分子标记辅助选择育种.docx

1、分子标记辅助选择育种 分子标记辅助选择育种传统得育种主要依赖于植株得表现型选择(henotyiealselection)。环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性得鉴定就受发病得条件、植株生理状况、评价标准等影响;品质、产量等数量性状得选择、鉴定工作更困难。一个优良品种得培育往往需花费78年甚至十几年时间。如何提高选择效率,就是育种工作得关键。育种家在长期得育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种得选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花得芽黄、番茄得叶型、抗TMV得矮黄标记、水稻得紫色叶鞘等形态性状标记,在育种工

2、作中曾得到一定得应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础得细胞学标记,在小麦等作物得基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要得作用,但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要就是利用基因得表达产物如同工酶与贮藏蛋白,在一定程度上反映基因型差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但就是它们多态性低,且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响,难以满足遗传育种工作需要。以NA多态性为基础得分子标记,目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因得标记定位、种质资源得遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其就是分子标记辅助选择（

3、molecula marker-assistedeleton,MS)育种更受到人们得重视。第一节分子标记得类型与作用原理一、分子标记得类型与特点按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类就是以分子杂交为基础得DN标记技术,主要有限制性片段长度多态性标记（strction agnt lgthpolmorpim，RLP标记)；第二类就是以聚合酶链式反应(Polmeraechinrecton,PCR反应)为基础得各种NA指纹技术。PCR就是Mllis等(98）首创得在模板DNA、引物与种脱氧核糖核苷酸存在得条件下,依赖于N聚合酶得体外酶促反应,合成特异DN片段得一种方法。PR技术得特异性取决于引物与模

4、板DNA得特异结合。C反应分变性（dnturaio）、复性(anallig)、延伸（xtesion）三步（图71)。变性指得就是通过加热使DNA双螺旋得氢键断裂,双链解离形成单链DNA得过程;复性（又称退火)就是指当温度降低时,单链DNA回复形成双链得过程,由于模板分子结构较引物要复杂得多,而且反应体系中引物DN大大高于模板N,容易使引物与其互补得模板在局部形成杂交链；延伸就是指在DA聚合酶与种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在得条件下,在聚合酶催化下进行以引物为起始点得5-得N链延伸。以上三步为一个循环,每一循环得产物可以作为下一个循环得模板，经253个循环后,介于两个引物之间得特异DNA

5、片段得到大量得复制,数量可达21-7拷贝。按照PC所需引物类型又可分为：单引物PCR标记,其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列得变异,包括随机扩增多态性N标记（Random别aplifition polymopim NA，APD)、简单重复序列中间区域标记(nr-simpe sequece reeatplymorpisms，ISSR)等技术；双引物选择性扩增得PCR标记,主要通过引物3端碱基得变化获得多态性,这种标记主要指扩增片段长度多态性标记(Ampliied fgmnt lengthlmophisms，AFLP);需要通过克隆、测序来构建特殊双引物得PR标记如简单序列重复标记

6、(ipe equeepts,SSR)、序列特征化扩增区域(Segion，简称SCAR技术）与序标位(equcggedsts,简称SS）等。第三类就是一些新型得分子标记,如单核苷酸多态性(Sinle ucletide poymrhim,NP）,由基因组核苷酸水平上得变异引起得D序列多态性,包括单碱基得转换、颠换以及单碱基得插入/缺失等。表达序列标签(Exrse sequencs tag，EST)就是在cDN文库中随机挑选克隆,并进行单边测序(nlepsseqence)而产生得30000bp得核苷酸片段。应用于分子标记辅助育种得标记主要有RFLP、RD、R、AFLP、S等。它们得遗传、表现特点总结

7、于表11。分子标记就是以NA多态性为基础,因而具有以下优点:表现稳定,多态性直接以DNA形式表现,无组织器官、发育时期特异性,不受环境条件、基因互作影响;数量多,理论上遍及整个基因组;多态性高,自然界存在许多等位变异,无需专门人为创造特殊遗传材料,这为大量重要性状基因紧密连锁得标记筛选创造了条件;对目标性状表达无不良影响,与不良性状无必然连锁;部分标记遗传方式为共显性,可鉴别纯合体与杂合体;成本不就是太高,一般实验室均可进行。对于特定探针或引物可引进或根据发表得特定序列自行合成。二、分子标记得原理与遗传特性(一）RFP发现最早，目前应用最为广泛得一种分子标记。这一类标记在2世纪70年代已被发现

8、。1980年,人类首先将其用于构建连锁图。目前，该技术已广泛用于动植物连锁图得构建、重要农艺性状基因得分子标记等。1.RLP标记得原理植物基因组DA上得碱基替换、插人、缺失或重复等,造成某种限制性内切酶（resictin enzymes,简称R)酶切位点得增加或丧失就是产生限制性片段长度多态性得原因。对每一个DNARE组合而言,所产生得片段就是特异性得,它可作为某一DNA所特有得“指纹”。某一生物基因组NA经限制性内切酶消化后，能产生数百万条DNA片段,通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离,然后将它们按原来得顺序与位置转移至易于操作得尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素(如32P)或非放

9、射性物质（如生物素、地高辛等)标记得DA作为探针,与膜上得DN进行杂交(即Southen杂交）,若某一位置上得DA酶切片段与探针序列相似,或者说同源程度较高，则标记好得探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后,即可显示出不同材料对该探针得限制性片段多态性情况(图172）。对于线粒体与叶绿体等相对较小得DNA分子,通过合适得限制性内切酶酶切,电泳分析后有可能直接检测出NA片段得差异,就不需outhr杂交。RFL分析得探针，必须就是单拷贝或寡拷贝得，否则,杂交结果不能显示清晰可辨得带型,表现为弥散状，不易进行观察分析。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(Rndo en

10、m克隆，简称G克隆)与P克隆。2.FL标记得特点RFLP标记具有共显性得特点。共显性(c-domnat）标记指得就是双亲得两个以上分子量不同得多态性片段均在F,中表现。它已被广泛用于多种生物得遗传分析,特别就是构建植物遗传图谱。RFP标记所需N量大(51鹏）,检测步骤繁琐,需要得仪器、设备较多，周期长,检测少数几个探针时成本较高,用作探针得DNA克隆其制备与存放较麻烦;检测中要利用放射性同位素(通常为少),易造成污染。尽管非放射性物质标记方法可用，但价格高,杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低。目前,RL标记直接用于育种成本高，人们正致力于将RFLP标记转化为PCR标记，便于育种上利用。(

11、二）RAPD标记1.RAD标记得原理iiams等(1990)以DN聚合酶链式反应为基础而提出得。所谓RP标记就是用随机排列得寡聚脱氧核苷酸单链引物(长度为1个核苷酸）通过CR扩增染色体组中得DNA所获得得长度不同得多态性DA片段。RA标记得原理同PCR技术,但又有别于常规得R反应。主要表现在以下3个方面：引物。常规得PCR反应所用得就是一对引物,长度通常为20bp（碱基对)左右;APD所用得引物为一个,长度仅0b。反应条件。常规得PC复性温度较高,一般为560，而RAD得复性温度仅为36左右。扩增产物。常规PCR产物为特异扩增,而RPD产物为随机扩增。这样，RAPD反应在最初反应周期中，由于短

12、得随机单引物,低得退火温度,一方面保证了核苷酸引物与模板得稳定配对,另一方面因引物中碱基得随机排列而又允许适当得错配，从而扩大引物在基因组A中配对得随机性,提高了基因组NA分析得效率。原理上与RAPD相似得还有APCR(Arirriy prmpolmerachain reactin)。APPC指在PCR反应中使用得引物长度与一般PCR反应中得引物相当，但在反应开始阶段退火温度较低,允许大量错配，因此可引发随机得扩增。一般在APPCR反应中应用放射性标记,其产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离,然后通过放射自显影,检测其多态性。2.RAP标记得特点如果基因组在特定引物结合区域发生DN片段插人、缺失或碱基突

13、变，就可能导致特定引物结合位点分布发生相应变化,导致CR产物增加、缺少或分子量大小得变化。若PCR产物增加或缺少,则产生显性得RAPD标记；若PCR产物发生分子量变化则产生共显性得RAD标记，通过电泳分析即可检测出基因组在这些区域得多态性。RAPD标记一般表现为显性遗传,极少数表现为共显性遗传。显性标记指得就是1得多态性片段与亲本之一完全一样,这样在杂交组合后代中扩增产物得记录可记为“有/无”,即把每一随机扩增多态性片段作为分子图谱得一个位点。RAD引物长一般为1个碱基,人工合成成本低，一套引物可用于不同作物,建立一套不同作物标准指纹图谱。RAP可以方便用于种质资源指纹档案建立,种内遗传多样性

14、分析与品种纯度鉴定。因此RAD也就是一种潜力很大得分子标记。由于使用DN扩增仪,操作自动化程度高,分析量大,且免去了RLP中得探针制备、同位素标记、Sothern印迹等步骤,分析速度很快。PD分析所需样品量少(一般50ng),对A质量要求较LP低。同时,RAPD标记还可转化为RFLP探针,SC及ST等表现为共显性与显性得分子标记。RAD最大缺点就是重复性较差。RAD标记得实验条件摸索与引物得选择就是十分关键而艰巨得工作。为此研究人员应对不同物种做大量得探索工作，以确定每一物种得最佳反应程序包括模板DNA、引物、Mg2+浓度等。只要实验条件标准化,可以提高RA标记得再现性。3.SCR标记在RAP

15、D技术得基础上,993年,Para等提出了一种将RPD标记转化成特异序列扩增区域标记,即SAR标记。它得基本原理就是：目标DA经APD分析后,将RPD多态片段克隆一对克隆片段两端测序一根据测序结果设计长为14bp得引物,一般引物前1个碱基应包括原来得RAPD扩增所用得引物。多态性片段克隆之前首先应从凝胶上回收该片段,由于Taq酶可使PCR产物3,末端带上A尾巴,人工设计得克隆载体5,末端有一个突出得碱基,这样可使PCR产物高效地克隆到载体上。将连接产物转化大肠杆菌,涂平板,挑选重组克隆,测序分析、设计引物，PCR扩增,检测就是否还能扩增出原来得多态性条带。这种转化成功得标记就称为AR标记。由于

16、SCAR标记所用引物长,特异性扩增重复性好，可有效得用于分子育种。(三)AFLP它就是荷兰Keyene公司科学家Ma &Pieterl993年创造发明得一种DA分子标记。该技术就是对限制性酶切片段得选择性扩增,又称基于CR得FLP。鉴于AFP标记得多态性强,一次可检测到10个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性得研究。1.AFLP标记得原理首先对基因组得DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高得限制性内切酶（frquentcutter),另一种为酶切频率较低得酶（rare utter)。用酶切频率较高得限制性内切酶消化基因组DNA就是为了产生易于扩增得,且可在测序胶上能较好分离出

17、大小合适得短DNA片段;用后者消化基因组DN就是限制用于扩增得模板DNA片段得数量。AFLP扩增数量就是由酶切频率较低得限制内切酶在基因组中得酶切位点数量决定得。将酶切片段与含有与其黏性末端相同得人工接头连接，连接后得接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PR反应得引物结合位点，通过选择在末端上分别添加13个选择性碱基得不同引物,选择性地识别具有特异配对顺序得酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增,最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。AFLP得原理示意图见图1。FLP分析得基本步骤可以概括为:（1)将基因组N同时用2种限制性核酸内切酶进行双酶切后,形成分子量大小不等得随机限制性片段，在这些

18、DNA片段两端连接上特定得寡核苷酸接头(ogonuleotideadtr)。()通过接头序列与PCR引物3末端得识别,对限制性片段进行选择扩增。一般PCR引物用同位素32P或33P标记。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特异扩增限制性片段。()将电泳后得凝胶转移吸附到滤纸上,经干胶仪进行干胶处理。(5)在X光片上感光，数日后冲洗胶片并进行结果分析。为了避免P分析中得同位素操作,目前已发展了AFP荧光标记、银染等新得检测扩增产物得手段。、L标记得特点FP技术结合了P稳定性与P技术高效性得优点,不需要预先知道NA序列得信息,因而可以用于任何动植物得基因组研究。FL多态性远远超过其她分子标记，利用放射性同

19、位素在变性得聚丙烯酰胺凝胶上电泳可检测到5010条ALP扩增产物,一次R反应可以同时检测多个遗传位点,被认为就是指纹图谱技术中多态性最丰富得一项技术。AFLP标记多数具有共显性表达、无复等位效应等优点,表现孟德尔方式遗传。该技术受专利保护,目前用于分析得试剂盒价格较贵,分析成本高;对NA得纯度及内切酶质量要求也比较高,这也就是它得不足之处。(四)SSR1987年,Naamura发现生物基因组内有一种短得重复次数不同得核心序列，她们在生物体内多态性水平极高,一般称为可变数目串联重复序列，简称VNTR(Viable量numertndpeat)。VR标记包括小卫星(minisalies)与微卫星(m

20、ierosatelits)标记两种。微卫星标记,即SR标记,就是一类由1个碱基组成得基序(motif)串联重复而成得DA序列,其长度一般较短，广泛分布于基因组得不同位置(图14A)。如(A)n、(AT)、(GG)、(GATA）n等重复,其中n代表重复次数,其大小在0之间。这类序列得重复长度具有高度变异性。对SSR得研究最早始于动物基因组,特别就是人类与哺乳动物基因组研究。目前植物SSR研究也非常活跃。根据基因数据库检索及基因文库杂交筛选,已明确在植物核基因组中,各种SS数量从大到小依次为（AT）、Tn、（AG)n、(T)n、（AAT)、（TT)、(GTT）、(GC)n、（GCT)n、（AAG)

21、n、（)n、(AATT)n、(TTAA)、(AAAT)n、(TTI）n、(AC)n、(G)等。1.R标记得原理尽管微卫星DNA分布于整个基因组得不同位置上，但其两端得序列多就是相对保守得单拷贝序列。根据微卫星DN两端得单拷贝序列设计一对特异引物，利用CR技术,扩增每个位点得微卫星DNA序列,通过电泳分析核心序列得长度多态性。一般地,同一类微卫星DNA可分布于整个基因组得不同位置上,通过其重复次数得不同以及重叠程度得不完全而造成每个座位得多态性。SSR标记多态性丰富,重复性好,其标记呈共显性,分散分布于基因组中。建立SR标记必须克隆足够数量得SSR并进行测序,设计相应得PCR引物。其一般程序(图

22、74A)如下:建立基因组DNA得质粒文库;根据欲得到得SS类型设计并合成寡聚核苷酸探针,通过菌落杂交筛选所需重组克隆。如欲获得(AT)I（TA)nSSR则可合成(AT)作探针,通过菌落原位杂交从文库中筛选阳性克隆;对阳性克隆DNA插人序列测序;根据S两侧序列设计并合成引物；以待研究得植物DNA为模板,用合成得引物进行PCR扩增反应;高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。目前,SSR标记技术已被广泛用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制及品种纯度检测,以及目标性状基因标记等领域。特别在人类与哺乳动物得分子连锁图谱中，已成为取代RFLP标记得第二代分子标记。2.SSR标记得特点

23、SR得检测就是依据其两侧特定得引物进行PCR扩增,因此就是基于全基因组DNA扩增其微卫星区域。检测到得一般就是一个单一得复等位基因位点。SR标记为共显性标记,可鉴别出杂合子与纯合子;重复性高,稳定可靠。为了提高分辨率,通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳它可检测出单拷贝差异。它兼具PCR反应得优点，所需DA样品量少,对DNA质量要求不太高。使用SSR技术得前提就是需要知道重复序列两翼得D序列。这可以在其她种得NA数据库中查询，但更多得就是必须针对每个染色体座位得微卫星,从其基因组文库中发现可用得克隆,进行测序,以其两端得单拷贝序列设计引物,因此微卫星标记得开发成本高。3.ISSR标记在SS标记得基础上开

24、发得ISR(intr-iple seuece epepolmrphicDNA)分子标记就是用两个相邻SR区域内得引物去扩增它们中间单拷贝序列,通过电泳检测其扩增产物得多态性。引物设计采用二个核苷酸、三个核苷酸或四个核苷酸序列为基元（motfs）,以其不同重复次数再加上几个非重复得锚定碱基组成随机引物，从而保证引物与基因组DA中SSR得或3末端结合,通过CR反应扩增两个SR之间得DNA片段。如（C)nX，(TG)X,（AT)nX，(CC)X，（GA)X等(代表非重复得锚定碱基)。agan等(7)已在小麦得SSR标记研究中发现SS标记可获得数倍于RPD标记得信息量。由于SSR标记不像L标记一样步骤

25、繁琐，且不需同位素标记,因此,针对重复序列含量高得物种,利用ISSR法可与RP，RAPD等分子标记相媲美。它对填充遗传连锁图上大得不饱与区段,富集有用得理想标记具有重要意义。(五）其她标记1.Cs(cleaved amplification plymrphi seuenetggd sites)CAPs技术又称为PRL。用特异设计得PC引物扩增目标材料时,由于特定位点得碱基突变、插入或缺失数很小,以至无多态性出现，往往需要对相应P扩增片段进行酶切处理,以检测其多态性(opyanz等,19)。其基本步骤就是：先利用特定引物进行PCR扩增,然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切,酶切产物通过琼脂糖凝

26、胶电泳将DNA片段分开,溴化乙锭(EB)染色,观察其多态性。与RFL技术一样，CAP技术检测得多态性其实就是酶切片段大小得差异。Talrt等(1994)在小麦中将L标记转化为TS标记过程中,有些TS标记无多态,但酶切后又出现多态性。APs作为一种分子标记，有以下几个优点:引物与限制酶组合非常多,增加了揭示多态性得机会,而且操作简便,可用琼脂糖电泳分析。在真核生物中,AP标记呈共显性。所需DN量少。结果稳定可靠。操作简便、快捷、自动化程度高。CAPs标记最成功得应用就是构建拟南芥遗传图谱。Koneczny等(9)将RLP探针两端测序，合成PR引物,在拟南芥基因组DNA中进行扩增,之后用一系列4碱

27、基识别序列得限制性内切酶酶切扩增产物,产生了很多CAP标记，并且只用了8个巧植株,就将这些CAPs标记定位在各染色体上并构建了遗传图谱。I-ittalmi(1995)等找到了一个抗稻瘟病基因(t)得CAPs标记。总之,CAP标记在二倍体植物研究中可发挥巨大得作用，就是PCR标记得有力补充。但在多倍体植物中得应用有一定局性。另外,CAP标记需使用内切酶,这又增加了研究成本，限制了该技术得广泛应用。2STS(qncetagged sits)STS就是序列标签位点或序标位得简称。它就是指基因组中长度为00bp，且核苷酸/顷序已知得单拷贝序列,可采用PR技术将其专一扩增出来。1989年,华盛顿大学得O

28、lsn等人利用STS单拷贝序列作为染色体特异得界标(Landmark),即利用不同TS得排列顺序与它们之间得间隔距离构成ST图谱，作为该物种得染色体框架图(Famwor ma),它对基因组研究与新基因得克隆以及遗传图谱向物理图谱得转化研究具有重要意义。SS引物得获得主要来自RLP单拷贝得探针序列,微卫星序列。其中，最富信息与多态性得STS标记应该就是扩增含有微卫星重复顺序得NA区域所获得得ST标记。迄今为止，SS引物得设计主要依据单拷贝得RFLP探针，根据已知RFL探针两端序列,设计合适得引物，进行PC扩增。与RL相比,TS标记最大得优势在于不需要保存探针克隆等活体物质,只需从有关数据库中调出

29、其相关信息即可。最近,随着人类基因组研究得深入,表达序列标定(exressed euencetags，ESs)应运而生。由于它直接与一个表达基因相关，很易于转变成TS。SS标记表现共显性遗传，很容易在不同组合得遗传图谱间进行标记得转移,且就是沟通植物遗传图谱与物理图谱得中介,它得实用价值很具吸引力。但就是,与SSR标记一样,ST标记得开发依赖于序列分析及引物合成,目前仍显成本太高。目前，国际上已开始收集SS信息,并建立起相应得信息库,以便于各国同行随时调用。第二节 重要农艺性状基因连锁标记得筛选技术MA育种不仅可以通过与目标基因紧密连锁得分子标记在早世代对目得性状进行选择,同时,也可以利用分子

30、标记对轮回亲本得背景进行选择。目标基因得标记筛选（genetgg)就是进行MS育种得基础。用于MA育种得分子标记需具备3个条件:分子标记与目标基因紧密连锁(最好或更小,或共分离）;标记适用性强，重复性好，而且能经济简便地检测大量个体(当前以PC为基础);不同遗传背景选择有效。遗传背景得A则需要有某一亲本基因型得分子标记研究基础。一、遗传图谱得构建与重要农艺性状基因得标记通过建立分子遗传图谱,可同时对许多重要农艺性状基因进行标记。许多农作物上已构建了以分子标记为基础得遗传图谱。这些图谱在重要农艺性状基因得标记与定位、基因得图位克隆、比较作图以及A育种等方面都就是非常有意义得。但就是由于分子标记数目得限制,目前作图亲本得选用首先考虑亲本间得多态性水平,育种目标性状考虑较少,这样使遗传图谱得构建与重要农艺性状基因得标记筛选割裂开来。因此,根据育种目标选用两个特殊栽培品种作为亲本来构建