蛋白指纹图谱技术与肝病研究.docx

1、蛋白指纹图谱技术与肝病研究蛋白指纹图谱技术与肝病研究【关键词】 蛋白指纹图谱；SELDI 摘要 SELDITOFMS是近些年来显现的一种自动快捷、灵敏特异、高通量的蛋白组学研究技术，在临床诊断和基础研究中都有良好的应用前景。本文结合国内外最近几年来文献报导对该技术在肝病研究中进展概况加以评述。 关键词 蛋白指纹图谱；SELDITOFMS；肝癌；标志物 肝脏是人体最大的腺体，是人体内最重要的器官之一，其大体功能是物质代谢，还包括分泌、排泄、物质转化及胆红素代谢等功能。肝脏疾病严峻阻碍人类健康，并对社会经济产生庞大阻碍。肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最多见的恶性

2、肿瘤之一，死亡率高，严峻危害人们的躯体健康。初期诊断和及时医治是提高肝癌患者成活率的关键，但目前的诊断方式灵敏度低、特异性差，已成为肝癌诊疗的一个难题，因此寻觅特异的肝癌标志物已经成为肝病研究领域的热点。蛋白质组学(proteomics)技术是后基因组时期又一重要研究工具，在生命科学领域中发挥重要作用13。蛋白质组学是通过对不同时刻和空间发挥特定功能的蛋白质群体进行研究，说明生物体全数蛋白质的表达和功能模式，包括鉴定蛋白质表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能及彼此作用方式等，从机体或细胞的蛋白质整体活动来揭露生命规律。 随着蛋白质组学技术的进展，该技术日趋应用于肝病研究中46。人类蛋白质组学

3、组织(human proteome organization,HUPO)已经发起了人类肝脏蛋白质组研究打算(human liver proteome project,HLPP)，旨在通过对肝脏蛋白质组进行系统研究，从蛋白水平上解决相关疾病的诊断和医治等问题，目前已经取得必然的进展7。 最近几年来，蛋白指纹图谱技术，也称为表面增强激光解吸电离飞行时刻质谱(surface enhanced laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry，SELDITOFMS)以其独特的技术优势普遍应用于临床研究8，在疾病诊断和疾病标志物发觉

4、等研究中显示出独特的作用911。本文拟就蛋白指纹图谱技术在肝病研究中的应用进展加以评述。 1 SELDITOFMS简介 SELDITOFMS技术结合了蛋白芯片和生物质谱技术，是继基因芯片以后显现的新一代生物芯片技术1214。该芯片设计的大体原理是：第一用生物或化学方式在载体表面制成点状芯池，再点入待检的生物样品，其中的蛋白分子通过其自身的生物或理化性质(亲水性、疏水性、金属络合及离子作用等)与芯片相结合，从而实现捕捉、保留和纯化与之特异性结合的蛋白分子。接着用缓冲液洗脱未结合或非特异性结合的分子后再用激光脉冲进行轰击，即释放出靶点上的特异性蛋白分子。不同质荷比(m/z)的离子在电场中飞行的时刻

5、犬牙交错，分子量越大的离子在电场中飞行的时刻越长，反之那么越短。最后通过生物质谱(TOFMS)即可绘制出一张质谱图。该图经分析软件处置后还可形成模拟谱图，用于更直观地显示样品中各类蛋白质的相对分子质量、含量及磷酸化位点等信息15，16。 蛋白质芯片依照表面物质的不同，可将其划分为化学型和生物型两类17。化学型芯片通过化学作用结合样品中的蛋白质，并依照其作用原理的不同又可进一步细分为疏水性芯片、亲水性芯片、阳离子芯片、阴离子芯片和金属亲和芯片等类型；生物型芯片那么是把生物活性分子，如抗体、酶、受体、DNA等结合到芯片表面，借助抗原抗体、酶底物、受体配体、蛋白质-DNA等彼此作用结合样品中的蛋白质

6、。生物芯片特异性高，还能够进行蛋白质定量。 2 SELDI技术与肝病研究 作为蛋白质组学研究强有力的工具，目前SELDITOFMS技术在研究肝炎(chronic hepatitis)、肝硬化(hepatocellular cirrhosis)和肝癌(hepatocellular carcinoma)的蛋白指纹图谱表达及不同肝病之间的因果关系、演变规律及其特点表现，将为3种病的初期预警、诊断、医治及预后提供依据，从而可能从全然上改变肝病的诊断和医治水平。 肝病的血清蛋白指纹图谱研究 目前各国学者都踊跃探讨肝病的蛋白质组学研究，其中包括采纳SELDITOFMS对各类不同的临床样本加以分析，旨在成立

7、肝病的临床诊断方式，并发觉新的肝病标志物。其中血清是最为常见的分析样本，也有采纳SELDITOFMS技术来分析组织蛋白指纹图谱18。有关SELDITOFMS技术在肝病血清指纹图谱分析中的应用概况，见表1。从文献报导情形来看，多数报导均采纳弱阳离子互换蛋白芯片和固相金属螯合蛋白芯片来取得肝病血清指纹图谱。表1 蛋白指纹图谱技术应用于肝病血清指纹图谱分析（略） 肝癌患者及健康人的血清 WCX2芯片 两组间有17个稳固的不同表达标志蛋白，其中有6个标志蛋白在肝癌患者血清中高表达，11个标志蛋白在肝癌患者血清中低表达。分析系统挑选出13752 Da及11472 Da标志蛋白成立肝癌的诊断模型，经盲法检

8、测，对肝癌的诊断特异性为%，灵敏度为%，阳性预测率为%，取得较为中意的诊断结果19 20例AFP<500 g/L和38例肝癌患者的血清 IMACCu芯片和WCX2芯片 发觉250余种蛋白质在肝癌和慢性肝病中表达明显不同。通过人工网络来辨别慢性肝病与肝癌，结果用ROC曲线分析显示，全数样本AUC为，AFP<500 g/L者为，在特异性为90%时其诊断灵敏性达到92%。肿瘤特异性的标志物可用于肝癌的检测及分类20 135例肝细胞癌患者血清，95例(其中33例为肝细胞癌伴门静脉癌栓，62例为肝细胞癌不伴门静脉癌栓) WCX2芯片 16个蛋白峰不同有超级显著性(P<，6个蛋白在肝细胞

9、癌伴门静脉癌栓组中上调，而10个蛋白在肝细胞癌伴门静脉癌栓组中下调；选择不同表达最明显的7个蛋白峰成立的决策树模型其灵敏性为%，特异性为%；盲法验证该模型准确率为%，灵敏性为100%，特异性为%，阳性预测值为%，阴性预测值为100%21 84例HCC患者血清(有转移45例;无转移39例) WCX2芯片 在转移和未转移的HCC患者血清中共检出的146个蛋白质峰，其中仅有11个蛋白质峰不同有超级显著性(P<22 112例HCC患者血清 WCX2芯片 门静脉癌栓、肿瘤数量、肿瘤大小是阻碍肝细胞癌患者血清蛋白质指纹图谱的重要因素，而性别、肝硬化、甲胎蛋白对血清蛋白质指纹图谱没有明显阻碍23 肝硬

10、化患者和HCC患者血清 IMAC30-Cu芯片 通过人工神经网络方式成立诊断模型，灵敏性达94%，特异性达86%，采纳LCMS/MS方式鉴定了2个蛋白，别离为kappa和lambda免疫球蛋白轻链24 HCC患者、肝硬化患者、正常志愿者血清 WCX2芯片 运用人工神经网络方式成立诊断模型，诊断成效明显好于传统AFP方式25，26 57例HCC;38例肝硬化;36例非硬化肝病患者;39例健康人血清 IMACCu 利用38个不同表达蛋白成立疾病诊断模型，能够用来区分HCC和肝病、肝硬化等肝类疾病27 25例HBV-肝硬化;20例HCC患者;25例健康人血清 发觉2个蛋白(m/z 7772与m/z

11、3933)只非肝硬化群体中表达，在HBV-肝硬化中没有检测到。笔者以为2个血清标志物能够用来诊断和评判疾病状况28 肝病标志物研究 应用SELDITOFMS技术研究肝病蛋白指纹图谱，除通过不同组间特异性蛋白的表达不同来成立疾病诊断模型，更为重要的是通过对特异性蛋白的鉴定，确信不同蛋白的成份，从而有目的地运用分子生物学技术对潜在生物标志物的生物功能进行分析，从而有助于肝病的病理研究，同时还能够作为疾病标志物用于疾病诊断、预后和疗效检测等。 Paradis等29对38例肝硬化(非肝细胞癌)患者和44例肝细胞癌患者的血清用弱阴离子型芯片进行测定。发觉有30个蛋白表达有明显不同。通过对6个不同水平最大

12、的蛋白进行分析并成立HCC诊断模型，盲法验证准确率为%，灵敏性为90%。并鉴定分子量为8900 Da的蛋白为V10 vitronectin的C结尾。Lee30采纳SELDITOFMS技术挑选慢性肝炎及肝癌的血清不同蛋白，质谱鉴定质量数为8900 Da的潜在标志物是Complement C3a蛋白，该蛋白在HCC中表达情形与PS20芯片及Western blotting两种方式的检测结果一致。 丁守怡等31采纳WCX2芯片及SELDITOFMS技术对体外培育肝细胞株HepG2和转染乙肝病毒的细胞株进行蛋白质指纹图谱检测分析，研究结果WCX2共捕捉91个蛋白，其中不同表达蛋白共19个，有9个蛋白在

13、HepG2细胞株中表达量升高，有10个蛋白在HepG2细胞株中表达量降低。并鉴定分子量为11081 Da的蛋白为钙结合蛋白S100A10。 从目前报导来看，肝病标志物的研究还只是进行到潜在标志物的定性和表达研究这一层次，尚没有从蛋白功能的角度分析潜在标志物与肝病发生、恶化等环节间的彼此联系，而全面了解这些彼此联系正是疾病标志物应用于临床的前提。 3 小结 SELDITOFMS慢慢应用于肝癌标志物的研究中，其快速、高通量、准确的特点已经被普遍的认同。随着这项技术慢慢推向临床，也发觉这项技术尚待完善，如不同蛋白的在线鉴定问题；如图谱中的峰高和蛋白质浓度之间的关系并非都是线性的；不同的研究者，由于检

14、测进程中诸多因素的操纵不一，对同种疾病取得的具有区分作用的峰是有不同的。因此SELDITOFMS要全面应用于临床研究，还需要在标准化、定性等问题上深切研究，在尔后的实践进程中还有很多的问题需要解决，但SELDITOFMS技术必将成为快速诊断、发觉并鉴定肿瘤标志物的有效手腕。 参考文献 1 Hanash ,2003,422(6928):226-232. 2 Binz PA,Hochstrasser DF,Appel spectrometrybased proteomics:current status and potential use in clinical Chem ,2003,41(12)

15、:1540-1551. 3 Poon TC,Johnson analysis and its impact on the discovery of serological tumor Chim Acta，2001,313(1-2):231-239. 4 Parent R,Beretta in the study of liver Hepatol，2005,43(1):177-183. 5 刘坤，姜颖，贺福初.肝病蛋白质组学研究进展.中华查验医学杂志， 2005，28(5)：549-551. 6 Yasuhiro Kuramitsu,Kazuyuki progress in proteomics

16、 study of hepatitis C virusrelated human hepatocellular Review of Proteomics,2005,2(4):589-601. 7 Zheng J,Gao X,Beretta L,et human liver proteome project (HLPP) workshop during the 4th HUPO world ，2006,6(6):1716-1718. 8 Yip TT,Lomas protein chip array in oncoproteomic Cancer Res Treat,2002,1(4):273-

17、280. 9 Wright GL proteinchip MS:a platform for biomarker discovery and cancer Rev Mol Diagn,2002,2(6):549-563. 10 Seibert V,Ebert MP,Buschmann in clinical cancer proteomics:SELDIToFmass spectrometry and biomarker Funct Genomic Proteomic,2005,4(1):16-26. 11 Wiesner of tumor markers with protein chip

18、Pharm Biotechnol,2004,5(1):45-67. 12 Merchant M,Weinberger advancements in surfaceenhanced laser desorption/ionizationtime of flightmass ,2000,21(6):1164-1177. 13 Weinberger SR,Morris TS,Pawlak trends in protein biochip ,2000,1(4):395-416. 14 Tang N,Tornatore P,Weinberger developments in SELDI affin

19、ity Spectrom Rev,2004,23(1):34-44. 15 Wright GL,Cazares LH,Leung SM,et mass spectrometry:a novel protein biochip technology for detection of biomarker in complex protein Cancer and Prostatic Disease,1999,2 (5):264-276. 16 Vlahou A,Schellhammer PF,Mendrincs S,et of a novel proteomic approach for the

20、detection of transitional cell carcinoma of the bladder in J Pathol,2001,158 (4):1491-1502. 17 Merchant M,Weinberger advancements in surfaceenhanced laser desorption ionization time of flight mass ,2000,21(6):1164-1177. 18 Melle C,Kaufmann R,Hommann M,et profiling in microdissected hepatocellular ca

21、rcinoma tissue using ProteinChip J Oncol,2004,24(4):885-891. 19 郑燕华,邹德威,冯凯,等.蛋白芯片技术挑选肝癌血清标志蛋白的初步研究.中华查验医学杂志,2005,28 (16):628-631. 20 Poon TC,Yip TT,Chan AT,et proteomic profiling identifies serum proteomic signatures for detection of hepatocellular carcinoma and its Chem,2003,49:752-760. 21 黄成，樊嘉，周俭

22、，等.肝细胞癌门静脉癌栓形成相关的血清蛋白质分子标记物研究.中华医学杂志,2005,85(111):781-785. 22 黄成，樊嘉，周俭，等.转移与无转移肝细胞癌患者血清蛋白质指纹图谱的比较.中华实验外科杂志,2005,22(5):550-553. 23 黄成，樊嘉，周俭，等.不同临床病理因素对肝细胞癌患者血清蛋白质指纹图谱的阻碍.中华外科杂志，2006，44(7)：445-449. 24 Ward DG,Cheng Y,NKontchou G,et in the serum proteome associated with the development of hepatocellula

23、r carcinoma in hepatitis Crelated J Cancer,2006,94(2):287-292. 25 王家祥，张波，余捷凯，等.基于人工神经网络的血清蛋白质指纹图谱模型在肝癌诊断中的应用.中华医学杂志，2005，85(3)：189-192. 26 Wang JX,Zhang B,Yu JK,et of serum protein fingerprinting coupled with artificial neural network model in diagnosis of hepatocellular Med J，2005,118(15):1278-1284

24、. 27 Schwegler EE,Cazares L,Steel LF,et MS profiling of serum for detection of the progression of chronic hepatitis C to hepatocellular ,2005,41(3):634-642. 28 Zhu XD,Zhang WH,Li CL,et serum biomarkers for detection of HBVinduced liver cirrhosis using SELDI protein chip J Gastroenterol,2004,10(16):2

25、327-2329. 29 Paradis V,Degos F,Dargere D,et of a new marker of hepatocellular carcinoma by serum protein profiling of patients with chronic liver ,2005,41(1):40-48. 30 Lee IN,Chen CH,Sheu JC,et of complement C3a as a candidate biomarker in human chronic hepatitis C and HCVrelated hepatocellular carcinoma using a proteomics ,2006,6(9):2865-2873. 31 丁守怡，钱东萌，闫志勇，等.蛋白质芯片飞行质谱技术检测体外培育的肝癌细胞株与转染HBV的肝癌细胞株蛋白质的不同表达.世界华人消化杂志，2005，13(14):1684-1687.