生物制药组实训实习报告及心得体会.docx

1、生物制药组实训实习报告及心得体会实训主要内容：活菌数的检测、酶活检测、菌液浊度的检测、酶蛋白的提取组3组员12表1根据实训时间，列出下列表格，以便后续的实验培养时间（h）接种时间取样时间36.24 8:309:006.24 12:0066.24 8:309:006.24 15:007.56.24 8:309:006.24 16:30126.24下午16:30 （20:00）（4）（30）6.25 8:00166.24下午 16:3017:006.25 8:00186.24下午 16:3017:006.25 11:00216.24下午 16:3017:006.25 14:00246.25 9:0

2、06.26 9:00276.25 9:006.26 12:00306.25 9:006.26 15:00表格1注：红色标记为未检测项目。试剂的配制、培养基的配制试剂的配制所配的试剂名称所需试剂的质量或体积0.2M醋酸钠母液200ml3.28g0.2M醋酸母液200ml2.299ml2mol/L氢氧化钠溶液500ml40g1%磷酸二氢钾母液250ml2.5g1%七水硫酸亚铁母液250ml2.5g1%硫酸铵母液250ml2.5g0.5%氯化钙母液250ml1.25g0.5%七水硫酸镁母液250ml1.25g表格2由于这些母液上个班配的还没用完，所以也就没再配。培养基的配制组3发酵培养基的配制（V总

3、）150ml试剂所需（ml）/（g）所得终浓度1%磷酸二氢钾15ml0.1%磷酸二氢钾1%七水硫酸亚铁1.5ml0.01%七水硫酸亚铁0.5%氯化钙7.5ml0.025%氯化钙0.5%七水硫酸镁15ml0.05%七水硫酸镁1%硫酸铵15ml0.1%硫酸铵可溶性淀粉2.26g1.5%蛋白胨1.52g1%氯化钠0.79g0.5%牛肉膏0.73g0.5%最终培养基pH值为5.0表格3营养琼脂培养基的配制试剂所需质量营养琼脂培养基16g称取营养琼脂培养基16.08g，加水定容至500ml，煮沸溶解表格4醋酸钠-醋酸缓冲液pHpH0.2M醋酸钠0.2M醋酸4.01.8ml8.2ml5.07.0ml3.0

4、ml6.09.4ml0.6ml表格5 1%可溶性淀粉溶液称取1.24g可溶性淀粉，用约15ml冷的蒸馏水充分溶解混匀，取约70ml沸腾的蒸馏水，将已经混匀的淀粉悬浮液倒入沸水中，边倒边用玻璃棒搅拌，使淀粉溶解。冷却后，用冷的蒸馏水定容到100ml，备用。实验前的准备灭菌将配好的发酵培养基分装于15个规格为100ml锥形瓶，9ml/瓶250ml锥形瓶+150ml蒸馏水5瓶将配好的营养琼脂培养基分装于规格为250ml锥形瓶，2瓶置于高压蒸汽灭菌锅121，20min灭菌图三1图三2 23号菌种的培养取23号菌种在超净工作台内进行接种，100ul/瓶，共3瓶，供后续实验菌种的来源。置于摇床中培养30，

5、100rmp/min。图三3图三4固体平板培养基的制备取灭好菌的营养琼脂培养基，在超净工作台里倒入平板中，大约15ml/个。供后续检测活菌数使用。图三5图三6注意事项：在配制营养琼脂培养基时，要先加少量水进行溶解搅拌，再加热水进行充分溶解，最后煮沸使琼脂全部溶解，否则琼脂没有溶解就分装，灭菌后就出现上图现象，有的培养基太硬，有的太软。实验内容及操作接种培养根据表2时间表进行接种培养，100ul/瓶，置于摇床30，100rmp/min培养。图四1活菌数检测根据表2时间表进行操作，取菌液100ul+900ul无菌水于EP管中进行连续梯度稀释，然后取100ul在平板培养基上进行涂布。放于培养箱中培养

6、，得下表数据。活菌数随培养时间变化表时间（hr）稀释倍数菌数平均值01081110831070910610696108221087.510678.5106107112106241.8108107910853161071275.2101010823010913318109332.0101010873211091066.3101010821024108231.61510101093027未检测30未检测表四1图四2图四3图四4图四5（为6h失败平板）注意事项:菌液稀释倍数要合理，在进行用涂布棒涂布的时候，涂布棒在酒精灯上灼烧后一定要冷却，否则会烫死菌种。涂布要均匀，多来回涂几次，否则就成上图6h失

7、败平板酶活检测计算公式：酶活力（U）=（A-空白）-（B-空白）-（对照-空白）V标/t反应D（倍数值）103根据表2时间表进行对应的时间段酶活的检测，,按照下表进行操作步骤试剂空白对照AB1发酵液上清0ml0ml100ul100ul2H2O100ul100ul0ml0ml3醋酸钠-醋酸缓冲液400ul4H2O1ml0ml0ml1ml51%可溶性淀粉溶液0ml1ml1ml0ml6室温放置反应5min5min7立即加2MNaOH2ml8DNS溶液2ml9100加热显色6-8min10冰水冷却3min11补水定容4.5ml12540nm检测表四2根据上表进行操作得到以下数据酶活力随培养时间变化培养

8、时间（h）A值（平均值）B值空白对照酶活力30.3350.1080.1070.22910.560.6490.3740.1080.2331507.50.9620.6300.1070.235204120.8920.5730.1070.214212160.8320.5490.1060.207182180.8090.4980.1070.22918.9210.6600.3620.1070.22917.6240.6060.3050.1060.26813.927未检测30未检测表四3图四6图四7图四8图四9注意事项：在使用仪器时，样品室使用完都要清洗，样品室的石英窗应保持清洁，样品室石英窗不应有污染。菌液浊

9、度检测按照培养时间的不同对菌液稀释10倍操作是取0.5ml菌液+4.5ml水，共3只，所测结果取平均值。对菌液稀释50倍操作是取1ml菌液+4ml水，再从中取出0.5ml+4.5ml水，即得稀释50倍，共3只，所测结果取平均值。下表为所得数据菌液浊度检测培养时间（hr）菌液稀释倍数吸光度值菌液浊度3100.0930.936100.4074.077.5100.6576.5712500.2713.516500.381918500.40720.3521500.4321.524500.51325.6527未检测30未检测表四4图四10酶蛋白的提取取培养菌液于离心管中，进行5000rmp，10min离心

10、。取上清，加入50ml冰的无水乙醇，放入4冰箱1h。5000rmp，20min离心。弃上清，加入1ml蒸馏水，混匀溶解。改变醋酸钠-醋酸缓冲液pH进行酶活力检测，得以下数据蛋白提取酶活力表pH值空白对照AB酶活力pH4.00.1070.2841.2270.99159pH5.00.1060.2671.3150.940214pH6.00.1060.2641.3830.939286表四5图四11注意事项：加入的无水乙醇一定是要冰的，不然容易使酶失活。细菌的染色和镜检1. 滴加少量种子液于干净载玻片上，用镊子置于酒精灯上端干燥。2. 待到种子液干燥后，滴加结晶紫染液于细菌涂抹处，使其布满菌膜，染色1m

11、in，用蒸馏水洗去多余染液，甩干载玻片上的积水。3. 滴加碘液覆盖菌膜，维持1min，用蒸馏水洗去，将载玻片上的积水甩干。4. 加95%酒精加于载玻片上脱色，左右摇动使其脱色均匀，脱色时间约为30s，脱色后立即用蒸馏水冲洗干净。5. 滴加稀释复红染液于菌膜上，覆盖住菌膜，染色1min。用蒸馏水冲洗去染液，甩去载玻片上积水。6. 待到载玻片上积水干燥后置于显微镜下观察细菌形态、颜色。图四12数据分析活菌数随培养时间的变化图五1酶活力随培养时间的变化图五2分析：在前7.5h，酶活力一直在增大，在7.5h时达到最大酶活力。之后就开始成快速下滑阶段，在7.5h到12h之间变化不算太大，这之间应该有段时

12、间是处于稳定期。菌液浊度随培养时间的变化图五3分析：从上表可以看出，菌液浊度随培养时间的变化在21h的时候浊度是最大的，说明此时菌数已经达到了最大极限。之后在24h是下降趋势，可能是菌体开始死亡自溶pH对提取的酶蛋白的变化图五4分析：根据上表的折线图，酶蛋白酶活力随pH值得变大而增大，在pH4.0 时酶活力最小，在pH6.0时最大，在pH4.0到pH5.0时酶活力增大的趋势比较明显，在pH5.0到pH6.0时酶活力增大不是很明显，说明这阶段pH值对酶活力影响不是很大。实验总结通过这次实训，我们对发酵流程有了一定的了解，由于时间的原因，我们的主要工程也放在了种子培养和摇瓶发酵上，在实训中我们分工

13、合作，对于我们个人的动手能力也有了一定的帮助。在实训过程中，失败在所难免，但在失败中我们学会了分析总结，分析出问题的所在，找出解决问题的办法，然后在重新进行这一步的实验。这次实训和我们平时的实验完全不同，在平时的实验中，都是老师说一步的做一步，完全跟着老师的安排走，没有思考过每一步的原因及注意事项；而这次的实训是完全靠自己动手，从溶液的配置开始，每一步都是我们自己独立思考，独自完成，即使有不懂的问题也是通过同学之间的讨论，查资料，最后在请教老师并与其探讨，从而寻找答案。在本次实训中我们不仅增强了自身的动手能力，还了解到了发酵工程在平时生活中的应用，并认识到了发酵技术在生物制药技术上所扮演的角色，对于我们生物专业的学生的重要性，并清楚的意思到只要我们将会从事生物相关的工作，这些就将是我们工作的一部分，我们必须熟练的掌握它。