第八章合子胚培养.docx

1、第八章合子胚培养第八章 合子胚培养1合子胚培养的概念1.1植物胚胎培养的概念植物胚胎培养是指对植物的胚、 子房、胚珠和胚乳进行离体培养， 使其发育成完整植株的技术。 目前，胚胎培养除了应用于育种工作外， 还广泛被用来研究胚胎发生过程中的生理代谢变化以及有关影响胚 发育的内外因素等问题。并且，在离体胚培养成功的基础上，又进行 了胚乳、胚珠和子房的培养，特别是未受精胚珠或子房培养，为进行 离体授粉（或试管受精 ）的研究提供了重要的技术条件。 试管受精技术 使克服远缘杂交中花粉与柱头之间的不亲和性成为可能。1.2合子胚培养的概念 合子胚培养是指在无菌条件下分离和培养有性胚， 以期获得可育 植株的一种

2、技术。 1904 年， Hannig 最早在无菌条件下进行了离体胚 培养实验，他当时所培养的是两种十字花科植物辣根菜和萝卜的成 熟胚。在含无机盐和蔗糖的半固体培养基上， Hannig 成功将胚培育 成可移栽的幼苗。随后，许多研究者从一些植物的成熟种子，特别是 从败育导致种子不能萌发的植物中分离种胚，通过离体培养获得植 株。依靠合子胚培养技术，现在已经能够挽救早熟败育的杂志胚了。2 胚培养的类型离体胚培养可分为 幼胚（未成熟胚） 培养和成熟胚培 养。离体培 养中，这两类胚的成苗途径和所需营养条件也不太一样。2.1成熟胚培养由于成熟胚生长不依赖胚乳的贮藏营养， 只要提供合适的生长条 件及打破休眠，

3、它就可在比较简单的培养基上萌发生长，形成幼苗。 所以，培养基只需含无机盐和糖即可。另外，成熟胚培养技术也要求 不严，将受精后的果实或种子 （ 带种皮 ） 用药剂进行表面消毒， 剥取种 胚接种于培养基上，在人工控制条件下即可发育成完整植株。2.2幼胚（未成熟胚）培养幼胚指的是尚未成熟即发育早期的胚。 它较成熟胚难培养， 要求 的技术和条件也较高。幼胚培养时，可能有三种生长方式：一是继续 进行正常的胚胎发育， 维持胚性生长， 最终形成具有萌发能力的成熟 胚；二是不能维持胚性生长，迅速萌发为幼苗，这种未经完成正常的 胚胎发育过程而形成幼苗的现象称为 “早熟萌发” （precocious germin

4、ation） 。三是形成愈伤组织。 由于早熟萌发形成的幼苗往往畸 形瘦弱，甚至死亡。所以，进行幼胚培养时，关键是维持胚性生长。 为了保证离体幼胚能沿着胚胎发生的途径发育， 其对营养的需求较成 熟胚复杂。另外，通过培养远缘杂交后的幼胚可获得远缘杂种。 3合子胚培养方法3.1材料的选择与灭菌由于植物类型及实验目的的不同， 幼胚培养对材料的要求也不一 样。如果是一般的实验或示范， 最好是先用一种胚易于剥离的植物如 大粒种子的豆科和十字花科植物； 如希望培养材料的胚发育时期具有 一致性，应选择开花和结实习性有规律的植物， 如荠菜具有总状花序， 各个胚珠处于不同的发育时期， 一般沿花序轴由上而下， 胚龄

5、逐渐增 加。每个蒴果含2025个胚珠，且基本处于同一发育时期；如希望 培养某一发育时期的胚， 则须对刚开放的花进行人工授粉， 并了解该 植物授粉后的天数与胚胎发育的相应关系； 如培养远缘杂种胚， 则必 须在其夭折前进行。取回大田或温室里授粉受精后的植物子房，用 70的酒精进行 几秒表面消毒，再用0.1 %氯化汞灭菌10-30min，用无菌水冲洗3 4 次，即可用于胚的分离和培养。3.2胚的分离及培养3.2.1胚的分离一般来说， 在进行胚的离体培养时， 必须把胚从周围的组织中剥 离出来。成熟胚只须剖开种子即可剥离，比较容易。但有些种子种皮 很硬，须先在水中浸泡之后才能剖开。 在剥取比较小的胚的时

6、候则须 借助解剖镜，并且在剥离出来后，要立即转入培养瓶中。对于幼胚的剥离，是把灭菌后的材料在无菌条件下切开子房壁， 用镊子取出胚珠，剥离珠被，取出完整的幼胚，并置培养基上进行培 养。由于植物的种类及发育时期的不同， 幼胚分离的技术和难度也不 一样（p160161,荠菜和大麦的幼胚剥离）。3.2.2胚的培养对于成熟胚来说, 由于其生长不依赖胚乳的贮藏营养, 只要提供 合适的生长条件及打破休眠,它就可在比较简单的培养基上萌发生 长,形成幼苗。所以,培养基只需含无机盐和糖即可。另外,成熟胚 培养技术也要求不严, 将受精后的果实或种子 （ 带种皮 ） 用药剂进行表 面消毒，剥取种胚接种于培养基上， 在

7、人工控制条件下即可发育成完 整植株。幼胚较成熟胚培养难， 要求的技术和条件也较高。 胚胎发育过程 可分为两个时期：一为异养期 (heterotrophy period) ，即幼胚由胚 乳及周围的组织提供养分；二为自养期 (autotrophy period) ，此时 的胚已能在基本的无机盐和蔗糖培养基上生长。 胚由异养转人自养是 其发育的关键时期， 这个时期出现的迟早因物种而异。 在这两个时期 之内，培养中的胚对外源营养的要求随胚龄的增加而逐渐趋向简单。在人工培养基上幼龄胚通常很难培养， 尽管对培养基做了不少改 进，胚在发育的极早时期仍发生夭折，幼胚很难培养成功。在这种情 况下，利用胚乳看护培

8、养， 则可显著提高幼胚的成活率，因为植物正 常的生长发育中， 胚是由紧紧包围它的胚乳组织供给营养的。 如进行 大麦未成熟胚离体培养时， 如果在其周围培养基上存在来自同一物种 的离体胚乳， 则对胚的生长有明显促进作用。 有时异种胚乳对胚的生 长比同种的更为合适， 如进行谷类胚乳看护培养时， 把大麦的胚移植 到小麦胚乳上，其生长优于在大麦胚乳上。在大麦X黑麦的属间杂交 中，若把杂种未成熟的胚放在事先培养的大麦胚乳上进行培养， 可使 30%40%的杂种未成熟胚发育成苗，而传统的胚培养法只有 1 %的成功率。4 影响胚培养的因素4.1培养基4.1.1无机盐用于胚培养的无机盐配方很多， 对其中每种成分的

9、作用并无精确 的评价。 成熟胚培养中，主要采用一些较简单的培养基，如 Tukey、Randolph、White 等。幼胚培养的培养基主要有 MS、B5、Nitsch 、Rijven 、 White、Rangaswang Norstog 等。Monnier(1976)研究了几种标准的 无机盐溶液(包括Knop Miller、MS等培养基)对荠菜胚培养的作用， 发现在一定的培养基上， 未成熟胚的生长和存活之间并不存在相关性 (p165,图10.6 )。如在MS培养基中，未成熟胚的生长最好，但存 活率却低；在 Knop 培养基中，虽然其毒性小，但胚的生长却较差。 Monnier通过变动MS培养基中每

10、一种盐分的浓度，配制了一种既有 利于生长、也有利于存活的新培养基。在这种培养基上，胚的生长和 存活都很好，与MS培养基相比，这种培养基中 K和Cf的水平比较 高，而NJ的水平则低(p157表10.3)。另据Umbeck和Norstog(1979)报道，培养基中的NH*对于大麦 未成熟胚的正常生长和分化是必需的。当以N0T作为无机氮的惟一来 源时，500卩m长的大麦胚在培养中只能略有生长，而这主要是由于 细胞伸长造成的。盾片等的分化则需要有 4.38.6 mmo| /L NHL+的存在。在曼陀罗和紫花曼陀罗中，对未成熟胚的培养来说， N才或是必需的，或是一种较好的无机氮；另一方面，黄麻的胚则绝对

11、需要硝 态氮。4.1.2碳水化合物在离体 的成熟胚和未成熟胚培养中， 一般都需要有一种适当的碳 源。迄今为止， 蔗糖被认为是碳水化合物的最好形式，在胚培养中的应用最为广泛。 在胚培养基中加入蔗糖不仅是作为一种能源， 而且是 为了保持适当的渗透压， 后者对于未成熟胚的培养来说尤为重要。 最 适蔗糖浓度因胚的发育时期而有所不同。成熟胚在含 2蔗糖的培养基中就能很好生长；幼胚则要求较高水平的糖浓度，如果浓度过低， 会引起幼胚过早萌发。 这是因为在自然条件下， 原胚就是被一种高渗 液体包围着的。适于原胚培养的蔗糖浓度一般为 8%12%。在长期 的培养过程中， 随着培养时问的增加， 必须把胚转移到蔗糖水

12、平逐步 降低的培养基中。另有观点认为， 胚在离体条件下的生长和分化在很大程度上并不 依赖于渗透压的大小，而主要取决于某些生长调节物质的存在与否。 如高渗透压阻止离体未成熟胚早熟萌发的作用可以用 ABA有效地取代。4.1.3氨基酸和维生素在胚培养中加入氨基酸， 无论是单一的还是复合的， 都能刺激胚 的生长。加单一氨基酸时，以谷氨酰胺最有效，如 500mgL 的谷氨 酰胺可促进多种植物离体胚的培养， 1 600mg L 的谷氨酰胺能强烈 促进银杏胚形成的幼苗生长。水解酪蛋白（CH）是一种氨基酸复合物，一直被广泛用于胚培养。 如水解酪蛋白和酵母提取物对荠菜及棉花心形胚生长有明显的促进 作用，水解酪蛋

13、白是四季橘很小的球形胚 （1428卩mK 1428卩m） 的培养所必需的。胚对水解酪蛋白的敏感性因物种而异，栽培大麦最适浓度为500mg/L;毛曼陀罗和曼陀罗的胚在含有 400 mg/L CH的培养基上 长得最好； 50 mgL CH 能促进紫花曼陀罗胚的生长，但 100 mgL 时则有毒害作用。常用于胚培养的维生素类有硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙等。 维生素对发育初期的幼胚培养是必需的， 而已萌发生长的胚， 因其细 胞能合成自身需要的维生素， 维生素的加入可能对其形态发生有抑制 作用。因而，最好是只有在通过实验证实了它们的必要性之后，再在 培养基中加入维生素。 硫胺素对植物胚培养的根伸长有促

14、进作用， 烟 酸、泛酸钙和生物素则对茎生长的促进作用更为显著。4.1.4植物生长调节剂除了在某些植物中为了打破休眠以外， 没有证据表明离体的成熟 或未成熟胚的正常发育需要外源生长调节物质。 实际上，生长素对于 胚的生长通常表现抑制作用。 Monnier(1978) 建议，在胚培养基中不 应加入植物激素， 以免引起结构异常。 他认为胚对大多数生长调节物 质都是自主的。在这点上至少对 GA来说已在菜豆上得到了清楚的证 明，其中胚柄可以满足离体胚对激素的需要。但是，如果为了由胚和 胚段诱导愈伤组织，则通常都须在培养基中加入生长素或细胞分裂 素，或二者都加。在大麦未成熟胚(500 m长)培养中，若加入

15、ABA特别是当有NH+ 存在的情况下，不但可以抑制由 GA和激动素所促成的早熟萌发，而 且能使胚循序进行正常的发育。4.1.5天然有机物正常植物体上， 胚的生长受胚乳滋养，因此，加入一些天然的胚 乳或种子提取物，对离体胚的生长有促进作用。20世纪40年代，Van Overbeek 等使用椰子汁培养曼陀罗的心形胚获得成功后，人们广泛 地在胚培养中使用椰子汁。使用多种天然提取物 ( 大麦胚乳、麦芽、 马铃薯块、大豆等提取物 )进行大麦幼胚 (0.5mm 胚)培养，只有大麦 胚乳可促进其生长，形成幼苗。在其他植物中也发现类似情况，如玉 米胚乳组织的提取物可促进培养的玉米胚生长。 Kent和Brink

16、(1947)报道，海枣和香蕉的浸提物、小麦面筋水解物、牛奶和番茄汁 (TJ) 能够促进大麦未成熟胚的生长和抑制它们的早熟萌发。 在上述这些物 质中以番茄汁效果最好。 此外，还发现蜂王浆对银杏幼胚正常分化有 促进作用，并能减少培养胚的死亡率，抑制胚形成愈伤组织。4.1.6培养基的 pH培养基的pH对胚的培养也有一定的影响。如荠菜胚珠液的 pH值约为6.0 ,而其离体胚在pH值为5.47.5的培养基中都能正常生长。 对紫花曼陀罗心形早期的胚培养最适 pH值在5.07.5的范围内。8 日龄的水稻胚在pH值5和9时，生长最好。Norstog和Smith(1963) 报道，培养基的pH值对于大麦未成熟胚

17、的器官分化是关键因素，最 适值约为4.9。当pH值在5.2以上时，胚虽能生长，但不发生明显 的分化。4.2 培养条件4.2.1温度大多数植物胚培养的温度为 2530C,但也有些植物需要较低或较高的温度。如马铃薯胚培养时温度20C较好，香子兰的胚在32 34 C下生长最好，柑橘、苹果、梨 2530C是合适的，棉花胚32C 生长最好。有些植物，如桃的胚培养则需在变温条件下进行。4.2.2光照由于胚在胚珠内的发育是不见光的， 所以一般认为在 黑暗或弱光 下培养 幼胚比较适宜， 光对胚胎发育有轻微的抑制作用。 离体培养条 件下进一步发育的幼胚对光的需求， 因植物种类而异。 棉花幼胚先在 黑暗中培养，然

18、后转入较强光照下培养，子叶的叶绿素生成很慢，但 转人弱光下培养，子叶很容易产生叶绿素；荠菜胚培养，每天给予 12h的光照比全黑暗条件好。4.3 胚柄胚柄是一个短命的结构， 长在原胚的胚根一端， 当胚达到球形期 时，胚柄也发育到最大。有关胚柄的结构、细胞学和生理生化的详细 研究表明，胚柄积极参与幼胚的发育过程。一般胚柄较小，很难与胚 一起剥离出来， 所以培养的胚都不具备完整的胚柄。 有研究指出在幼 胚培养中，胚柄的存在对幼胚的存活是关键。如红花菜豆较老的胚， 不管有无胚柄的存在，均能在培养基中生长；但幼胚培养时，不带胚 柄会显著降低形成小植株的频率。 因为幼胚培养中， 胚柄的存在会显 著刺激胚的

19、进一步发育，而且这种作用在胚发育的心形期达到高潮。 使用生长调节物质，如 5mgL 赤霉素能有效地取代胚柄的作用。如 红花菜豆胚心形期时胚柄中赤霉素的活性比胚本身高 30 倍，子叶形 成后，胚柄开始解体，GA水平开始下降，但胚中GA的水平增高。当 没有胚柄存在时，一定浓度范围的 KT 可促进幼胚的生长，但其作用 难与赤霉素相比。但 Monnier(1978) 的观点是，无胚柄的极幼龄胚所以难于培养， 是由于在除掉胚柄时所引起的损伤造成的。 在荠菜幼胚培养中， 无胚 柄的胚在胚柄与胚连接点附近的胚根原区域会出现细胞坏死的现象。5 胚培养的应用5.1 通过“胚拯救 获得远缘杂种 合子胚培养的最大用

20、途是借以建立稀有的远缘杂种。 在很多种间 和属间杂交中，受精作用能正常完成，胚也能进行早期的发育，但由 于胚乳发育不正常或杂种胚与胚乳之间生理上的不协调， 造成杂种胚 早期夭折， 即发生所谓“受精后障碍”， 最终不能形成有萌发力的种 子。在这种情况下，通过“胚拯救” 即可克服这种受精后障碍，产 生远缘杂种。 “胚拯救”的方式有 3 种：一是杂种幼胚在人工培养 基上培养， 二是杂种幼胚的胚乳看护培养， 三是杂种幼胚的愈伤组织 培养：5.1.1 杂种幼胚在人工培养基上培养 在发生“受精后障碍”的情况下，若把杂种胚在开始夭折之前剥 离出来，置于一种适当的人工培养基上培养， 则杂种胚常常表现出正 常生

21、长的潜力，最终长成杂种植株。例如，黄香草木犀是一种很重要 的牧草， 但其植株中含有大量对牛有害的物质香豆素。 同属的另一 个物种白香草木犀香豆素含量很低， 为了把这个有利性状转入到前一 个物种，将这两个物种进行了杂交，结果是，杂种胚虽能生长一段时 间，但由于授粉8 10 d后胚珠夭折，未能得到种子。后来通过杂种 幼胚培养的方法， 终于由这个杂交组合中获得了杂种植株。 采用类似 方法，在花百合与王百合之间，鹿子百合与天香百合之间，以及车轴 草属的若干物种之间也获得了杂种。在稻属植物中， 很多研究者都想通过种间杂交选育抗病虫害和抗 逆的高产水稻品种，但胚的夭折一直是实现这个目标的一个严重障 碍。胚

22、培养正是克服这个障碍的有效途径。 在若干个通常不能成功的 稻属种间杂交中， 人们通过对杂种胚进行培养而获得了正常的杂种植 株。在番茄中，为了把抗病虫害的特性由野生物种转移到栽培物种， 一个理想的途径是把栽培番茄和野生番茄进行杂交。 当把野生番茄用 做母本时，由于受精前障碍，杂交不能成功。然而反交时可以受精， 只是由于胚的夭折不能形成有生活力的种子。 而借助于胚培养， 在以 栽培番茄做母本的杂交中获得了杂种植株。另外，在有些远缘杂交中，如在大麦x黑麦的杂交中，为了能够 得到适于培养的胚，授粉之后必须在穗子上喷洒 GA, NAA和2ip（二甲基丙烯嘌磷 ）的混合液。在未经处理的穗子上，胚在达到适于

23、培养 的大小之前，种子的发育已经停止。5.1.2杂种幼胚的胚乳看护培养如果胚的夭折发生在发育的极早期， 由于人工培养基很难取代天 然胚乳的作用， 采用以上方法拯救杂种仍会遇到很大困难， 在这种情 况下，则可尝试胚乳看护培养法。5.1.3杂种幼胚的愈伤组织培养在以上两种方法皆难奏效的情况下， 则可尝试杂种幼胚愈伤组织 培养法，即先把杂种幼胚诱导成愈伤组织， 经过或长或短的继代培养 之后，再诱导杂种愈伤组织分化植株。 这种方法是 20 世纪 80 年代发 展起来的一种十分有效的方法。 例如，在小麦和簇毛麦的属间杂交中， 中国农业大学（1991）采用这种方法，由仅仅2个不足1mn大小的杂种 幼胚，在

24、不到 1 年的时间内，获得了数以万计的杂种植株，通过杂种 愈伤组织和杂种试管苗的染色体加倍， 获得了数以千计的双二倍体种 子。除了以上介绍的例子外， 采用未成熟胚愈伤组织培养方法， 在大 麦X小麦，栽培番茄X智利番茄等远缘杂交中也都取得了成功。在远缘杂交之后， 通过染色体的定向消除而产生单倍体， 是胚培 养的另一项新用途。如在栽培大麦X球茎大麦的杂交中， 受精作用不 难完成，但在胚胎发生的最初几次分裂期间， 球茎大麦染色体受到选 择性的淘汰，结果形成了单倍体的胚，它们生长相当缓慢，加之受精 后25d胚乳逐渐解体，因此为了得到大麦的单倍体植株，必须把 胚剥离出来进行培养。5.2获得单倍体在远缘杂

25、交之后， 通过染色体的定向消除而产生单倍体， 是胚培 养的另一项新用途（ p175）。5.3打破种子休眠，缩短育种周期许多植物的种子发育不完全或有抑制物存在而影响种胚发芽。 如一些无胚乳种子 （如兰科） 蒴果成熟时，胚龄幼小，需与微生物“共生发芽”银杏种子脱离母体后，胚龄幼小，仍继续吸收胚乳营养， 45 个月后才能成为成熟胚。油棕的种胚需要经过几年才能成熟。而通 过幼胚培养，可促使这些植物的幼胚达到生理和形态上的成熟而提早 萌发，形成植株。在有些情况下，园艺植物如落叶树的育种工作，会 因种子休眠期太长而延误。通过胚的离体培养，可使休眠期缩短。如 通过胚培养可使鸢尾的生活周期由 23 年缩短到

26、1 年以下；蔷薇属 一般需 1年才能开花，而通过胚培养产生的幼苗在 2 3个月内即能 开花，在 1 年中可繁殖 2 代。5.4提高种子萌发率长期营养繁殖的植物具有形成种子的能力， 但其生活力较低， 萌 发成苗率低下， 胚培养可促进这类种子萌发和形成幼苗。 如芭蕉属有 许多结实的品种，自然情况下胚不能萌发，如果取出胚，在简单的无 机盐培养基中就能很快使其萌发形成幼苗； 芋的块茎在自然条件下所 结种子不能萌发，对其进行胚的离体培养，可促进萌发形成幼苗。 椰子的胚乳是液体的， 但有一种变异类型， 它们的椰子不能生成液体 胚乳， 取而代之的是一种柔软肥厚的组织。 这些果实被称做 “MakapunO。由

27、于十分罕见，“ MakapunO的价格非常昂贵，在菲 律宾只有盛大宴会才供应这种果实。 然而在正常情况下， 这种椰子的 种子不能萌发。使用离体胚培养技术，现已成功地由“ MakapunO种子获得了植株，它们种在田间后所结的果实有 85是“ MakapunO”。5.5种子生活力的快速测定由于通过胚培养可以打破种子休眠， 因而也可以利用这项技术进 行种子生活力的快速测定。 和一般用于种子生活力测定的染色方法相 比，离体胚的萌发被认为是一个更可靠和更精确的测定方法。复习思考题：1、什么是胚胎培养？什么是合子胚培养？简述胚培养的方法和 应用。2、试述合子胚培养的过程。3、试述影响胚培养的因素。4、简述“胚拯救 获得远缘杂种的方式。