入主要的研究目标。影响大豆产量的农艺性状有很多，而主茎节数是其中之一（主茎节数是指从子叶算起至主茎顶端的实际节数），本实验主要是通过QTL定位，研究并寻找影响主茎节数的主因素，从而为

5、提高产量奠定基础。QTL(Quantitative Trait Loci) 即数量性状基因座位,是控制数量性状的基因在基因组中的位置。QTL定位(QTL Mapping) 是检测分子标记和QTL间的连锁关系,估计QTL 的效应利用分子标记进行遗传连锁分析,检测出QTL 。因为对育种直接有益,农艺性状如大豆产量的QTL 研究的较多（Mansur L M, Orf J H , Chase K, Jarvik T , Cregan P B , Lark K G，1327-1336；Orf J H , Chase K, Jarvik T , Mansur L M, Cregan P B , Adler

6、 F R ,Lark K G，1642-1651等）。自1900年keim开始对大豆农艺性状进行QTL分析以来，已经在大豆连锁图谱定位大量关于大豆产量性状的QTL，而主茎节数就是其中一个重要的农艺性状；随后许多学者利用已构建的大豆遗传图谱对大豆重要农艺性状进行了QTL定位分析（Lark，1993；Mansur，1993；Mian，1996；Lee，1996；Mian，1998；Brummer，1997； Hyten，2004）。到目前为止，已有1174个大豆QTL定位结果储存于大豆数据库网站Soybase，其中包括与产量性状有关的单株荚数、每荚粒数、百粒重、豆芽产量等；与品质性状有关的蛋白质含

7、量、脂肪含量、亚麻酸含量、油酸含量、亚油酸含量等；与抗病虫性有关的如抗孢囊线虫病、大豆瘁死综合症、大豆根结线虫病、菌核病、芽枯病、茎褐腐病、花生根结线虫病、疫霉根腐病及玉米螟等；与抗逆性有关的如耐铝胁迫、耐旱性、耐渍性、倒伏性等；以及生育期、株高、开花期、光周期敏感性、铁素营养、叶面积、豆荚开裂等56个农艺性状。定位所用标记以SSR、RFLP居多。本研究利用来自溧水中子黄豆南农493-1 的 282 个F2:5家系，在已完成150对SSR分子标记基础上，首先利用F2群体构建分子标记的大豆遗传图谱；然后，利用该连锁图，用Windows QTL Cartographer V2.5软件包中的复合区间

8、作图法（Composite interval mapping CIM）和多区间作图法（Multiple interval mapping MIM）方法， 定位了大豆主茎节数有关性状的QTL定位，并分析其与大豆遗传的关系。通过QTL定位让我们更好的了解大豆的生长和遗传特性，认识品种间的亲缘关系，在大豆引种和遗传改良种起到很关键的作用。从而也为提高大豆产量奠定了良好的基础。1实验材料及方法1.1 实验材料1.1.1 品种简介溧水中子黄豆：江苏省地方品种，对大豆花叶病毒(SMV)具有抗扩展特性。特征：具有一定的野生性状，株高较高，一般70 cm左右，主茎有蔓生现象，主茎17.90节，分枝9.13个，

9、结荚高度23cm左右。黄种皮，有色泽，不爆裂，黄子叶，子粒椭圆型。子粒较小，百粒重12-13g。特性：属南方夏大豆晚熟品种类型。全生育期130天。6月中旬播种，每亩密度1.5-2.0万株，8月中旬开花，10月中旬成熟，对大豆花叶病毒具有抗扩展特性。对豆卷叶螟有较强抗性。蛋白质含量44.25%，脂肪含量18.42%。适应性广，配合力好。南农493-1：原南京农学院于1956年利用前中央农业实验所的51-83大豆材料经选择单株系统选育而成。1959年参加江苏省区域试验，区试后，1962年确定为江苏省淮南地区大豆推广品种。高感大豆花叶病毒(SMV)。豆荚螟较重，蛋白质含量46.54%，油份含量16.

10、36%，一般亩产100-150公斤，高产田块超过200公斤，适于长江中下游地区作夏大豆种植，推广450万亩。到目前为止，以其为亲本至少育成22个以上大豆新品种。1997年，“大豆优良亲本南农493-1的育种利用价值”获得农业部科技进步三等奖。特征：有限结荚习性，株高中等，一般50cm左右，株型紧凑，收敛，主茎14.35节，分枝4.46个，结荚高度18cm左右。黄种皮，有色泽，不爆裂，黄子叶，子粒椭圆型。种脐淡褐色，子粒较大，百粒重18-20g。荚型呈弯镰形，荚灰黄色，二粒型，不裂荚。白花，灰毛，叶型中等大小，椭圆形，叶色浓绿，成熟时落叶。特性：属南方夏大豆晚熟品种类型。全生育期136天。6月上

11、旬播种，8月中旬开花，10月中旬成熟，每亩密度1.5-2.0万株，耐肥抗倒，不耐旱，但耐阴性强。适应性广，配合力好。1.2 实验方法田间种植：一个品种种植三行分别插标签。田间大豆间苗：约15cm株距。取叶片：取倒三叶的中间叶，每个品种取叶片5片装自封袋包好带回实验室。植株成熟时，每个家系取中间行从第二株开始的连续5株，测量植株主茎节数，取平均值。DNA的提取采用CTAB法，PCR仪扩增,电泳试验，读胶。1.2.1试剂配制1. CTAB提取缓冲液配方(10ml)CTAB0.2gEDTA(0.5M PH8.0)1mlNacl0.82gH2O7.44ml巯基乙醇560lPVP0.05gTris一Hc

12、l(1M, PH8.0)1ml2. 0.5M EDTA (PH8.0)的配制(100 ml)EDTA18.61gNaOH2g加纯水搅拌溶解，定容至100ml ，PH调至8.0。灭菌，室温放置备用。1.2.2 DNA提取方法恒温水箱使用上海康华生化仪器制造厂HS-3001型。低温离心机使用sigma 型号:1-15K。1、取新鲜叶片在液氮中磨成粉末状，用1.5ml离心管取0.2g研磨好的叶片组织，加入65预热过的CTAB提取液650l。2、65水浴50min，每隔十分钟摇动均匀。3、加入等体积的酚/氯仿(24:1)充分混匀，静置10min，5000rpm离心20min。4、取上清液至另一离心管，

13、加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀，静置10min，5000rpm离心10min。5、取上清液至另一离心管中，加入2倍体积的冷无水乙醇，混匀，4静置1 小时，5000rpm离心10min。6、倒掉上清液，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，在灭菌台吹干，向离心管中加入200-300l无菌水溶解DNA，溶解后将离心管放入4冰箱保存备用。7、用酶标仪检测DNA的浓度，稀释到工作液浓度20ng/l，用于PCR扩增。1.2.3 SSR分子标记本实验所选择的SSR引物参照Cregan(2003)的“大豆公共图谱”。SSR引物的序列在大豆数据库Soybase (http:/www.ncbi.nlm.ni

14、h.gov)中获得，由上海生物工程公司合成150对引物。1.2.4 PCR的扩增及检测PCR仪使用德国EppendorfPCR反应总体积为15l，PCR反应体系含10 PCR Buffer(含15mM Mg2+)1.5l，dNTP(10mM) 0.2l，Tag酶(5/l)0.15l，引物3l，ddH2O 5.15l，模板DNA (20ng/l) 5l。PCR反应程序为95预变性2 min；94变性30 sec，47-55退火45 sec，72延伸1 min，运行35个循环；最后72延伸10 min，4保存。用8%非变性聚丙烯酰胺胶对扩增产物进行分离，银染检测。 1.2.5 电泳凝胶制备1、玻璃

15、板清洗干净，彻底干燥后进行板的组装，并用1%的琼脂糖封胶。2、电泳凝胶的配置：(30%丙烯酞胺溶液)所需试剂： 丙烯酰胺 29gN,N,-亚甲基双丙烯酰胺 1g溶于纯水中，加热至37溶解，最终定容至100 ml。置于棕色瓶中，4保存。使用时稀释至8%。3、5TBE配制Tris54g硼酸27.5g0.5M/lEDTA(PH8.0)20 ml加纯水定容至1000ml。4、灌胶：把40ml 8%丙烯酰胺胶(一个电泳槽的用量)倒入三角烧瓶中，加入450l 10%的AP(过硫酸铵)、25l TEMED，混匀，排出气泡后，静置30秒，缓慢倒入玻璃板间，待胶流动到底部边缘，插入梳子，梳齿朝外，静置聚合30分

16、钟。1.2.6 PCR扩增产物的电泳检测电泳仪：使用北京六一仪器厂的DYY-6C型。电泳槽:使用北京六一仪器厂的DYCZ-30型。1、电极缓冲液：为1TBE；2、预电泳：拔出梳子，立即用蒸馏水冲洗点样口，刮去附着在点样口上多余的胶，预电泳20分钟；3、上样：预电泳后，使用微量进样器点入DNA扩增产物3l，其中加入6Loading buffer(15%聚蔗糖(Ficoll400型)，0.03%溴酚蓝，0.03%二甲苯氰，0.4%Orange G，10mM Tris-HCI(PH=7.5)，50mM EDTA)2l，200V恒压电泳，时间可视SSR扩增产物的分子量大小而略加调整。1.2.7 硝酸银

17、渗透及显色步骤如下：1、 固定：电泳结束后，将凝胶放入固定液中，轻摇20-30分钟，至指示剂无色；固定液的配制：200ml10%冰醋酸10ml乙醇20ml纯水170ml2、 渗透：放入渗透液中，轻摇12分钟；渗透液的配制：400mlAgNO30.8g纯水400ml3、使用纯水清洗两次，每次30秒。4、显色：放入显色液至DNA条带显出。显色液的配制：500mlNaOH8g甲醛5.4ml纯水500ml5、使用纯水清洗三次，用保鲜膜包好，使用Quantity one读胶仪扫胶。1.2.8 数据记录与统计分析对于共显性的SSR标记，根据其特点及扩增的电泳结果，将与亲本溧水种子黄豆带型相同的记为1，与亲

18、本南农493-1的带型相同的记为2，杂合的带型记为0，缺失和不清晰的带型记为“-”。1.2.9 重要性状的调查本杂交组合于2005年在南京农业大学江浦实验基地配制而成，同时配制正反交组合，并在海南进行南繁获得F2种子。F2种子于2006年6月在南京农业大学江浦实验基地种植获得F2植株群体，小区行长3 m，株距10 cm，共得到正交F2单株244株，反交F2单株300株。采用系谱法繁殖后代，F2群体单株收获种子，衍生F2:3家系，于2007年6月在南京农业大学江浦实验基地种植，随机区组设计，每个家系分三行种植，小区行长1.5米，株距10cm，成熟时中间一行单独收获考种，旁边两行作为保护行收在一起

19、。2009年在山东临沂采用同样的方法进行了F2:5的种植。重要性状的调查标准参照中国大豆品种志中的大豆性状分级标准，并参考了相关研究文献，对F2:5家系进行田间调查和室内考种。1.2.10 连锁群构建利用Joinmap 3.0作图软件，采用Group命令，以LOD值大于2.0进行人工分组，每一个Group可以采用不同的LOD值标准，然后选择Calculate map命令，应用Kosambi作图函数进行重组率与遗传距离(Morgan)间转换，构建分子标记连锁图谱。2结果分析2.1：大豆主茎节数试验数据表1 家系主茎节数家系主茎节数平均数ZF001241923222522.6ZF002212123

20、192020.8ZF003211819222420.8ZF004211724232121.2ZF006202423242322.8ZF007232221212021.4ZF008211623222020.4ZF009211922252522.4ZF010212421252022.2ZF011232020222121.2ZF012202019211619.2ZF013181817201818.2ZF014182118211819.2ZF015182019202019.4ZF016241923242122.2ZF017202221212020.8ZF018201922222020.6ZF01922

21、2523222423.2ZF020232324242323.4ZF021222425252424ZF022231818202220.2ZF023182118222019.8ZF024222221242021.8ZF025212121191920.2ZF026202121202020.4ZF027172117152218.4ZF028212222202221.4ZF029242224211922ZF030202116192720.6ZF031182221252321.8ZF032201919192119.6ZF033232519222122ZF034222524212122.6ZF0351822

22、16211919.2ZF038221922221720.4ZF039191920202620.8ZF040171624192119.4ZF041162122162219.4ZF042242220221921.4ZF043191822201919.6ZF044252523222423.8ZF045262525242424.8ZF046232320192221.4ZF047252424262524.8ZF048242526242324.4ZF049192020211919.8ZF050231923202121.2ZF051212123192321.4ZF052232320232522.8ZF053

23、232226232323.4ZF054212323212322.2ZF055201917232520.8ZF056202119242121ZF057231926222623.2ZF058221919192220.2ZF059212322202321.8ZF061222518252422.8ZF062232025232022.2ZF063202122202020.6ZF064252428202023.4ZF065211920192120ZF066242322222423ZF067192221162220ZF068221819241920.4ZF069272224242324ZF070202425

24、222122.4ZF071202222232221.8ZF072182321222121ZF073261719282022ZF074261922192722.6ZF075222523222222.8ZF076212722252323.6ZF077242321221821.6ZF081231923212422ZF082221920222120.8ZF083222420221921.4ZF084222324232423.2ZF085232223191821ZF086222220182220.8ZF087232221221520.6ZF088232422212523ZF089262426232725

25、.2ZF100202023211920.6ZF101202022232321.6ZF102181914192018ZF103222826222624.8ZF104241923222121.8ZF105232222181820.6ZF106232020202120.8ZF107242523232223.4ZF108202222202221.2ZF109132622232421.6ZF110212121222121.2ZF111201920232120.6ZF112232121232222ZF113202325212322.4ZF114202121211820.2ZF115212129222323.2ZF116252020212622.4ZF117251921162320.8ZF118212120212120.8ZF119212424242223ZF120261824222122.2ZF121232324212723.6ZF122192424252423.2ZF123231925212322.2ZF124222021162320.4ZF125222122222221.8ZF12723191924